ОНКОМИР РАК И МИКРОРНК Н.Н.Колесников Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, Новосибирск 2013 История открытия и развития исследований по микроРНК Функция микроРНК – контроль и регуляция экспрессии белок кодирующих генов • • • • МикроРНК – негативный регулятор экпрессии генов на посттранкрипционном уровне Один белок кодирующий ген может регулироваться десятками разных микроРНК Одна микроРНК может регулировать работу более сотни разных генов МикроРНК как онкогены и супрессоры опухолей Циркулирующие микроРНК в плазме/сыворотке крови в составе экзосом, микровезикул и других комплексов • Стабильность • Селективная секреция • Регуляция процессов в микроокружении и в отдаленных тканях • Иммунномодуляция • Потенциальные маркеры ранней неинвазивной диагностики рака. Выбранные миРНК миР-21 – хронологически первая идентифицированная миРНК. Является сильным онкогеном. Её экспрессия увеличивается в большинстве солидных опухолей. Увеличивает пролиферативную и инвазивную активность опухолевых клеток. миР-221, миР-222 – онкогенные миРНК, индуцирующие ангиогенез и пролиферацию раковых клеток. миР-155 – продемонстрировано участие этой миРНК в инициации как врожденного, так и адаптивного иммунных ответов, а также в развитии иммунной системы в целом. Некоторые работы свидетельствуют об участии миР155 в онкогенезе различной этиологии. миР-205 – супрессор опухолевого роста, показано, что в случае некоторых видов опухолей миР205 индуцирует апоптоз и тормозит рост опухоли. Признаки раковой клетки: Автономия ростовых сигнальных путей : Самодостаточность в ростовых сигналах: раковые клетки продуцируют свои собственные ростовые сигналы и способны к пролиферации без внешних стимулов. Невосприимчивость к антиростовым сигналам: Раковые клетки уклоняются от воздействия антиростовых стопсигналов для того, чтобы пролиферировать. Избегание апоптоза: Опухолевые клетки уклоняются от апоптоза. Стабильный ангиогенез: Раковые клетки индуцируют и обеспечивают рост новых кровеносных сосудов. Неограниченный потенциал репликации: ДНК опухолевых клеток может воспроизводиться неограниченное число раз. Инвазия в другие ткани и метастазирование: Опухолевая масса порождает клетки-первопроходцы, колонизирующих места в организме с неограниченным питанием и пространством. ОНКОМИР. МикроРНК в канцерогенезе • • • • • • • • • Общие цели: - изучение роли микроРНК в молекулярных механизмах в норме и при нарушениях нормальной физиологии клеток, лежащих в основе разных патологических состояний. - установление диагностической значимости профилей микроРНК ассоциированных с онкологическими заболеваниями. - создание новых методов диагностики, контроля лечения и прогноза онкологических заболеваний человека. - разработка подходов создания комбинированной диагностики онкологических патологий с использованием платформ микроРНК и соматических мутаций. Задача №1. Определить вариацию уровней экспрессии микроРНК в разных гистопатологических типах опухолей щитовидной и молочной желез, головного мозга сравнительно с условно нормальными клетками. Задача №2. Установить диагностические значения в норме и при патологии. Задача №3. Отличать состояния «рак» и «отсутствие рака» Задача №4. Выявить маркеры, связанные с риском злокачественной трансформации Методический подход определения уровня экспрессии микроРНК в раковых клетках vs прилежащих нормальных клеток у одного пациента. miR-155 Условная норма miR-205 miR-21 miR-221 miR-222 U6 Схема детекции миРНК с помощью обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени Опухоль vs Норма опухоль 2^(-ddCt) miR-155 0,933033 miR-205 1,310393 miR-21 1 miR-221 0,521233 miR-222 0,473029 7 Разработка подходов и создание прообраза диагностической панели на основе микроРНК. • • ПРИМЕНЕНИЕ диагностической панели на основе микроРНК МикроРНК в диагностике и прогнозе Опухоли головного мозга • Рак щитовидной железы • Рак молочных желез Панель миРНК Общие миРНК miR-21 miR-221 miR-222 Специфические миРНК miR-323 miR-224 miR-181b miR-146b miR-200a miR-31 Диагноз Пациент А Фолликулярная аденома Пациент Б Папиллярный рак Пациент В Условная норма Пациент Г Другой тип опухоли • Ранняя диагностика • Определение гистотипа опухоли, стадии развития, потенциала к метастазированию • Контроль эффекта терапевтического воздействия (химио и радиотерапия) • Прогностическое значение выживаемости • Потенциальная терапия Распределение образцов опухолей головного мозга на основе анамнеза 3% (2) 2% (1) 6% (4) 7% (5) Глиобластома 14% (10) 10% (7) Астроцитомы Менингиома 21% (15) Метастаз карциномы Эпендимома Невринома 37% (26) Медуллобластома Прочие Всего - 70 Распределение образцов РЩЖ на основе анамнеза 1% 4% Распределение образцов РМЖ на основе анамнеза 2% (2) (3) (7) 18% (33) 21% (16) Фиброаденома Инвазивный протоковый рак 79% (61) Всего - 77 33% (61) Опухолеподобные поражения Фолликулярная аденома Папиллярная карцинома Медулярная\ карцинома 42% (77) Анапластический рак Фолликулярная карцинома Всего - 183 МикроРНК при папиллярном раке и коллоидном узле щитовидной железы Уровень экспрессии, усл. единицы Сравнение уровней экспрессии микроРНК при папиллярном раке и коллоидном узле 50 45 40 35 Коллоидный узел 30 Папиллярный рак 25 20 15 10 5 0 miR-21 miR-221 miR-222 miR-155 miR-205 микроРНК 10 МикроРНК при фолликулярной аденоме и фолликулярном раке 60 40 Фолликулярная аденома 20 Фолликулярный рак 0 miR21 miR221 miR222 miR155 miR205 -20 11 Глиомы 35,00 Диффузная астроцитома Анапластическая астроцитома 30,00 Глиобластома И зм ен ен ие ур ов ня м иР Н 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 -5,00 миР-21 миР-221 миР-222 миР-155 миР-205 -10,00 -15,00 -20,00 Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль миР-126 миР-451 Мир-21 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ миР-21 Из ме не ни е ур ов ня ми РН К 35,00 Менингиома ГМ Диффузна я а строцитома ГМ Ана пла стическа я а строцитома ГМ Глиобла стома ГМ 30,00 ОПП ЩЖ Фолликулярна я а денома ЩЖ 25,00 Фолликулярна я ка рцинома ЩЖ 20,00 Па пиллярна я ка рцинома ЩЖ Протокова я ка рцинома МЖ 15,00 10,00 5,00 0,00 Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль -5,00 Мир-205 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ миР-205 Из ме не ни е ур ов ня ми РН К 15,00 Менингиома ГМ Диффузная астроцитома ГМ Анапластическая астроцитома ГМ Глиобластома ГМ 10,00 ОПП ЩЖ Фолликулярная аденома ЩЖ 5,00 Фолликулярная карцинома ЩЖ 0,00 Папиллярная карцинома ЩЖ Протоковая карцинома МЖ -5,00 -10,00 -15,00 Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль -20,00 МикроРНК в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ миР-221 Менингиома ГМ миР-222 Диффузная астроцитома ГМ Из ме не ни е ур ов ня ми РН К 50,00 Анапластическая астроцитома ГМ Глиобластома ГМ 40,00 ОПП ЩЖ 30,00 Фолликулярная аденома ЩЖ Фолликулярная карцинома ЩЖ 20,00 Папиллярная карцинома ЩЖ 10,00 Протоковая карцинома МЖ Из ме не ни е ур ов ня ми РН К 50,00 Анапластическая астроцитома ГМ Глиобластома ГМ 40,00 ОПП ЩЖ Фолликулярная аденома ЩЖ 30,00 Фолликулярная карцинома ЩЖ 20,00 Папиллярная карцинома ЩЖ Протоковая карцинома МЖ 10,00 -10,00 -10,00 Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль -20,00 -20,00 миР-155 30,00 Менингиома ГМ ОПП ЩЖ Фолликулярная аденома ЩЖ 20,00 Фолликулярная карцинома ЩЖ Папиллярная карцинома ЩЖ 15,00 Протоковая карцинома МЖ 10,00 5,00 миР-205 Диффузная астроцитома ГМ Анапластическая астроцитома ГМ Глиобластома ГМ 25,00 Из ме не ни е ур ов ня ми РН К 15,00 Менингиома ГМ Диффузная астроцитома ГМ Анапластическая астроцитома ГМ Глиобластома ГМ 10,00 ОПП ЩЖ Фолликулярная аденома ЩЖ 5,00 Фолликулярная карцинома ЩЖ 0,00 Папиллярная карцинома ЩЖ Протоковая карцинома МЖ -5,00 -10,00 -15,00 0,00 Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль -5,00 Диффузная астроцитома ГМ 0,00 0,00 Из ме не ни е ур ов ня ми РН К Менингиома ГМ Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль -20,00 При объединении классов «аденома» и «ОПП» точность метода C4.5 была значительно увеличена. Матрица несоответствий Заболевание чувствительность специфичность общая точно сть ОПП/аденома 0.975 0.962 0.970 ОПП/аденома ОПП/аденом а карцинома 39 1 1 25 карцинома карцинома 0.962 0.975 0.970 Общая ошибка 0.030 Общая ошибка при кроссвалидации 0.133 РЕЗЮМЕ. МикроРНК в диагностике опухолей Создан прообраз платформы на основе микроРНК для диагностики онкологических заболеваний, что позволит: • Дифференцировать доброкачественные опухоли от злокачественных новообразований • Контролировать эффект терапевтического воздействия (лучевая и химиотерапия) • Выявлять различные патоморфологические типы опухолей • Разработать алгоритмы ранней диагностики онкологических заболеваний • ПРИМЕНЕНИЕ • Ранняя диагностика • Определение гистотипа опухоли, стадии развития, потенциала к метастазированию • Контроль эффекта терапевтического воздействия (химио и радиотерапия) • Прогностическое значение выживаемости • Потенциальная терапия Создание панелей для диагностики онкологических заболеваний человека на основе молекулярных маркеров - микроРНК и соматических мутаций УЧАСТНИКИ ПРОЕКТА: • • • • • • • • • • • • • • • Титов Сергей Евгеньевич - Вектор-Бест, ИМКБ СО РАН, Веряскина Юлия Андреевна - ИМКБ СО РАН Ахмерова Лариса Григорьевна - ИМКБ СО РАН Иванов Михаил Константинович – Вектор-Бест Жимулев Игорь Федорович - ИМКБ СО РАН Гуляева Людмила Федоровна - ИМББ СО РАМН Деменков Павел Сергеевич - ИЦиГ СО РАН Шевченко Сергей Петрович - МБУЗ № 1 Карпинская Елена Владимировна - МБУЗ № 1 Козлов Вадим Викторович - НООД Войцицский Владимир Евгеньевич - НООД Сидоров Сергей Васильевич - МБУЗ № 1 Ступак Вячеслав Владимирович - ФГБУ НИИТО Лехнер Андрей Вячеславович - ФГБУ НИИТО Садовой Михаил Анатольевич - ФГБУ НИИТО • При поддержке фирмы БИОРАД Сибирское отделение Анти-МиР- терапия Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma (Babar et al.,PNAS,June 8, 2012) Регрессия лимфомы после доставки уникальных наночастиц с анти-миР-155 в лимфоциты • Благодарю за внимание. dual function: as oncogene or tumor-suppressor Гипотезы 1+2 Создание панелей для диагностики онкологических заболеваний человека на основе молекулярных маркеров - микроРНК и соматических мутаций в онкогенах • • • • • • • • • • • • • • Н.Н. Колесников, С.Е. Титов, Е.В. Карпинская, C.П. Шевченко, Ю.А. Веряскина, Л.Г. Ахмерова, М.К. Иванов , Л.Ф. Гуляева , В.В. Ступак, А.В. Лехнер, М.А. Садовой , В.В.Козлов, С.В.Сидоров, И.Ф.Жимулев • ИМКБ СО РАН, Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН; • ЗАО «Вектор-Бест»; • Городская клиническая больница №1 г.Новосибирска; • ИМББ СО РАН, Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАН; • Новосибирский НИИ травматологии и ортопедии Минздравсоцразвития РФ • Новосибирский онкологический диспансер Операционный материал Опухолевые и нормальные ткани были получены от 183 пациентов с различными типами новообразований щитовидной железы: Основные классы опухолей и опухолеподобных заболеваний щитовидной железы. (в соответствии с международной гистологической классификацией ВОЗ 2-го пересмотра (1988 гг.). Распределение образцов РЩЖ на основе анамнеза 1% 4% 2% (2) (3) (7) 18% (33) 33% (61) Опухолеподобные поражения Фолликулярная аденома Папиллярная карцинома Медулярная\ карцинома 42% (77) 1.1.1.Фолликулярная аденома ФА 77 1.2.1. Фолликулярная карцинома ФК 7 1.2.2. Папиллярная карцинома ПК 61 1.2.3. Медуллярная карцинома МК 3 1.2.4. Анапластическая карцинома АК 2 7. Опухолеподобные поражения ОПП 33 Анапластический рак Фолликулярная карцинома Всего - 183 микроРНК в опухолях молочной железы микроРНК для диагностики рака молочной железы Эффект лучевой (А) и химиотерапии (Б) на профиль экспрессии микроРНК при инвазивном раке молочных желез. Распределение образцов РМЖ на основе анамнеза 21% (16) Б А Фиброаденома Инвазивный протоковый рак 79% (61) изменение профиля экспрессии микроРНК в раковых клетках по сравнению с нормой. 50 Изменение уровня миРНК при патологии по отношению к контролю Протоковая карцинома МЖ Фиброаденома 16 Инвазивный протоковый рак 61 Всего 77 Папиллярная карцинома ЩЖ 40 30 20 10 0 -10 миР-21 миР-221 миР-222 миР-155 -20 Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль миР-205 Веряскина и др.,2012, Колесников и др., 2013 Опухоли головного мозга проанализированные по 7 миРНК в зависимости от их гистотипа (Колесников и др.,2013) Гистоструктура Число слу чае в % Степень злокачественно сти (Grade)* Глиобластома 10 14.3 Астроцитомы 15 21.4 пилоцитарная (1) I диффузная (4) II анапластическая (10) III IV Эпендимома 1 1.4 I Медуллобластома 2 2.8 IV Менингиома 26 37.1 Невринома 4 5.7 Метастаз карциномы 7 10.0 Прочие 5 7.1 Всего 70 100 I I Распределение образцов опухолей головного мозга на основе анамнеза 3% (2) 2% (1) 6% (4) 7% (5) 10% (7) Глиобластома 14% (10) Астроцитомы Менингиома 21% (15) Метастаз карциномы Эпендимома Невринома 37% (26) Медуллобластома Прочие МикроРНК как биомаркеры. Анализ операционного материала с предоставленным гистологическим заключением • МикроРНК в опухолях ЩЖ • МикроРНК в опухолях МЖ • МикроРНК в опухолях головного мозга • • • • • Проанализировано: ЩЖ – 183 образца, МЖ – 77 образцов, ОГМ – 70 образцов Всего - 330 Главные признаки раковой клетки. • • • • • • • • • • • • • • • • • Автономия ростовых сигнальных путей : Самодостаточность в ростовых сигналах: раковые клетки продуцируют свои собственные ростовые сигналы и способны к пролиферации без внешних стимулов. Невосприимчивость к антиростовым сигналам: Раковые клетки уклоняются от воздействия антиростовых стоп-сигналов для того, чтобы пролиферировать. Избегание апоптоза: Опухолевые клетки уклоняются от апоптоза ( программированной клеточной смерти) и увеличиваются в числе. Стабильный ангиогенез: Раковые клетки индуцируют и обеспечивают рост новых кровеносных сосудов Неограниченный потенциал репликации: ДНК опухолевых клеток может воспроизводиться неограниченное число раз. Инвазия в другие ткани и метастазирование: Опухолевая масса порождает клетки-первопроходцы, колонизирующих места в организме с неограниченным питанием и пространством. 4 Дополнения к признакам раковой клетки: + дерегуляция энергетики клетки + избегание воздействия иммунной системы + хромосомные нарушения и нестабильность ДНК + воспалительные процессы Cell, January, 2000, March, 2011, Douglas Hanahan and Robert Weinberg. Попарное сравнение двух групп образцов с помощью U-критерия Манна-Уитни 40 узлы 30 рак Изменение уровня миРНК при патологии по отношению к контролю 35 25 20 15 10 5 0 -5 миР21 миР221 миР222 миР155 миР205 -10 Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль U Группа 1: Узлы/Группа 2: Рак p Размер выборки Узлы Рак миР-21 59,5 0,000258 15 26 миР-221 22 0,000003 15 26 миР-222 31 0,00001 15 26 миР-155 125,5 0,438922 13 23 миР-205 167 0,680952 14 26 Изменение уровня экспрессии пяти микроРНК в разных гитопатологических типах опухолей ЩЖ 40 ОПП Фолликулярная аденома 30 Папиллярная карцинома 20 10 0 миР-21 -10 -20 миР-221 миР-222 миР-155 миР-205 Мир-221 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ миР-221 Менингиома ГМ Диффузная астроцитома ГМ Из ме не ни е ур ов ня ми РН К 50,00 Анапластическая астроцитома ГМ Глиобластома ГМ 40,00 ОПП ЩЖ 30,00 Фолликулярная аденома ЩЖ Фолликулярная карцинома ЩЖ 20,00 Папиллярная карцинома ЩЖ 10,00 Протоковая карцинома МЖ 0,00 -10,00 Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль -20,00 Мир-222 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ миР-222 Из ме не ни е ур ов ня ми РН К 50,00 Менингиома ГМ Диффузная астроцитома ГМ Анапластическая астроцитома ГМ Глиобластома ГМ 40,00 ОПП ЩЖ Фолликулярная аденома ЩЖ 30,00 Фолликулярная карцинома ЩЖ 20,00 Папиллярная карцинома ЩЖ Протоковая карцинома МЖ 10,00 0,00 -10,00 Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль -20,00 Мир-155 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ миР-155 Из ме не ни е ур ов ня ми РН К 30,00 Менингиома ГМ Диффузная астроцитома ГМ Анапластическая астроцитома ГМ Глиобластома ГМ 25,00 ОПП ЩЖ Фолликулярная аденома ЩЖ 20,00 Фолликулярная карцинома ЩЖ Папиллярная карцинома ЩЖ 15,00 Протоковая карцинома МЖ 10,00 5,00 0,00 Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль -5,00 Мир-205 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ миР-205 Из ме не ни е ур ов ня ми РН К 15,00 Менингиома ГМ Диффузная астроцитома ГМ Анапластическая астроцитома ГМ Глиобластома ГМ 10,00 ОПП ЩЖ Фолликулярная аденома ЩЖ 5,00 Фолликулярная карцинома ЩЖ 0,00 Папиллярная карцинома ЩЖ Протоковая карцинома МЖ -5,00 -10,00 -15,00 Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль -20,00