Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology Пептидергическая регуляция функций поджелудочной железы при возрастной патологии Tarnovskaya Svetlana svetlanatarnovskaya@gmail.com Возрастная патология поджелудочной железы С возрастом физиологическая активность эндокринных клеток поджелудочной железы (инсулинпродуцирующих β-клеток, глюкагонпродуцирующих α-клеток и соматостатинпродуцирующих δклеток) снижается, что приводит к развитию сахарного диабета 1-го и 2го типов. Регуляция дифференцировки клеток поджелудочной железы (Joel F. Habener, Daniel M. Kemp, and Melissa K. Thomas. Minireview: transcriptional regulation in pancreatic development // Endocrinology. 146(3):1025-1034, 2005) Тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp Крысы с сахарным диабетом, вызванным введением аллоксана Тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp Пациенты с сахарным диабетом 1го и 2го типов Снижение уровня глюкозы в крови Цель исследования: изучить влияние тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию факторов дифференцировки эндокринных клеток поджелудочной железы человека. Задачи: 1.Оценить возрастную динамику экспрессии сигнальных молекул – маркеров дифференцировки клеток поджелудочной железы при старении 2.Изучить влияние тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию указанных маркеров при старении клеток поджелудочной железы методами иммуноцитохимии Материалы и методы Диссоциированное культивирование Объект исследования: культура клеток поджелудочной железы человека получена из 14 недельного плода, умершего антенатально. 1 пассаж – «молодые» культуры, 14 пассаж – «старые» культуры. Форма опыта: Контрольные культуры клеток – контроль 1 (добавление физиологического раствора 0,9%), контроль 2 (добавление контрольного тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu, 20 нг/мл) Подопытные культуры клеток – добавление тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp, 20 нг/мл. Клетки культивировали во флаконах (25 см2, JetBiofit) в стандартных условиях (5% СО2, среда ДМЕМ, L-глутамин, 15% FBS SC-BIOL, 1% пенициллин-стрептомицин). В работе использовали первичные моноклональные антитела к Pax6, Nkx2.2, Pdx1 (1:50, Abcam) и вторичные антитела – биотинилированные антимышиные иммуноглобулины (Novocastra). Для пермеабилизации использовали 0,1% тритон Х100. Визуализацию окраски проводили с применением пероксидазы хрена и деаминобензидина (EnVision Detection System). Площадь экспрессии маркеров оценивали морфометрическим методом (микроскоп Nikon Eclipse E400, цифровая камера Nikon DXM1200, ПК Intel Pentium 4, программное обеспечение «Vidеotest Morphology 5.2»). Материалы и методы Молекулярное моделирование выполнялось с использованием лицензионного программного обеспечения Molecular Operating Environment 2012.10 1. Построение молекул Фрагмент ДНК 5‘-ATATGGCAGGGGTAA-3’•3'-TATACCGTCCCCATT-5‘ взят из белковой базы данных (PDB) под номером 2KV6. Пептиды Lys-Glu-Asp-Trp и Ala-Glu-Asp-Leu построены в левовращающей конформации. Молекулы ДНК и пептиды протонировались при рН7, Т=300К, NaCl 0.1 моль/л и минимизировались в силовом поле Amber12:EHT. Растворитель учитывался в неявном виде как генерализованная борновская модель с диэлектрической постоянной е=80 2. Расчет ДНК-пептидных комплексов Для предсказания наиболее энергетически выгодных ориентаций пептида в молекуле ДНК и расчета энергии связи использовались алгоритмы докинга и штрафные функции London dG и GBVI/WSA dG Исследуемый и контрольный пептиды Пептид Lys-Glu-Asp-Trp Пептид Ala-Glu-Asp-Leu (контрольный) Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию факторов дифференцировки клеток ПЖ * - р<0,05 по сравнению с контролем Pax6 – фактор дифференцировки (ФД) α-клеток; Pdx1 – фактор дифференцировки βклеток Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию факторов дифференцировки клеток ПЖ * - р<0,05 по сравнению с контролем Foxa2 – ФД β-клеток ; Nkx2.2 – ФД α-клеток и PP-клеток Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию факторов дифференцировки клеток ПЖ * - р<0,05 по сравнению с контролем Pax4 – ФД β-клеток; Ptf1a- ФД ацинарных клеток Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию генов ФД ПЖ * - р<0,05 по сравнению с контролем Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию генов ФД ПЖ * - р<0,05 по сравнению с контролем Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию генов ФД ПЖ * - р<0,05 по сравнению с контролем Предполагаемая мишень действия пептидов PDX1 gene (или Ngn3, Pax4, Ptf1a ) mRNA Спектры поглощения ДНК-пептидных комплексов C(Pep) = 1 mg/ml, C(DNA)=0,05 mg/ml, С(NaCl) = 0,005M Гипотетический механизм действия коротких пептидов Электростатические характеристики пептидов (pH 7.4, T=300 K) Lys-Glu-Asp-Trp (Ʃq = 0) Ala-Glu-Asp-Leu (Ʃq = -2) Электростатические характеристики ДНК (pH 7.4, T=300 K) Большая бороздка 5’-AAAAAAAAAA-3’ 3’-TTTTTTTTTT-5’ Малая бороздка 5’-AAAAAAAAAA-3’ 3’-TTTTTTTTTT-5’ Электростатические характеристики ДНК (pH 7.4, T=300 K) Большая бороздка 5’-CCCCCCCCCC-3’ 3’-GGGGGGGGGG-5’ Малая бороздка 5’-CCCCCCCCCC-3’ 3’-GGGGGGGGGG-5’ Электростатические характеристики ДНК (pH 7.4, T=300 K) Большая бороздка 5’-ACGTACGTAC-3’ 3’-TGCATGCATG-5’ Малая бороздка 5’-ACGTACGTAC-3’ 3’-TGCATGCATG-5’ Электростатические характеристики ДНК (pH 7.4, T=300 K) Большая бороздка 5’-GACCGTCAGC-3’ 3’-CTGGCAGTCG-5’ Малая бороздка 5’-GACCGTCAGC-3’ 3’-CTGGCAGTCG-5’ Электростатические характеристики ДНК (pH 7.4, T=300 K) Большая бороздка 5’-GGCAGG-3’ 3’-CCGTCC-5’ Пептид Lys-Glu-Asp-Trp Предполагаемый сайт связывания для пептида Lys-Glu-Asp-Trp Gene gene regulatory region, range -499 to 100 bp (cDNA 5'→3') GenBank № Pdx1 ATCAAATGCTTCTGACCTAGAGAGCTGGGTCTGCAAACTTTTTTTTTATCGTATTCCGCAACAGTTAAATAAAAAATTAAAAACTCAACATGTCTCCT NM_000209.3 TGTAAACTACATCAATTAACAAACACACTATGTCCATTATCAAATATAATAGAAAAAATATAGGAAAATAGAAAATAGAAAAATATAGGAAAATAG AAACTTTTAAGCCACGGTGAAAATGTTTCTATAAATGAGTGGTTCTAATGTTTTCGTGAGCGCCCATTTTGGGGAGCACCGCCAGCTGCCCGTTCAG GAGTGTGCAGCAAACTCAGCTGAGAGAGAAAATTGGAACAAAAGCAGGTGCTCGCGGGTACCTGGGCCTAGCCTCTTAGTGCGGCCAGCCAGGC CAATCACGGCCCCCGGCTGAACCACGTGGGGCCCCGCGGAGCCTATGGTGCGGCGGCCGGCCCGCCGGTCCGCGCTGGCTGTGGGTTCCCTCTG AGATCAGTGCGGAGCTGTCAAAGCGAGCAGGGGTGGCGCCGGGAGTGGGAACGCCACACAGTGCCAAATCCCCGGCTCCAGCTCCCGACTCCCG GCTCCCGGCTCCCGGCTCCCGGTGCCC Pax6 GGCCCGAAGCCGCCGAGAGAGCTCGGGACAGCGCAGGACCAGGCAGCCGCTCGCTCTCCTGTCACCTTAACTGCAGGCTCCGAGGGGCGCCTTT NM_000280 GGAGTGTACTGAGGTGTGTCCTAATCGTGCGGCATTCAACAAATGGACTTCTGGTGTGTGGTCAGAAGAGAAAAGCCATTTACTTACTTTCCTCCC CGGTTTTCTGGCAACAGCTGAAGGGGAGCTGCCTCCGTGGACTGAGCAGACCCAGGAGAGGGAGTCGTGGTGCGGAGACACACGCACCACACA CAGATGACCGGTGGCACACACGACACACGCTGACATACCGACATCGCCAGTGGGACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGA GAGAGAGAGAGAATCCCTCCCAGCATTGGTCATCCGCCCCCCCACCCAGGCTTCCACTCCCCCTCCCCTCTTATCTCCCCTGGCTTCCCCTCCTCTCG GGCGCTGCGAAAAGCAGCCGCACTTAGTCAACAAATGGCACGTGGGAGAAGTTGGTGAGTGTTTGGTGAGGACTCTTCAGGGCTTTTCACAAGA ACCCTCTGTACACAAAGTAAGTGGCGTGTT Pax4 GCCAGCTCTCAAAGAAAGCAGCTTGCGTTGACAGCCTGGGGGCAGCAAGGATGCAGTCTCCCAGGAGAGGATGCACTCGGTGGTGGGAAGCCA NM_006193 GGCTGGAGGGGCCTGAGTGACCCTCTCCACAGGCGGGCAGGGCAGTGGGAGAGGTGGTGTGTGGATACCTCTGTCTCACGCCCAGGGATCAGC AGCATGAACCAGCTTGGGGGGCTCTTTGTGAATGGCCGGCCCCTGCCTCTGGATACCCGGCAGCAGATTGTGCGGCTAGCAGTCAGTGGAATGC GGCCCTGTGACATCTCACGGATCCTTAAGGTAATGGGCCAGCACCTTTACCCAGTGATGGGGACAGGAAGCAGGGAGAAAGGGCTCCTCTGAAG GCAAGAGCCTGGGGCTGTTGCAGGCTCTGAGGGCTTCTGGGACTTGGGTCACTTCCTGGGAGATCCTCTCGGAGGTTGAAAAGGGGAGCCTCAG GCCCTCAAAGGTGAGGCTGGACTCCCGACTTCATGGCCTGGTCCAGTAAGTCTTGGCTTTGTCTTATAGCCTCCTCCTGTCCCAGGGACACTCTCCT TCCTTCTGCCCATCATGCCTCACCTGTCCCTGCTT Nkx2.2 TCCCCTCCTCCTCCCCACCCCCACCTTTTTTAAGATGCAATTTGTTAAAACGGCCCTTTCAAGTGTGTGGACTCGCGAGCGACGCGGTGGCCCTTTGT NM_002509.3 ATGTAAATACTGGGTTTAAAAAAAAAAAGGCTCGCCCCGTCTTTGCAATTAATTGACACGTTACACCTCTCATCTTGCTCTAGAGGGCCGTTGGCTG GGAGCGCGGAGCTCCCCAAAACCCACAATTTCACATCTGCAAATACTGTCTTCATCCACTTGACTCCCAAGACCCGCCCACACGTGGCCAACCTTTG CGTTTTTAATGTCTCTTCCCCCTTTTTTCCACCCTTCTCCCGCTCCCTCTCTCGCTCCCCCTCCCTCCCTCTTTCTTTCCCTCCCTCCCTCTCTTTCTCCCCC TCTCCCCGCCTCCCCAGGTTCGTGAGTGGAGCCCAGCCTTATATGGACTGATCGCTCGGGCAATGGCCCATTTTTTCCTCGCCACCAGCCGCCACCG CGCGCCGAGCGGCCGCCGGAGCCCGAGCTGACGCCGCCTTGGCACCCCTCCTGGAGTTAGAAACTAAGGCCGGGGCCCGCGGCGCTCGGCGCGC AGGCCGCCCGGCTT Foxa2 CGAAGCTCCGTGTCTGCCATCTCGCCTGTCTTCTGCCACCATCGCCCCCAATTTTGGACAGGTGGGCTGGATGCCCACTAGTTCCTATGCATTCTCTG NM_153675.2 TGTCTGAGGGGGTGGGTACAGGGCTGGATCCCCAAGGTCCAGCCAGGTTTTCAGAACCAAGAAAGAGCCTCCACATCCAAACACCTGCAATATCC CCCCACTCCAAATCTGGGCTCACAGGCTAACCCAGAACAGAAGACAATTTTTGAACCCAAGAGCTGCTGGGGAAATAAAAGTATACGATTGCTGG AGTTTCTAATTTCTATTAAGCAGTCCCTCTGGAAGACAGAGAGGACAGAGACGCTCTTGAAGTCAACTCCATATGCCCCATCATTGATTCCTGGATT CTTCTCTCCTCACCCCTCCCTCCCCACCTCCTGCCCTGTTTGTTTTAGTTACGAAATGCTGTGGGCACCTCGGTTGTGACTGAAAAGTAACCTTGAAA CACGCCGGCCTGAATATCAGAGACAAATCTCAGCCTCCCAACCGTCGGCCGCTGCTAGAGGGGCTGCTTGCGCCAGGCGCCGGCCGCCCCACTGC GGGTCCCTGGCGGCCGGTGTCT Взаимодействие пептидов с ДНК Фрагмент В-ДНК (5‘-ATATGGCAGGGGTAA-3’•3'TATACCGTCCCCATT-5‘) получен из Protein Data Bank PDB code 2KV6 (SOLUTION NMR) . Ebond = -14.5 kcal/mol Пептид Lys-Glu-Asp-Trp Пептид Ala-Glu-Asp-Leu Pdx1 связывается с ДНК по большой бороздке ..nlterhikiwfqnrrmkwkkeed 2.4 Ȧ resolution crystal structure of the Pdx1 bound to a target DNA (PDB: 2H1K, Method: x-ray diffraction) Заключение • Экспериментальные данные, полученные методами иммуноцитохимического анализа и ПЦР, позволили выявить стимулирующее действие пептида Lys-GluAsp-Trp на факторы дифференцировки клеток поджелудочной железы • Методами молекулярного моделирования рассчитан комплекс ДНК-пептид в предполагаемом сайте связывания Спасибо за внимание!