lekciya_10_radiobiologiya_kletki

Лекция № 10
Радиобиология клетки
Радиочувствительность основных компонентов клетки. Радиационное
поражение нуклеиновых кислот в живой клетке. Радиочувствительность
надмолекулярных структур ДНК. Нарушение структуры и функции мембранных
образований
клетки.
Радиочувствительность
мембран
клетки:
радиочувствствительные участки в цитоплазматической мембране. Роль изменений
мембран клетки в развитии радиобиологического эффекта. Порочный круг
клеточной
патологии.
Пострадиационное
восстановление.
Репарация
поврежденных структур, типы репарации. Механизмы пострадиационного
восстановления клеток.
В результате облучения, повреждающего абсолютно все внутриклеточные
структуры, в клетке можно зарегистрировать множество самых разнообразных
реакций – задержку деления, угнетение синтеза ДНК, повреждение мембран и др.
Степень выраженности этих реакций зависит от того, на какой стадии жизненного
цикла клетки произведено облучение.
Синтез ДНК в клетке происходит в интерфазе, занимая в ней определенный
промежуток времени. Это позволило разделить интерфазу на три периода – период
синтеза ДНК (S-период), пред- и постсинтетические периоды (соответственно G1
и G2) (От англ. Gap – интервал.) Митоз, четвертый период цикла, обозначается
буквой М. Продолжительность жизненного, или митотического, цикла – время
между двумя последовательными делениями клетки – слагается из отдельных
стадий, длительность которых в разных тканях варьирует относительно друг друга
по величине, располагаясь, как правило, следующим образом: М < G2 <S < G1.
М – митоз, G1 – предсинтетическнй период, S – период синтеза ДНК, G2 –
постсинтетический период. G0 – фаза покоя (клетка может переходить в нее либо
после завершения синтеза ДНК, либо по окончании митоза; в фазе покоя клетка
находится до тех пор, пока некоторый стимул не побудит ее снова вступить в цикл
соответственно в G2 - или G1 -периоды)
В активно обновляющихся тканях (эпителий ворсинок кишечника, костный
мозг, кожа и др.), а также в быстрорастущих опухолях и клеточных культурах
продолжительность цикла составляет от 10 до 48 ч. Наиболее продолжительны
1
периоды G1 и S, а самый кратковременный период – митоз – завершается в
большинстве случаев в течение 30–60 мин.
В малообновляющихся тканях большинство клеток находится в G1-периоде,
длительность которого измеряется неделями, а иногда месяцами и даже годами
(например, в ЦНС), что в последнее время обусловило выделение еще одной
стадии – G0; клетки, находящиеся на этой стадии, принято считать вне цикла, или
покоящимися. Такие клетки составляют резерв репопуляции в случае гибели части
клеточного пула от различных причин. Таков, например, механизм
посттравматической регенерации тканей или возобновления роста опухоли после
ее облучения.
Многие из лучевых реакций клетки легко переносятся клеткой, так как
являются следствием повреждения множественных структур, утрата которых очень
быстро восполняется или просто остается незамеченной. Такие преходящие
клеточные реакции называют физиологическими или кумулятивными эффектами
облучения. К ним относятся различные нарушения метаболизма, в том числе
ингибирование нуклеинового обмена или окислительного фосфорилирования,
слипание хромосом и др.
Как правило, подобные реакции проявляются в ближайшие сроки после
облучения и с течением времени исчезают. Наиболее универсальная из них –
временная задержка (угнетение) клеточного деления, часто называемая в
литературе радиационным блокированием митозов. Снижение числа делящихся
клеток после облучения было замечено уже вскоре после открытия рентгеновских
лучей, что и послужило одним из оснований к применению этих лучей для
подавления опухолевого роста. Эта реакция к настоящему времени наиболее
хорошо изучена в количественном отношении на самых разнообразных объектах в
экспериментах in vivo и in vitro для большого числа нормальных клеток и тканей, а
также для опухолей человека и животных.
Проведенные эксперименты показали, что длительность задержки деления
зависит от дозы ионизирующего облучения и проявляется у всех клеток
облученной популяции, независимо от дальнейшей судьбы той или иной клетки –
выживет она или погибнет. Однако продолжительность этого эффекта различна у
разных объектов. Во всех случаях после облучения деление клеток дрожжей
прекращалось и возобновлялось спустя некоторое время, различное у разных
объектов, но всегда растущее с дозой облучения.
Многочисленные исследования показали, что для большинства изученных
культур клеток задержка деления соответствует примерно 1 ч на каждый 1 Гр.
Следовательно, эта реакция на облучение идентична у всех особей однородной
популяции не только качественно, но и по величине, причем с увеличением дозы
возрастает не доля реагирующих особей, а продолжительность задержки деления
каждой облученной клетки. В этом состоит принципиальное отличие такого рода
клеточных эффектов облучения от летальных поражений.
Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о роли
радиационного повреждения ядра (большей, чем цитоплазмы) в механизме
угнетения клеточного деления; в то же время установлено, что оно не связано с
повреждением хромосом.
Можно рассматривать задержку деления как проявление неспецифического
компонента реакции клеток на облучение (тем более что она наблюдается в ответ
на действие многих внешних факторов), имеющее защитно-приспособительный
характер.
2
Суждение о защитном характере задержки митозов основано на том, что
продолжительность задержки отражает меру восстановления клеток от вызванных
излучением поражений, например, путем разрушения гипотетических токсинов или
ресинтеза метаболитов, необходимых для деления. В этом случае следовало бы
ожидать, что чем больше времени есть у клетки для восстановления, тем вероятнее,
что она успешно разделится и даст жизнеспособное потомство. Однако прямые
наблюдения показали, что степень задержки митозов одинакова как для гибнущих,
так и для сохранивших жизнеспособность клеток. Отсутствие связи между
задержкой деления и гибелью клетки подтверждается и данными о разной
величине ОБЭ для этих феноменов и разнонаправленным изменением
радиочувствительности и задержки деления по стадиям цикла.
До сих пор нет достаточных данных для того, чтобы однозначно отнести
задержку деления к проявлениям радиационного повреждения множественных
внутриклеточных структур или оценить ее как защитную реакцию клеток на их
повреждение;
Все сказанное относится к временной задержке первого пострадиационного
деления, наблюдаемой после облучения в определенном, хотя и достаточно
большом диапазоне доз (для большинства клеток млекопитающих в пределах 10
Гр). Еще менее изучен механизм задержки деления при повторных облучениях, а
потому и более затруднена интерпретация.
Описываемую реакцию задержки деления следует отличать от полного
подавления митоза, наступающего после воздействия больших доз, когда клетка
значительное время продолжает жизнь, но необратимо утрачивает способность к
делению. В результате такой необратимой реакции на облучение часто образуются
патологические формы гигантских клеток, иногда даже содержащие несколько
наборов хромосом вследствие их редупликации в пределах одной и той же
неразделившейся клетки (эндомитоз).
Среди многих проявлений действия излучения на жизнедеятельность клетки
подавление способности к делению является наиболее важным. В связи с этим под
клеточной гибелью, или летальным эффектом облучения, в радиобиологии
понимают утрату клеткой способности к пролиферации. Наоборот, выжившими
клетками считают те, которые сохранили способность к неограниченному
размножению, т. е. к клонообразованию. Таким образом, речь идет здесь о
репродуктивной гибели клеток. Репродуктивная форма лучевой инактивации
клеток наиболее распространена в природе, Она же и лучше изучена методами
количественной радиобиологии в связи с тем, что ее можно наблюдать при
культивировании клеток вне организма.
Другая разновидность репродуктивной гибели потомков облученных клеток –
формирование так называемых гигантских клеток возникающих в результате
слияния двух соседних, чаще «сестринских» клеток. Такие клетки способны не
более чем к 2–3 делениям, после чего они погибают. Гигантские клетки могут
возникнуть без слияния при длительной задержке истинного деления (эндомитоз)
облученных клеток или их потомков. Такие клетки также нежизнеспособны.
Основной причиной репродуктивной гибели клеток являются структурные
повреждения ДНК, возникающие под влиянием облучения. Они легко
обнаруживаются, в частности, цитологическими методами в виде так называемых
хромосомных перестроек или аберраций хромосом. При этом разорванные
хромосомы могут соединяться неправильно, а очень часто отдельные фрагменты
их просто теряются при делении. Возникающие хромосомные перестройки весьма
3
разнообразны. Отметим лишь основные виды аберраций: фрагментация хромосом,
формирование хромосомных мостов, дицентриков, кольцевых хромосом,
появление внутри- и межхромосомных обменов и т.п. Часть аберраций, как,
например, мосты, механически препятствует делению клетки; появление обменов и
ацентрических фрагментов приводит к неравномерному разделению хромосом и
утрате генетического материала, вызывающей гибель клетки из-за нехватки
метаболитов, синтез которых кодировался ДНК утраченной части хромосомы.
Долю клеток с хромосомными перестройками часто используют в качестве
количественного показателя радиочувствительности, так как, с одной стороны,
число таких перестроек четко зависит от дозы облучения, а с другой – они, отражая
летальное действие излучений, хорошо коррелируют с выживаемостью клеток.
Итак, рассмотренные виды лучевой инактивации клеток, наступающей после
первого пострадиационного митоза и ведущей к прекращению клонобразования,
называют репродуктивной или митотической формой гибели.
Другая форма радиационной инактивации клеток – интерфазная гибель –
наступает до вступления клетки в митоз. При очень больших дозах облучения это
происходит непосредственно «под лучом» или вскоре после облучения. В
диапазоне умеренных доз (до 10 Гр) гибель наступает в первые часы после
облучения и может быть зарегистрирована в виде различных дегенеративных
изменений клетки; чаще всего под микроскопом через 2–6 ч можно наблюдать
клетки с резким пиктозом ядра и фрагментацией хроматина.
Для размножающихся клеток в культуре ткани, а также для большинства клеток
соматических тканей взрослых животных и человека интерфазная гибель
регистрируется только после облучения при дозах в десятки и сотни грей. При
меньших дозах наблюдается репродуктивная форма гибели, причиной которой, как
упоминалось, в большинстве случаев являются структурные хромосомные
повреждения.
Количественный метод определения выживаемости клеток, млекопитающих
после облучения впервые был разработан в 1956 г. Т. Паком и П. Маркусом для
культуры клеток HeLa.
Клетки снимают со стенок культурального сосуда раствором трипсина или
версена, пипетируют до получения взвеси из строго одиночных клеток и
рассеивают по чашкам Петри так, чтобы в каждую чашку попало заданное
количество клеток. На каждую дозу облучения и контроль берут по 5–8 чашек.
После посева чашки с клетками облучают при нескольких дозах вплоть до 10–20
Гр и выращивают в термостате 7–14 дней до получения видимых невооруженным
глазом колоний, содержащих не менее 50 клеток. Следовательно, облученная, но
сохранившая жизнеспособность клетка и ее потомки должны совершить не менее
шести последовательных делений. Выживаемость клеток при каждой дозе
облучения определяют как отношение числа колоний, выросших в облученных
чашках, к числу колоний, выросших в контроле.
4
Техника клонирования клеток для определения их выживаемости после
облучения (по методу Т. Пака, Р. Маркуса):
I – в две серии чашек Петри высевают одинаковое число клеток; II – опытные
чашки облучают, контрольные – нет; III – через 10–14 дней выжившие клетки
делятся и образуют видимые колонии (клоны)
Полученная по такому методу кривая выживания растущих в культуре клеток
опухоли Эрлиха (линии EL.D).
5
В настоящее время радиобиологи имеют возможность в эксперименте
количественно оценивать радиочувствительность многих тканей и опухолей,
сравнивая кривые выживания клеток после облучения (в том числе in vivo).
Кривые выживания самых различных клеток при действии рентгеновского,
гамма- или любого другого редко ионизирующего излучения имеют форму,
аналогичную приведенной на рис.
Кривые выживания клеток (кривые доза–эффект) при действии плотно
ионизирующего излучения. А – линейные координаты; Б – полулогарифмические
координаты: пунктиром обозначена 37%-ная выживаемость
В системе полулогарифмических координат (дозу облучения откладывают по
шкале абсцисс в нелинейном масштабе, а выживаемость на оси ординат в
логарифмическом) кривая состоит из так называемого плеча и линейного участка,
начинающегося обычно после доз 3–5 Гр.
Такая зависимость хорошо описывается уравнением вида
где N – число выживших клеток из общего их числа, D – любая доза облучения,
D0 – доза, при которой доля живых клеток уменьшается в сравнении с исходной в е
раз: N/N0 = е-1 = 1/2,71 = 0,367. Таким образом, при дозе облучения, равной D0,
выживает ~37%, а погибает ~63 % клеток.
Величина D0 служит мерой радиочувствительности клеток и определяется по
кривой выживания как доза, при которой выживает ~37 % клеток от исходного
количества. Иногда поэтому ее называют D37, что в случае экспоненциальных
кривых одно и то же, но для кривых, имеющих плечо, величины D0 и D37,
различны.
Летальные реакции клеток имеют специфическую особенность, отличающую их
от рассмотренных выше обратимых преходящих клеточных эффектов.
6
Эта особенность состоит в том, что с увеличением дозы облучения
увеличивается не только (и даже не столько) степень поражения всех облученных
клеток, как это имеет место, например, в отношении задержки деления, сколько
доля пораженных, т. е. погибших клеток. Иными словами, с одной стороны, даже
при самых малых дозах может быть зарегистрирован экстремальный эффект –
гибель клетки (разумеется, с малой вероятностью), с другой – и при очень больших
дозах (опять же с малой вероятностью) могут сохраниться отдельные
жизнеспособные клетки.
Одним из часто используемых количественных методов оценки летального
поражения пролиферирующих клеток служит подсчет числа клеток с аберрациями
хромосом.
Согласно данным метафазного анализа существует полный параллелизм в
изменении выживаемости клеток и долей безаберрантных клеток при облучении
клеточной культуры, синхронизированной на отдельных периодах интерфазы, а
также в условиях защиты или сенсибилизации.
Схема опытов Б. Л. Астаурова.
7
Прямые доказательства большей радиочувствительности ядра по сравнению с
цитоплазмой были получены в опытах с прицельным облучением ядра на объектах,
в клетках которых оно строго фиксировано. Оказалось, например, что попадание
уже одной α-частицы в ядро оплодотворенного яйца насекомого (наездника)
вызывает гибель зародыша, которая в случае облучения цитоплазмы яйца
регистрируется лишь после прохождения 15 млн. α-частиц.
Особый интерес представляют также эксперименты, в которых с помощью
микропучка протонов (90% частиц находилось в поле диаметром 5 мкм) было
показано, что структурные повреждения хромосом в клетках наступают уже после
непосредственного их облучения 15–20 протонами, в то время как при облучении
различных участков цитоплазмы сотнями тысяч частиц его влияния не
обнаружено.
Приведенные примеры наглядно демонстрируют значительно большую
радиочувствительность ядра по сравнению с цитоплазмой, однако они не
отвергают роль последней в радиационном поражении ядерного аппарата. Более
того, существует достаточно много экспериментальных данных о зависимости
проявления и размера ядерных нарушений от степени облучения цитоплазмы, что
является следствием сложных и пока малоизученных ядерно-цитоплазматических
отношений. Важно, что для разных объектов удельный вес прямого поражения
ядра и опосредованных влияний может сильно различаться, отражая особенности
жизнедеятельности целых клеток и функционирования их основных органелл.
Итак, подводя итог современному состоянию этого вопроса, следует
подтвердить правильность точки зрения о решающей роли поражения ядра как
первопричины лучевой гибели клетки и его несравненно большей по сравнению с
цитоплазмой радиочувствительности. Однако в реализации летального клеточного
эффекта несомненна и роль цитоплазмы, которая выражена неодинаково у разных
объектов и зависит от их функционального состояния и внешних условий.
Какие же внутриядерные структуры ответственны за жизнеспособность клетки?
Естественно, что при этом важны события и поражения, возникающие и
определяемые при дозах до 10 Гр, существенных для гибели млекопитающих, ибо
в принципе не существует структур, не поражаемых при облучении: все зависит от
использованной дозы.
В клетке содержится несколько десятков молекул ДНК, имеющих очень
большую длину. (У млекопитающих на клетку приходится 3·109–6·109 пар
нуклеотидов, общая длина молекул ДНК при этом составляет от 1 до 2 м.). ДНК
постоянно связана с белками, которые участвуют в поддержании структуры
интерфазного хроматина, формировании хромосом и переносе генетической
информации.
Облучение вызывает различные повреждения ДНК и ее комплексов. К их числу
относят разрывы молекулы ДНК, образование щелочно-лабильных связей, потерю
оснований и изменения их состава, изменения нуклеотидных последовательностей,
сшивки ДНК–ДНК и ДНК–белок, нарушения комплексов ДНК с другими
молекулами.
Различают одиночные разрывы, когда связь между отдельными атомными
группировками нарушается в одной из нитей двунитчатой молекулы ДНК, и
двойные, когда разрыв происходит сразу в близких участках двух цепей, что
приводит к распаду молекулы. При любом разрыве нарушаются считывание
информации с молекулы ДНК и пространственная структура хроматина.
8
Одиночные разрывы не приводят к поломкам молекулы ДНК, так как
разорванная нить прочно удерживается на месте водородными, гидрофобными и
другими видами взаимодействий с противоположной нитью ДНК и, кроме того,
структура довольно хорошо восстанавливается мощной системой репарации.
Многие авторы поэтому склонны думать, что одиночные разрывы сами по себе
(если они не переходят в двойные) не являются причиной гибели клеток.
При дозах до 20 Гр двойные разрывы являются следствием одновременного
повреждения обеих нитей ДНК. С увеличением дозы облучения возрастает
вероятность перехода одиночных разрывов в двойные, так как увеличивается
возможность того, что независимые разрывы в противоположных цепях возникают
друг против друга. При действии излучений с небольшой плотностью ионизации
(γ- и рентгеновское излучение, быстрые электроны), 20–100 одиночных разрывов
вызывают один двойной.
Плотно ионизирующие излучения вызывают значительно большее число
двойных разрывов. Такие виды лучевого поражения макромолекул удается
регистрировать непосредственно после облучения в виде аберраций хромосом.
Расчеты показывают, что уже при дозе 1 Гр в каждой клетке человека
повреждается 5000 оснований молекул ДНК, возникает 1000 одиночных и 10 – 100
двойных разрывов, каждый из которых может стать причиной возникновения
аберрации.
Исходя из этих представлений, выживаемость клеток во многих случаях может
быть описана с помощью, так называемой линейно-квадратичной модели Чедвика и
Линхаутса. Разрабатывая модель, авторы исходили из того, что при облучении
клеток летальными являются двойные разрывы ДНК, которые появляются либо в
результате односменного разрыва обеих спиралей ДНК одной ионизирующей
частицей, либо в результате совпадений двух независимо образовавшихся
одиночных разрывов комплементарных спиралей, оказавшихся напротив друг
друга.
Кроме образования разрывов в облученной ДНК нарушается структура
оснований, прежде всего тимина, что увеличивает число генных мутаций.
Отмечается образование сшивок между ДНК и белком нуклеопротеинового
комплекса.
Разработанные к настоящему времени методы позволяют в ряде случаев
обнаружить радиационные нарушения в структуре интерфазного хроматина уже
при облучении клетки дозой в несколько грей.
В последние годы интенсивно исследуется ДНК-мембранный комплекс –
сложное структурное образование в области соединения нитей ДНК с ядерной
мембраной, в состав которого помимо ДНК входят белок и липиды.
9
Основные виды структурных радиационных повреждений:
1 – однонитчатые (одиночные) разрывы в молекуле ДНК, 2 – двунитчатые
(двойные) разрывы ДНК, 3 – нарушение связи ДНК с белком, 4 – повреждение
структуры ДНК мембранного комплекса, 5 – разрушение ядерной мембраны, 6 –
повреждение мнтохондриальной мембраны
Как показывают данные М. Элкинда и соавторов (1972), распад комплекса и
деградацию молекул ДНК можно зафиксировать после облучения клеток
китайского хомячка при дозе всего 2 Гр .
Помимо структурных нарушений ДНК в облученной клетке наблюдается
нарушение регуляции, прежде всего выдачи в цитоплазму информации от ДНК, а
также нарушение функционирования многочисленных внутриклеточных мембран.
В этом проявляется роль внеядерных органелл, а также сложных
взаимоопределяющих влияний ядра и цитоплазмы.
Многие сложные процессы клеточного метаболизма протекают именно на
мембранах, так как последние позволяют обеспечить нужное пространственное
разделение реагирующих молекул. Не удивительно, что радиочувствительными
оказываются именно те биохимические процессы, для которых необходима
пространственная организация участвующих групп ферментов. Снижение
энергетического обмена клетки, вызванное поражением митохондрий, в отдельных
случаях удается наблюдать после облучения в дозах, равных нескольким Греям.
Кроме того, нарушение целостности мембран может приводить к сдвигу ионного
баланса клетки из-за выравнивания концентраций калия и натрия (в норме клетка
накачивает внутрь калий и высвобождает в окружающую среду натрий), что также
неблагоприятно отражается на ходе метаболических процессов.
Наконец, важным последствием облучения является изменение эпигеномной (не
связанной с ядерным материалом) наследственности клетки, носителем которой
служат различные цитоплазматические органеллы. При этом снижается
функциональная активность потомков облученных клеток, в чем может состоять
одна из причин отдаленных последствий облучения. Однако главной причиной
репродуктивной формы гибели клеток при облучении является повреждение ее
генетического аппарата.
10
Многие радиационные повреждения репарируются.
Феномен пострадиационного восстановления обусловлен тем, что при
облучении в клетках, среди прочих, возникают и такие повреждения, которые
обычно приводят клетку к гибели, но при определенных условиях могут быть
устранены системами ферментативной репарации. Такие повреждения принято
называть потенциальными. Их дальнейшая судьба после возникновения двоякая:
либо они репарируются, и тогда клетка выживает, либо реализуются, и тогда она
гибнет.
Термин потенциальное повреждение – чисто формальное, феноменологическое
понятие, так как не определяет какое-либо конкретное молекулярное повреждение,
а потому может применяться к любому виду радиационных поражений. В
отношении репродуктивной гибели клеток наиболее изучены два вида
потенциальных повреждений – сублетальные и потенциально летальные,
различающиеся по способу их выявления.
Сублетальные повреждения выявляют методом фракционированного
облучения, а потенциально летальные – по изменению выживаемости клеток под
влиянием изменения условий, в которых они находятся в первые часы после
облучения. Например, не исключено, что часть двойных разрывов ДНК,
образовавшихся при облучении клеток в предсинтетический период, может быть
восстановлена за время, оставшееся до репликации ДНК, а те из них, что клетка не
успела «залечить» до момента синтеза ДНК, становятся летальными и вызывают ее
гибель, образуя аберрации хромосом. Очевидно, что эффективность репарации, т.е.
долю выживших клеток, можно увеличить, если искусственно удлинить период G1.
Влияние условий пострадиационного культивирования на последующую судьбу
клеток показано многими авторами на различных объектах и в разные годы. Ф.
Шерман и Г. Чейз еще в 1949 г. обнаружили увеличение выживаемости
облученных дрожжей в том случае, если помещать их на питательную среду не
сразу после облучения, а выдержав некоторое время в буферном растворе.
Только в 1959 г. В. И. Корогодину в четко поставленном эксперименте удалось
воспроизвести тот же феномен, а главное, правильно объяснить его, доказав
реальность существования истинного пострадиационного восстановления, что
было зарегистрировано в качестве открытия.
Соответствующие опыты столь изящны по своей простоте и убедительности,
что могут служить примером экспериментального мастерства.
После γ-облучения дрожжей в дозе 1,2 кГр суспензию клеток разводили 1:10000
и делили на две части. Из одной производили посев на питательную среду в чашки
Петри сразу после облучения и оценивали выживаемость, подсчитывая колонии
через 96 ч инкубации при температуре 30˚ С. Другую половину суспензии
выдерживали после облучения в течение 48 ч в голодной среде при той же
температуре, а затем рассеивали по чашкам. Оказалось, что в первом случае
выживало лишь около 0,2 % облученных клеток, во втором – выживаемость
наблюдалась почти у 40 %, причем во всех изученных пробах.
Влияние условий пострадиационного культивирования клеток млекопитающих
на их последующую судьбу продемонстрировано С. Н. Александровым (1959) на
клетках рака молочной железы, выращиваемых в разных температурных условиях,
а позднее И. М. Пархоменко (1963), которая помещала облученные клетки в
фосфатный буфер или ингибировала синтез белка.
Во всех этих примерах речь идет о длительно (в течение нескольких часов)
протекающих процессах – медленное восстановление. Hapяду с ними в клетке
11
возникает и другой тип потенциально летальных повреждений, которые
реализуются в летальные в течение нескольких минут после облучения. Как
показали опыты У. Деви (1972), реализация такого типа поражений в клетках
китайского хомячка происходит в условиях нормального метаболизма; снижение
температуры среды до 20°С во время или сразу после облучения затормаживает
процессы реализации, но не влияет на одновременно идущие восстановительные
реакции, в результате чего поражение клеток уменьшается.
Придавая большое научное и принципиальное значение рассмотренному
феномену репарации потенциально летальных повреждений дрожжевых клеток,
где он так сильно выражен, следует иметь в виду, что вклад такого типа репарации
в повышение выживаемости клеток млекопитающих оказывается несоизмеримо
меньшим. В экспериментах in vitro показано, что выживаемость многих видов
клеток млекопитающих за счет восстановления от потенциально летальных
повреждений может быть повышена не более чем в 2–3 раза (в зависимости от
дозы).
Основные типы репарации.
По времени осуществления различают дорепликативную, пострепликативную и
репликативную репарации.
Дорепликативная репарация (до этапа удвоения ДНК) может происходить
путем воссоединения разрывов, а также с помощью удаления (эксцизии)
поврежденных оснований. В воссоединении одиночных разрывов участвует
несколько ферментов. В простейшем случае разрывы могут быть воссоединены
лигазой. В других ситуациях требуется полная ферментативная система репарации,
включающая специфические эндонуклеазы, экзонуклеазы, ДНК-полимеразу, ДНКлигазу, а также вспомогательные ферменты, обеспечивающие подготовку концов
ДНК для заключительного акта репарации – лигазного воссоединения.
Исследованиями, проведенными на бактериальной ДНК, выявлены три типа
репарации одиночных разрывов – сверхбыстрая, быстрая и медленная.
Сверхбыстрая завершается в течение 1–2 мин и обеспечивается одной ДНКлигазой. Быстрая репарация, осуществляемая с помощью ДНК-полимеразы1,
воссоединяет 90% разрывов, остающихся после сверхбыстрой репарации.
Наряду с разрывами ДНК после облучения возникают множественные
повреждения оснований, последние ликвидируются системой эксцизионной
репарации, проходящей с помощью репаративного синтеза, который представляет
собой многоэтапный процесс типа выщепление – замещение. В начале
повреждение узнается специфической γ-эндонуклеазой, после чего происходит
выщепление (инцизия) поврежденного участка вблизи измененного основания,
затем – экзонуклеотическая деградация поврежденной цепи с захватом смежных
неповрежденных нуклеотидов и, наконец, – репаративный синтез в области
образовавшегося дефекта при участии ДНК-полимеразы1 и полинуклеотидлигазы
комплементарного участка неповрежденной цепи ДНК в качестве матрицы
(шаблона).
Пострепликативная репарация постулируется на основании того факта, что
некоторые клетки млекопитающих выживают при большой дозе облучения,
несмотря на пониженную способность к удалению пиримидиновых димеров.
Механизм этого вида репарации точно не изучен, предполагают разные варианты
синтеза ДНК на поврежденной матрице.
12
Репликативная репарация – восстановление ДНК в процессе ее репликации.
Этот тип репарации осуществляется удалением в ходе репликации повреждений в
зоне точки роста цепи либо продолжающейся элонгацией в обход повреждений.
Поскольку пострадиационная репарация – процесс ферментативный, ее
интенсивность, а, следовательно, и судьба облученной клетки зависят от общего
уровня клеточного метаболизма.
Для работы ферментов репарации требуется энергия. Если образование АТФ
подавить, например, фторидом натрия, то скорость восстановления снижается. При
небольшом уменьшении общей скорости метаболизма, например, понижением
температуры до комнатной, эффективность восстановления не меняется. При
снижении температуры до 20°С наблюдается временная задержка в
восстановлении некоторых клеток. Интенсивность восстановления значительно
снижается при 8˚С, а при 2 – 5°С – приостанавливается.
Ферментативная природа репарации определила и применение для ее изучения
ингибиторов различных синтетических процессов. Однако при анализе их действия
на молекулярном и клеточном уровнях получены весьма противоречивые
результаты, что в основном определяется множеством метаболических процессов,
обусловливающих репарацию особенно в клетках высших организмов.
Несмотря на многообразие репарационных процессов, весьма вероятно, что
природа сублетальных и летальных повреждений одинакова. Согласно точке
зрения М. Элкинда репарация в клетке начинается сразу после облучения, причем
если повреждения не слишком тяжелы, то некоторые из них клетка может
отрепарировать и, таким образом, сохранить жизнеспособность в смысле
неограниченного размножения. Тяжелые же, множественные повреждения
полностью отрепарировать клетке не удается. Если 2-е облучение отстоит во
времени от 1-го, то таких тяжелых повреждений возникает меньше, ибо
повреждения от 2-го облучения образуются в клетках, частично уже
восстановившихся после 1-го облучения. В результате общее число повреждений
оказывается меньшим, чем при эквивалентной дозе однократного облучения, и
соответственно большим будет число выживших клеток. Следовательно, клетка,
которая выживет после однократного облучения за счет репарации от
потенциально летальных повреждений, вновь приобретает способность
накапливать сублетальные повреждения, т.е. ее радиочувствительность становится
такой же, как и у необлученной клетки.
13