выделение и химическая структура силенана – пектина

реклама
Выделение и химическая
структура силенана – пектина
смолевки обыкновенной
Silene vulgaris
Бушнева О.А.
Научные руководители :
акад., д.х.н. Оводов Ю.С.,
ст.н.с., к.х.н. Оводова Р.Г.
Цель работы:
1. Получение пектинового полисахарида
из надземной части смолевки обыкновенной
Silene vulgaris (Moench) Garke
(Oberna behen (L.) Ikonn)
2. Разработка эффективного способа выделения
пектиновых полисахаридов из надземной части
цветковых растений на примере смолевки
обыкновенной
3. Установление общих закономерностей
распределения углеводных цепей и
особенностей тонкой структуры пектинового
полисахарида из смолевки обыкновенной
Рис. 1.
свежесобранная надземная часть
смолевки обыкновенной
обработка 0.5% р-ром формальдегида (12 ч., 20°С) и фильтрование
остаток сырья
фильтрат
обработка подкисленной водой
(рН 4.0, 3 ч., 50°С), фильтрование
фильтрат
слив
остаток сырья
экстракция 0.7%-ным оксалатом
аммония (6ч. х 2, 68°С ), фильтрование
слив
остаток сырья
отход
силенан
объединенный
экстракт
1. концентрирование
2. осаждение спиртом
3. диализ 4. лиофилизация
Рис. 2.
Выход и состав образцов SV из различных образцов S. vulgaris
Образцы
силенана
Выход,
%1
Gal A2 ОМе2
Содержание, %
Нейтральные моносахариды3
Rha
Gal
Ara
Xyl
Man
Glc
2.7
3.5
2.6
2.9
3.3
4.0
3.8
3.4
3.2
3.6
Белок2
SV1
SV2
SV3
SV4
SV5
1.9
2.0
2.0
2.8
2.8
55
52
75
74
77
3.1
3.0
3.9
3.8
2.7
1.9
2.0
2.4
2.4
1.2
0.9
1.1
0.8
0.6
0.9
0.8
1.2
1.1
0.8
0.9
1.8
2.6
1.7
1.9
2.1
13
14
12
11
10
SV6
1.5
56
2.4
2.4 2.4 2.6 0.8
1.0
1.8
18
SV7
2.6
69
3.2
1.4 3.0 2.5 0.7 0.8
2.4
15
1- выход от сухого сырья; 2 - в весовых процентах; 3 – в мольных процентах
Сбор образцов по фазам вегетации интродуцированной S. vulgaris:
SV1 - появление надземной части, SV2 - бутонизация, SV3 - начало цветения,
SV4 - массовое цветение, SV5 – конец цветения и начало созревания семян,
SV6 - созревание семян; и SV7 - из дикорастущей S. vulgaris в фазу цветения.
Рис. 3.
объединенный экстракт
1. концентрирование
2. осаждение спиртом
3. диализ
4. лиофилизация
5. гельфильтрация
SV 8
1. ультрафильтрация
Мw  100 кДа
2. лиофилизация
силенан
SV
выход 2.2%,
78 % D-GalpA, 3.0 % ОМе
[]D20 = +167.3 (с 0.08; вода)
3.7 % Ara, 3.3 % Gal,
1.8 % Rha, 9 % белок
SV 9
выход 2.2%,
80 % D-GalpA, 4.2 % ОМе
[]D20 + 200.5 (с 0.06; вода)
3.4 % Ara, 2.2 % Gal,
1.7 % Rha, 10 % белок
Рис. 4.
СИЛЕНАН SV
[]25 = 120 г/см3, MsD = 22 кДа , 1.15% золы
ионообменная хроматография на DEAE-целлюлозе
0.1 M NaСl
0.2 M NaСl
0.3 M NaСl
SV-1
SV-2
SV-3
выход 7%
выход 10%
выход 19%
43 % D-GalpA,
5.4 % Ara,
6.4 % Gal,
2.1 % Rha
70 % D-GalpA,
4.1 % Ara,
4.4 % Gal,
2.0 % Rha
85 % D-GalpA,
2.3 % Ara,
2.1 % Gal,
1.5 % Rha
Рис. 5.
СИЛЕНАН SV
частичный кислотный
гидролиз
литий-деградация
распад по Смиту
ферментативный
гидролиз пектиназой
SVH
SVP и SVP-P
ГЖХ
ЯМР
SVP-S
ГЖХ - МС
SVP-L
СИЛЕНАН SV
частичный кислотный гидролиз
(0.05 М TFA, 24 ч., 50°С)
гельфильтрация на S-500
SVH
[]D = +273.3
(с 0.1; вода)
20
Kav= 0, выход 45 %
галактуронан
(рамногалактуронан)
Рис. 6. Схема
частичного кислотного
гидролиза SV
ЯМР
94 % D-GalpA,
2.7 % ОМе,
Rha сл.
C4 -1,4- D-GalpA
C2 -1,4- D-GalpA
C1 -1,4- D-GalpA
C6 -1,4- D-GalpA
C5 -1,4- D-GalpA
C3 -1,4- D-GalpA
Рис. 7. Спектр 13С-ЯМР фрагмента SVH
Рис.8.
Главная углеводная цепь линейной
области силенана SV:
…4)--D-GalpA-(14)--D-GalpA-(1n4)--D-GalpA-(1…
СИЛЕНАН SV
ферментативный гидролиз
пектиназой
гельфильтрация
на S-500
GalpA
SVP
Kav= 0, выход 13 %
омыление 0.5 М NaOH
ферментативный гидролиз
пектиназой
гельфильтрация
на Р-4
Рис. 9. Схема
ферментативного
гидролиза SV
омыление 0.5 М NaOH
ферментативный гидролиз
пектиназой
гельфильтрация на Р-4
SVP-1
Kav= 0, выход 7%
SVP-P
Kav= 0.02, выход 6%
Рис. 10.
GalA
МеО
44 %
3.1% 4.3 %
SVP
Ara
Rha
9.3 % 7.8 %
ЯМР
[]D20 = +54.5 (с 0.1; вода)
SVP-P
Gal
32 %
0%
15.1 %
25.6 % 11.9 %
35 %
0%
15.8 %
22.1 % 12.1 %
[]D20 = +49.2 (с 0.1; вода)
SVP-1
[]D20 = +42.1 (с 0.1; вода)
C1 -1,4- D-GalpA
Rhap CH3
C1 Rhap
Рис. 11. Спектр 13С-ЯМР фрагмента SVР-P
2)--Rhap-(1
2)--Rhap-(1
4)
Рис. 12. Спектр 1Н/13С HSQC фрагмента SVР-P
-Galp-(14)--Galp-(1…
-Araf-(15)--Araf-(1…
-Galp-(13)--Galp-(1…
Рис. 13. Спектр 1Н/13С HSQC фрагмента SVР
Рис. 14.
Линейный галактуронан:
…4)--D-GalpA-(14)--D-GalpA-(1n4)--D-GalpA-(1…
Линейный рамногалактуронан:
…2)--Rhap-(14)--GalpA-(1n 2)--Rhap-(14)--D-GalpA…
Рамногалактуроанан I:
Кор:
2)--Rhap-(14)--GalpA-(1n 2)--Rhap-(14)--D-GalpA
4)
4)
s.сh.
s.сh.
Боковые цепи (side chains):
-Galp-(13)--Galp-(1…
-Galp-(14)--Galp-(1…
-Araf-(15)--Araf-(1…
[]D20 = +54.5 (с 0.1; вода)
44 % D-GalpA,
4.3 % Ara, 9.3 % Gal, 7.8 % Rha
SVP
распад по Смиту
гельфильтрация на G-25, S-500
SVP-S
Kav=0.8, выход 7 %
ЯМР
[]D20 = +29.5 (с 0.37; вода)
28 % D-GalpA,
12.9 % Ara, 35.6 % Gal, 5.8 % Rha
ГЖХ - МС
Рис. 15. Схема распада по Смиту SVP
… 3)--Galp-(1 3)- -Galp-(13)--Galp-(13)--Galp-(1
2)
… 5)--Araf-(1 5)- -Araf-(1
C2 3)--Galp-(1
C2 2,3)--Galp-(1
Рис. 16. Спектр 1Н/13С HSQC фрагмента SVР-S
Рис. 17.
Результаты ГЖХ-МС гидролизата
перметилированного фрагмента SVP-S
Метилированные сахара
Фрагменты
2,3,5-Me3-Ara
Araf-(1
2,3,4,6-Me4-Gal
Galp-(1
2,4,6-Me3-Gal
 3)-Galp-(1
2,3,4-Me3-Gal
6)-Galp-(1
2,4-Me2-Gal
3,6)-Galp-(1
44 % D-GalpA,
4.3 % Ara, 9.3 % Gal, 7.8 % Rha
SVP
литий-деградация
смесь олигосахаридов, выход 38 %
гельфильтрация на Р-4
SVP-L-1
Kav= 0, выход 10 %
ГЖХ - МС
[]D20 = +39.0 (с 0.06; вода)
22 % D-GalpA, 23.4 % Ara,
27.6 % Gal, 11.9 % Rha
Рис. 18. Схема литий-деградации SVP
SVP-L-2
Kav= 0.5, выход 12 %
[]D20 = +37.0 (с 0.06; вода)
32 % D-GalpA , 35.0 % Ara,
33.0 % Gal , 24.0 % Rha
Рис.Результаты
19.
ГЖХ-МС гидролизата перметилированных
фрагментов SVP-L-1 и SVP-L-2
Метилированные сахара
Фрагменты
2,3,5-Me3-Ara
Araf-(1
2,3-Me2-Ara
5)-Araf-(1
3-Me-Ara
2,5)-Araf-(1
2-Me-Ara
3,5)-Araf-(1
2,3,4,6-Me4-Gal
Galp-(1
2,3,6-Me3-Gal
 4)-Galp-(1
2,4,6-Me3-Gal
 3)-Galp-(1
2,3,4-Me3-Gal
6)-Galp-(1
2,6-Me2-Gal
3,4)-Galp-(1
2,4-Me2-Gal
3,6)-Galp-(1
3-ОMe-Rha
2,4)-Rhap-(1
Рис. 20.
Линейные области силенана:
…4)--D-GalpA-(14)--D-GalpA-(1n4)--D-GalpA-(1…
и
…2)--Rhap-(14)--GalpA-(1n 2)--Rhap-(14)--D-GalpA…
Разветвленные области силенана:
Кор:
2)--Rhap-(14)--GalpA-(1n 2)--Rhap-(14)--D-GalpA
4)
4)
s.ch.
s.ch.
s.ch. - side chains (боковые цепи)
Рис. 21.
Боковые цепи RG-I:
-Araf-(15)--Araf-(1…
-Galp-(14)--Galp-(1…
-Galp-(13)--Galp-(1…
-Galp-(16)--Galp-(1…
и
Точки разветвления боковых цепей:
5)-Araf-(1
2)
3)- -Galp-(13)--Galp-(13)--Galp-(1
2)
5)- -Araf-(1
3)-Galp-(1
6)
5)-Araf-(1
3)
3)-Galp-(1
4)
ВЫВОДЫ
1. Впервые из надземной части цветкового растения
Silene vulgaris (Moench) Garke (Oberna behen (L.) Ikonn)
выделен пектиновый полисахарид, названный
силенаном. Показано, что в состав углеводной цепи
силенана входят остатки галактуроновой кислоты
(более 60%), арабинозы, галактозы и рамнозы в
качестве основных компонентов. Остатки
галактуроновой кислоты имеют низкую степень
метоксилирования.
2. Разработан эффективный метод выделения силенана
из свежесобранного растительного материала,
который позволяет получать пектиновые
полисахариды в наиболее нативном состоянии.
3. Показано, что макромолекула силенана состоит из
линейных и разветвленных областей. Линейная
область представлена -1,4-Dгалактопиранозилуронаном и -1,2-рамно- -1,4-Dгалактуронаном, который является углеводной
цепью разветвленной области силенана –
рамногалактуронана I (RG-I). Боковые цепи RG-I
присоединены 1,4-связью к остаткам
рамнопиранозы кора и представляют собой
линейные цепи  -1,5-связанной арабинофуранозы
и -1,3-, -1,4- и -1,6-галактопиранозы. Точками
разветвления являются остатки 2,5-, 3,5замещенной арабинофуранозы и 2,3-, 3,6-, 3,4замещенной галактопиранозы.
4. Использование классических и современных
методов структурной углеводной химии, включая
спектроскопию ЯМР, позволило подтвердить
наличие ковалентных связей между линейной
цепью рамногалактуронана и боковыми
углеводными цепями разветвленных областей
силенана.
5. В процессе изучения силенана получена
принципиально новая дополнительная информация
для базы данных по спектроскопии ЯМР пектиновых
полисахаридов, которая может быть использована для
структурного исследования пектинов из новых
растительных источников.
Данная работа поддержана грантами
РФФИ (Гранты No. 00-04-48063, 01-04-96437) и
«Минпромнауки РФ» (Грант No. 02-4208).
Авторы выражают благодарность
д.х.н., проф. А.С. Шашкову (ИОХ им. Н.Д. Зелинского,
РАН) за съемку и помощь в расшифровке ЯМРспектров и
к.х.н. А.О. Чижову (ИОХ им. Н.Д. Зелинского, РАН) за
съемку и помощь в расшифровке хромато-массспектров.
Научная новизна:
Впервые установлена частичная химическая
структура силенана, пектинового полисахарида из
надземной части смолевки обыкновенной Silene vulgaris
(Moench) Garke.
С этой целью, наряду с современными методами
структурной химии углеводов, широко использована
двумерная гомоядерная спектроскопия ядерного
магнитного резонанса (ЯМР).
Установлено, что отличительной структурной
особенностью силенана является наличие длинных
участков линейного - 1,4-D-галактопиранозилуронана.
Кроме того, впервые показано, что макромолекула
силенана содержит фрагменты линейного
рамногалактуронана и разветвленной области,
представленной рамногалактуронаном I (RG-I).
Впервые доказана связь главной и боковых
углеводных цепей силенана через остатки рамнопиранозы
кора разветвленной области. При этом показано, что
боковые цепи разветвленных областей силенана
представляют собой блоки, состоящие из различных типов
арабиногалактана.
Установленная химическая структура силенана не
только подтверждает общие закономерности
распределения углеводных цепей, но и дает новую
информацию об особенностях тонкой структуры
пектиновых полисахаридов.
Скачать