время t 2

Импульсная Фурье ЯМР спектроскопия
Постоянное возбуждение
с меняющейся частотой
Импульсное возбуждение
с последующим Фурье
преобразованием
Время
A
spin system
B
spin system
V mode
Fo urier
transform
1. Короткому импульсу монохроматического излучения с
частотой ν0 и длиной τ в частотной области соответствует
определенная полоса частот Δν , центрированная на частоте ν0
2. С уменьшением длины импульса ширина полосы частот
увеличивается и наоборот.
Так, например, длине импульса 10 микросекунд
соответствует полоса частот 16KHz.
Частота
3. Стандартная ширина протонных химических сдвигов у
белков 15 ppm. В магнитном поле с напряженностью 7.05 Т (ν0
=300 МHz для 1H) интервал 15 ppm соответствует полосе
частот 4.5 KHz для 1H.
В магнитном поле 14.1 Т эта полоса составит 9 KHz.
1
Математическое Фурье преобразование
Временной спектр ЯМР этанола
Частотный спектр ЯМР этанола
→
←
Время
Частота
2
Экспериментальные схемы с применением одиночного импульса
1) Система спинов в равновесии
Импульс
2) Короткий прямоугольный
импульс.
Отклик системы
на импульс
Время
релаксации
3) Отклик системы спинов на
импульс и его регистрация
4) Временная задержка,
необходимая, чтобы система пришла
в равновесие (обычно 2-3 Т1)
5) Многократное накопление
Мертвое время
Последовательность событий:

Длина импульса определяет угол
поворота
вектора магнетизации
Угол поворота вектора магнетизации α, (в
радианах) равен
α = γ B1tp
Длина типичного 90о импульса около 10-5 c.
(a)
(b)
Для 180о импульса эта величина в 2 раза 3
больше.
S
I
Эффект Оверхаузера
Схематическое представление эффекта Оверхаузера
Молекула содержит два спина I и S, которые не
перекрываются, так что каждый из них может быть
представлен как синглет (а).
После насыщения спина S величина сигнала спина I может
увеличится (b), уменьшится (c), стать отрицательной (d)
NOE = (I –I0)/I0
NOE ~ f(rIS) f(τc)
fI(S) = 1/(2 + A r6IS)
Уравнения, описывающие эффект Оверхаузера, показывают, что
1)
Эффект проявляется в изменении интенсивности линий в спектре ЯМР
2)
Величина эффекта зависит от двух вкладов, один из которых связан с расстоянием между
спинами, а второй
от вращательного корреляционного времени молекулы τc. Это время
обратно пропорционально коэффициенту вращательной диффузии молекулы Dr
3)
Эффект проявляется только для близких соседних спинов, расстояние между которыми
4
меньше 5-6 Å.
Двумерная ЯМР спектроскопия
Двумерная корреляционная ЯМР спектроскопия – метод, который коррелирует (сравнивает
между собой) два сигнала, объединенные некоторым общим взаимодействием.
Четыре временных периода
1) приготовление
2) развитие (время t1)
3) смешение
4) детектирование (время t2)
Двумерный ЯМР на практике означает, что измеряемый на выходе сигнал
является функцией двух времен, а после Фурье-преобразования – двух частот
Общая схема двумерного ЯМР очень гибкая и на сегодня известны сотни разных
последовательностей, предназначенных для решения тех или иных конкретных
задач.
Например, HMQS-HOHAHA есть система импульсов состоящая из Heteronuclear multiple-quantum
correlation experiment +Homonuclear Hartman-Hahn spectroscopy
Важными и относительно простыми схемами в ЯМР являются:
1) Корреляционная спектроскопия (COSY), которая идентифицирует пары
протонов, связанные скалярным спин-спиновым расщеплением
2) Корреляционная спектроскопия (NOESY), которая идентифицирует близость
5
пар протонов, связанные эффектом Оверхаузера
Корреляционная ЯМР спектроскопия (COSY)
B
A
A
Последовательность импульсов в COSY
Сокращенная запись выглядит так: 90o – kt1 – 90o – t2, где k = 0,
1, 2…2n. Эксперименты повторяются с шагом к равным 1.
F
Одномерный спектр ЯМР для двух 1H-1H спинов
B
Контурная
карта
(смотри
1
1
следующий слайд) H- H COSY
спектра двух связанных спинов.
Картина всегда симметрична
относительно
диагонали.
Черные кружки представляют
диагональные пики; открытые
кружки кросс-пики. Появление
последних означает, что два
спина сближены.
Заметим,
однако, что расстояния между
6
ними в COSY не определяется.
1D и 2D ЯМР спектры небольшого белка, протеазного ингибитора K (57 аминокислот) в
0.01 M, pD 3.4, 25oC, 360 MHz.
1D
1H
спектр
Контурное
представление
COSY
спектра. Третья
координата - интенсивность.
Этажерочное
представление
COSY спектра
Контурное представление COSY спектра наглядно показывает способность к взаимодействию
различных групп протонных пиков. Укажем лишь на один пример. Так, имеется
взаимодействие высокопольных метилов (ω1 = -0.9 ppm, ω2 = -0.9 ppm).
симметрична относительно диагонали.
Картинка всегда
7
Nuclear Overhauser Enhanced Spectroscopy (NOESY).
90°
90°
90°
Evolution
Mixing
t1
m
Detection
t2
E
D
C
1
B
A
2
Вверху: последовательность
импульсов в NOESY. Сокращенная
запись выглядит так:
90o – t1 – τm- 90o –t2
Внизу: схематическая контурная карта
спектра, состоящего из пяти
резонансных линий (А, B, C, D и E).
Появление трех кросс-пиков
свидетельствует, что резонансы,
соответствующие этим пикам
сближены в пространстве (А и C, B и
D, B и Е).
Контурная карта протонного двумермого NOE спектра бычьего
трипсинового панкреатического ингибитора (360 MHz,
концентрация белка 0.02 М, pH 3.8) На карте выявляется множество
кросс-резонансных пиков, отражающих сближенность в
пространстве некоторых аминокислот. Аминокислоты обозначены
(A=alanine, T=threonine, C=cysteine, Q=glutamine, F=phenylalanine).
Aмидный протон Glu 31 (на карте Q31NH) контактирует с αпротоном Cys 30 (на карте C30 α-H), aмидный протон Phe 33 (на
карте F33NH) контактирует с α-протоном Тhr 32 (на карте Т32 α-H)
8
Многомерный, гомо- и гетероядерныый ЯМР
2D-ЯМР: два времени
3D-ЯМР: три времени
4D-ЯМР: четыре времени
2D NMR: Pa→Ea(t1)→Ma→Da(t2)
3D NMR: Pa→Ea(t1)→Ma→Eb(t2)→Mb→Db(t3)
4D NMR: Pa→Ea(t1)→Ma→Eb(t2)→Mb→Ec(t3)→Mc→Dc(t4)
0
A
(A) 3D гетероядерный ЯМР
окисленного глютеродоксина из
Е.Coli. Белок обогащен 15N
B
3
(B) Двумерный спектр (b), как
функция еще одной частоты (а).
1
1 ( H )
6
(a)
9
110
9
1
3 ( H )
7
120
15
2 ( N )
Соотношения между
последовательностями
импульсов для записи 2D, 3D,
4D ЯМР. Сокращения: Pподготовка; Е-эволюция; Mсмешение; D-детектирование
(b)
Многомерный спектр –
Большая Советская
Энциклопедия
(от одной строчки
до 60 томов)
9