22_Âèäèìààáñîðá. ñïåêòð
реклама
Электромагнитные колебания Длина волны λ E E=hν H E=hc/λ H E Направление распространения Длина волны в Å 1 10 Рентгеновское излучение 102 103 УФ- и видимое излучение 104 105 Инфракрасное излучение 106 107 Микроволновое Радиоволны излучение Уменьшение энергии падающего излучения Электронные переходы Абсорбционная спектроскопия Колебательные и вращательные Инфракрасная спектроскопия и рассеяние Мандельштама-Рамана Ядерные ЯМР 1 Электронные и колебательные переходы в атоме или молекуле УФ-излучение ИФ-излучение hc E2 E1 Диаграмма типичных уровней энергии, показывающая основное состояние и первое возбужденное состояние в атоме или молекуле. Колебательные уровни основного состояния показаны тонкими горизонтальными линиями. Переход между двумя колебательными уровнями показан короткой стрелкой. Возможный переход между нижним уровнем основного состояния и четвертым уровнем первого возбужденного состояния показан длинной стрелкой. 2 Закон Бера-Ламберта Величина поглощения при данной длине волны характеризуется молярным коэффициентом экстинкции ε. Если свет интенсивности I0 проходит через раствор толщины d и молярной концентрации C, то интенсивность I прошедшего света подчиняется закону Бера-Ламберта : I I 010 dC OП = 2 I log 10 dC I0 I log 10 OП (d 1) I0 где ε- молярный коэффициент экстинкции. Поглощение измеряется в % (100 I/I0), но чаще всего в поглощении A, (log I/I0). Когда d = 1 cм, A называется оптической плотностью ОП, где есть длина волны , при которой производятся измерения. Оптическая плотность равна ε× C 3 N.B. Обозначение концентрации как С = OП/мл не имеет физического смысла Применение абсорбционной спектроскопии для измерения концентрации белков и нуклеиновых кислот λ=280 nm Поглощение ближнего ультрафиолета для ароматических аминокислот в водных растворах при pH 6. Отметьте, по оси ординат молярное поглощение отложено в логарифмической шкале. λ=258 nm Поглощение ближнего ультрафиолета для пуриновых и пиримидиновых оснований в водных растворах при pH 7. Отметьте, по оси ординат молярное поглощение отложено линейной шкале. Примеры, оптическое поглощение для tRNA ОП258 = 1 соответствует концентрации 44 г/мл; oптическое поглощение для рибосом ОП258 = 1 соответствует концентрации 66 г/мл. 4 Применение абсорбционной спектроскопии для определения концентрации белков. 0.6 S6 0.4 S13 0.18 0.3 0.38 Absorbance 0.5 Пример белка в растворе, не образующего истинного молекулярный раствор Absorbance Пример белка в растворе, образующего истинный молекулярный раствор 0.7 0.2 0.1 0.0 24 0 26 0 28 0 30 0 32 0 Wavelength (nm) 34 0 36 0 24 0 26 0 28 0 30 0 32 0 34 0 36 0 Wavelength (nm) Отношение оптических плотностей при 280 и 260 нм 5 Применение абсорбционной спектроскопии для определения конформационных переходов в ДНК. Оптическая плотность трех образцов ДНК как функция температуры: E. Coli (50% GC) при ионной силе 0.01 и 0.1. Pseudomonas aeroginosa DNA (68% GC). Отметьте, что температура перехода (денатурации) зависит как от ионной силы, так и от содержания ГЦ пар. Кривая плавления раствора ДНК фага Т7. При прогревании раствора ДНК до температуры денатурации с последующем охлаждением кривая обратима. При прогревании раствора ДНК выше температуры денатурации кривая необратима. Поглощение раствора падает до величины 1.12 и ДНК выпадает в осадок.. Но если эти повысить температуру (до 76оС), и выдержать ДНК при высокой ионной силе (от 0.5 до 1.0) в течение нескольких часов, то ДНК ренатурирует и возвращается к исходной двухцепочечной структуре. Такой процесс называется отжигом ДНК. 6
