Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы Проект «Изучение закономерностей взаимодействий низкомолекулярных органических соединений и специфических антител с использованием флуоресцентных маркеров и разработка новых методов индивидуального и класс-специфического определения антибиотиков, пестицидов и микотоксинов» Государственный контракт N 16.740.11.0158 от 2 сентября 2010 г. Организация – исполнитель – Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН Руководитель работ – д.х.н., проф. С.А. Еремин Методы: Поляризационный флуороиммуноанализ Мембранный иммуноанализ с флуоресцентной детекцией Маркеры: Низкомолекулярные флуорофоры (производные флуоресцеина) Коллоидные флуоресцентные наночастицы (квантовые точки) Объекты: Пестициды Микотоксины Антибиотики ПРИНЦИП ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО ФЛУОРОИММУНОАНАЛИЗА Sensors F F Ag F-Ag Быстрое вращение Низкая поляризация Ab Ag F-Ag:Ab Медленное вращение Высокая поляризация F – флуоресцентная метка Ag – антиген Ab – антитело F-Ag – трейсер = меченное флуоресцентной меткой производное определяемого вещества РАЗРАБОТКА И ОПТИМИЗАЦИЯ ПФИА Разработка и оптимизация флуоресцентного иммуноанализа должна включать в себя ряд последовательных процедур: определение аффинности (константы связывания) антител; Ag + Ab k1 k-1 AgAb k1 [ AgAb] K k 1 [ Ag ][ Ab] подбор оптимального трейсера; подбор оптимальной длины и структуры спейсерного мостика; подбор оптимального состава среды проведения анализа а) материал иммунохимического планшета; б) природа и концентрация детергента. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПФИА ГЕРБИЦИДОВ Градуировочные кривые ПФИА метсульфурон-метила и хлорсульфурона Аналитические параметры ПФИА метсульфурон-метила и хлорсульфурона Параметр ПФИА МСМ ПФИА ХС 5,4±2,3 9,89±3,35 123,3±7,8 93,1±7,6 30-1000 15-500 0,91±0,03 0,76±0,06 RSD intra, % 0,9 4,6 RSD inter, % 7,1 12,8 Предел обнаружения, мкг/мл IC50, мкг/мл Линейный диапазон, мкг/мл Наклон СПЕЦИФИЧНОСТЬ ПФИА АНТИБИОТИКОВ Коэффициенты перекрестного реагирования Анализируемый Перекрестнореагирующее соединение антибиотик Хлорамфеникол Название CR, % Тиамфеникол <0.1 Пенициллин G 1 Метициллин 7 Амоксициллин 15 Метампициллин 40 Азлоциллин 30 Бакампициллин 20 Дигидрострептомицин 75 Ампициллин Стрептомицин Применение квантовых точек как маркеров в иммунохроматографии Коллоидное золото Квантовые точки 0,5 140 100 0,3 80 Поглощение 60 0,2 40 0,1 20 0,0 300 400 500 600 , нм Invitrogen ядро – CdSe, оболочка - ZnS водорастворимые с полимерным покрытием пик эмиссии при 625 нм свободные СООН – группы диаметр около 10 нм 0 700 Флуоресценция, отн. ед 120 0,4 Поглощение Свойства: поглощение в широком диапазоне длин волн поглощение, зависящее от размера высокий квантовый выход фото- и химическая стабильность Флуоресценция Иммунохроматографический анализ хлорамфеникола с использованием квантовых точек Контрольная зона Тестовая зона Визуальная детекция Флуоресцентный ридер Аналитические характеристики тест-системы Предел обнаружения 0,03 нг/мл* Диапазон определяемых содержаний 0,04-3 нг/мл Предел обнаружения при визуальной детекции 1 нг/мл Время анализа 20 минут * ПДК хлорамфеникола в молоке (СанПиН 2.3.2 1078-01) составляет 0,3 нг/мл Berlina A.N. et al. (2013). Analytical & Bioanalytical Chemistry. 405 (14): 4997-5000 Предложена высокопроизводительная мультипараметрическая тест-система для одновременного контроля определения 3-х пороговых уровней ХФ с целью контроля степени превышения нормативов пищевой безопасности. Принцип многозонной тест-системы заключается в расположении на мембране 3-х тестовых зон, в которых сорбировано различное количество конъюгата ХФ-Белок. С увеличением концентрации ХФ в пробе происходит исчезновение одной или нескольких тестовых зон: при С(ХФ)= 0 нг/мл наблюдается 3 полосы; при С(ХФ)= 1 нг/мл наблюдается 2 полосы; при С(ХФ)= 10 нг/мл наблюдается 1 полосы; СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!