Газовая хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография Хроматография, 1903 Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна. Элюент (самотек) Колонка (AL2O3, 50-100 мкм) Разделение пробы на компоненты (до нескольких часов и даже дней!) Детектор? М.С. Цвет (1872-1919) г • У Сократить путь внешней и внутренней диффузии Уменьшение диаметра зерен Увеличить скорость разделения? Большое входное давление Применение насосов высокого давления Уменьшение диаметра и увеличение длины колонок Высокоэффективная жидкостная хроматография 1968б DuPont Задачи ВЭЖХ: как можно более полно разделить вещества за как можно меньшее время Устройство аппаратуры ВЭЖХ Дегазация элюента растворённые в элюенте газы могут вызвать нарушения в работе системы выделяются в виде пузырьков, которые, накапливаясь в детекторе, вызывают усиленный дрейф нулевой линии крупные пузырьки могут скапливаться в обратных клапанах, из-за чего может меняться произвольным образом расход и нарушаться градиентный режим •Кипячение •Ультразвуковая баня •Вакуумирование •Бок дегазации (пористый фильтр с вакуумом) •Фильтр с вытяжкой Насыщающая колонка При необходимости использовать агрессивных элюентов • содержит материал, сходный с аналитической колонкой • размер зерна больше и имеет более широкое распределение • высокая пористость • легко заменяемый вручную материал • подвижная фаза растворяет набивку предколонки. Это – колонка, которой жертвуют, чтобы насытить подвижную фазу растворённым материалом набивки Инжектор устройство ввода пробы • Ручной инжектор включает петлю-дозатор и приёмник для иглы шприца. Проба вводится в инжектор с помощью шприца-пробоотборника. • В автоматических устройствах подготовки и ввода пробы (и в автоматических инжекторах) роль петли играет сама игла. Предколонка • Еще одна защита колонки от примесей из проб или прибора • заполненная тем же по размеру и составу материалом, что и аналитическая • малая длина: от 10 мм до 30 мм – и внутренний диаметр –от 2 мм до 4 мм (чтобы не увеличивать «мертвый объем») Аналитическая колонка Набивка, сорбент, неподвижная фаза? Набивка+химическая модификация = неподвижная фаза фиттинг фритта 2.1 мм 1мм 4.6 мм Дискраспределитель фритта Детекторы • спектрофотометрический детектор ультрафиолетового (УФ) диапазона (поглощение, нм) • электрохимический (сила тока) • Рефрактометрический –универсальный (показатель преломления) • Флуориметрический (флуоресцентное излучение поглощенного света) • Детектор рассеяния ( различие давлений паров хроматографических растворителей, входящих в состав элюента, и анализируемых веществ) • Комбинирование с Масс-спекторметрией Типы ВЭЖХ (Виды фаз) Нормальная фаза Неоднородность поверхности силикагеля • • • • • Немодифицированные сорбенты: Al2O3, SiO2, графитированный углерод, ZrO2, гидроксилапатит [Ca10(PO4)6(OH)2] Модифицированные материалы (привитая фаза) Импрегнированные серебром (πорбитали!) Гликоли (жидкость-жидкость), быстро вымываются неполярные подвижные фазы (пентан, гексан, гептан, изооктан) Боятся воды! Модифицированные материалы (химически привитая фаза) • • • • С18 (октадецил) - обращенная С8 (октил) С4 (бутил) фенил Двойственность применения: неполярные растворители – прямая фаза Полярные растворители – обратная фаза Обращенная привитая фаза Алкил Алкил + бензольное кольцо • Фаза С18 используется в 80% лабораторий Нагрузка (8-12%) Энд-кэппинг (хлортриметилсилан) Вытравка металлов Ион-парная хроматография • Фаза: С18, С8 • Элюент: обычный + противоионы (ион-парный агент): для анализа анионогенных веществ используют соли тетраалкиламмония, а для катионогенных – алкилсульфонаты и алкилсульфаты. • Объекты: Ионы или легко ионизируемые вещества Ионообменная хроматография • соединений с малой молекулярной массой и большим зарядом. контроль содержания многочисленных анионов в питьевой воде (например, NO2–, NO3–, ); контроль за составом сточных вод на присутствие как катионов (Cu2+, Cr6+), и анионов(SO32–, CN-) Особенности материала колонки: Катионообменные материалы (катиониты) несут отрицательный заряд и используются для разделения веществ, содержащих катионы. Анионообменные материалы (аниониты) несут положительный заряд и используются для разделения веществ, содержащих анионы. Аффинная хроматография • • • • • • • ферменты и субстраты, антитела, сахара (1) загрузка пробы в колонку; (2) вымывание невзаимодействующего вещества из колонки; (3) отрыв анализируемого вещества от поверхности (конкурирующий лиганд или не вызывающий денатурации высвобождающий реагент) (4) повторное уравновешивание колонки. Хиральная хроматография Различие энергии взаимодействия между поверхностью с хиральной привитой фазой и каждого из энантиомеров определяемого вещества, взаимодействующего с ней L D Запах Запах цитрусов хвои -Колонки типа I (Пиркле): силикагель- «ножка» -хиральная привитая фаза высокой чистоты -Колонки типа II: целлюлоза и амилоза -Колонки типа III: циклодекстрины -Колонки типа IV: лигандообменная хроматография, разделению предшествует образование координационных соединений -Колонки типа V: силикагелевая основа, к которой привит альбумин, выделенный из сыворотки коровьей крови, либо α-1-кислотный гликопротеин Виды ВЭЖХ •Обращенно-фазная •Нормально-фазная •Ионная •Ион-парная •Ионообменная •Эксклюзионная •Гел ь-фильтрационная •Лигандообменная • Хиральная •Аффинная •Мицеллярная •Серебряная обрашенно-фазная •Жидко-жидкостная •Экстракционная •Донорно-акцепторная •Комплексообразующая •Инверсионная эксклюзионная •Нелинейная •Капиллярная •Микронасадочная • Многомерная •Перфузионная •Вытеснительная •Сверхбыстрая •Турбулентная •Непрерывная •Противоточная •Центрифужная •С движущимся слоем •Высокотемпературная •Мембранная •Иммунная •Гидрофобная Подготовка растворителя и пробы • Растворители качества ВЭЖХ: 0 сорт для УФдетектирования! Иначе: • Шумы на базовой линии • Дрейф базовой линии • Ухудшение разделения • Взаимодействие с веществами пробы • Порча сорбента колонки •Проба готовится в том же растворителе, что используется для элюирования •Проба не должна иметь механических примесей, недопустимо образование эмульсяя, только прозрачный раствор •Если проба не растворяется, добавляют растворитель, смешивающийся с элюентом, растворяющий пробу (необходимо сделать холостой ввод этой смеси растворителей) подвижная фаза или элюент? Способ Элюирования Изократический Преимущества: 1. Не требуется уравновешивание колонки после анализа. 2. Отсутствует дрейф нулевой линии, вызванный изменением состава элюента. 3. Можно применять любые детекторы. Градиентный Пеимущества: перед изократическим: 1. Ёмкость колонки выше, чем в изократическом. 2. Общая продолжительность элюирования меньше, чем в изократическом. 3. Удаётся получить более узкие пики, что улучшает условия детектирования Когда разделение считается достигнутым? Чем больше компонентов в смеси, тем требуется больше времени для разделения 0 2 3 10 60 мин время выхода анализируемого вещества больше, чем время выхода несорбируемого вещества, например пика растворителя, но достаточно мало с точки зрения практической осуществимости и эффективности анализа Основная характеристика пика на хроматограмме время удерживания 1. Структура (строение) молекул разделяемых веществ. 2. Состав растворителя, в котором растворена проба. 3. Объём пробы. 4. Физические характеристики и химизм поверхности материала набивки. 5. Размеры колонки (т.е. длина и внутренний диаметр). 6. Состав подвижной фазы. 7. Температура в системе. 8. Скорость потока подвижной фазы. 9. Внеколоночный объём в системе (в большинстве случаев – объём инжектора, соединительных трубопроводов и детектора). • Agilent Compact LC с колонкой 150*4.6 с неподвижной фазой Exlips Plus C-18 (5 мкм). • Анализ с использованием ацетонитрила и воды в качестве подвижной фазы, с добавлением 0.1% трифторуксусной кислоты как модификатора. Проба в объеме 20 мкл. скорость потока 0.4 мл/мин, детектирование осуществляется в УФ-диапазоне Как выбрать длину волны для УФдетектирования? Пример применения селективной длины волны, 310 нм (Экстракт коры осины) Параметры, используемые для описания хроматограмм Параметры качества колонки • • • • • • Время удерживания несорбируемого компонента, t0. Время удерживания, tr, Время, за которое компонент проходит всю систему от инжектора (момент ввода пробы принимается за t = 0) до детектора Коэффициент ёмкости k‘ = степень удерживания компонента k’=(tr-t0)/t0 Высота пика hp. Ширина пика wx Число теоретических тарелок N = показатель эффективности разделения. N =5,54(tr /tw1/ 2 )2, Высота, эквивалентная теоретической тарелке ВЭТТ или Н = длина участка колонки, на котором имеется одна теоретическая тарелка H = L / N Приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке ПВЭТТ или h. используется для сравнения эффективности (т.е. качества упаковки) колонок с разными диаметрами зёрен сорбента h = H / dp