Г.И.Филипенко Методы ex situ сохранения генетических
реклама
Методы ex situ сохранения генетических ресурсов растений G.Filipenko@vir.nw.ru http://www.cbd.int/ Конвенция о биологическом разнообразии – первое глобальное соглашение по сохранению и устойчивому использованию биологического разнообразия http://ruschm.org • Конвенция вступила в силу 29 декабря 1993 года, через восемнадцать месяцев после того, как на Конференции ООН по окружающей среде и развитию, прошедшей в 1992 году в Рио-де-Жанейро, она была открыта для подписания. • Более 150 правительств подписали этот документ сразу после вступления его в силу, а к настоящему моменту Конвенция ратифицирована 188 странами. Россия подписала Конвенцию в 1995 г. Сохранение биологического разнообразия • «Сохранение ex-situ» означает сохранение компонентов биологического разнообразия вне их естественных мест обитания. • «Сохранение in-situ» означает сохранение экосистем и естественных мест обитания, а также поддержание и восстановление жизнеспособных популяций видов в их естественной среде, а применительно к одомашненным или культивируемым видам - в той среде, в которой они приобрели свои отличительные признаки. Ex situ: плюсы и минусы Сосредоточенность растительного разнообразия как исходного материала в одном месте, в искусственно контролируемых условиях. Относительная безопасность и гарантия сохранения. Возможность последовательного и целенаправленного изучения, а также – ускоренного использования в селекции. Оперативная доступность для пользователя. Централизованное управление, возможность обработки данных, создание единой БД. Возможность постоянного учета и контроля за продвижением материала. Cохраняются лишь отдельные фрагменты популяций: отдельные растения, семена, ДНК, пыльца или вегетативные части растений. Состав коллекции постепенно обедняется в связи с постоянным пересевом и механическими потерями. Содержание коллекций и их поддержание в живом виде связано с большими финансовыми затратами. Наличие штата научных сотрудников и технического персонала для работы с коллекцией и необходимость их профессиональной подготовки Ex situ хранение генетических ресурсов растений Контролируемые условия Неконтролируемые условия Низкотемпературное хранение семян (+4°С; –10°С ; –18°С) Полевые коллекции Криоконсервация вегетативно размножаемых культур In vitro коллекции вегетативно размножаемых культур Хранение семян в лабораторных условиях Ультрасухие семена Организация генетических банков растений США - 1958 г. Япония - 1976 г. СССР - 1976 г. Турция – 1978 г. Скандинавские страны -1978 г. 5 основных генбанков мира (FAO, 2009) 1750 генбанков мира сохраняют 7,03 млн. образцов (FAO, 2009) Мировые ex situ коллекции 10 экономически значимых культур (FAO, 2009) КУЛЬТУРЫ ЧИСЛО ОБРАЗЦОВ 1. Пшеница 857940 2. Рис 773847 3. Кукуруза 327931 4. Фасоль (бобы) 262369 5. Сорго 235711 6. Соя 229947 7. Овес 148260 8. Арахис 128461 9. Картофель 99253 10. Горох 93977 КОЛЛЕКЦИИ СТРАН СНГ Страна РОССИЯ (ВИР) УКРАИНА УЗБЕКИСТАН Число образцов 324 000 (54,1%) 130 000 (21,7%) 55 000 (9,2%) КАЗАХСТАН БЕЛАРУСЬ ГРУЗИЯ 35 000 (5,8%) 32 000 (5,3%) 7 000 (1,1%) АРМЕНИЯ МОЛДОВА КИРГИЗИЯ 5 000 (0,9%) 5 000 (0,9%) 3 000 (0,5%) ТАДЖИКИСТАН ВСЕГО 3 000 (0,5%) 598 000 Svalbard Global Seed Vault Отправка образцов коллекции ВИР в хранилище на Шпицбергене в 2008-2011 гг. 10 марта 2010 года число образцов, поступивших из 27 генбанков, превысило 500 000 Бобы Вигна Горох 260 30 48 Кукуруза Маш Люпин 989 150 24 Нут Овес Сорго 71 210 257 Рапс Рожь Мягкая яровая пшеница Твердая пшеница Фасоль Чечевица обыкновенная Чина Ячмень Всего 100 93 847 51 81 139 9 803 4162 Nelumbo nucifera Gaerth. На дне высохшего озера в Маньчжурии были найдены семена индийского лотоса, пролежавшие там, как предполагалось сначала, 160 лет (Ohga I., 1926) Позже при помощи метода определения распада радиоактивного углерода было показано, что возраст этих семян 1040±210 лет (Libby W.F., 1951) В1954 году в северо-западной части Канады при археологических раскопках на плато Юкон в толще промерзшего ила были обнаружены семена люпина арктического . Ученые определили, что им 10 000 лет. Семена прорастили в 1966 году, шесть проросли, дали всходы, и из них выросли здоровые растения (Porsild A.E., Harington C.R., 1967) В 1990-2001 гг. при исследовании лессово-ледовых отложений приморских низменностей севера Якутии, относимых к эпохе позднего плейстоцена, неоднократно встречались погребенные норы грызунов, содержащие плоды и семена растений. Их численность в отдельных норах достигала 600-800 тысяч штук. Использование метода культуры тканей для анализа жизнеспособности семян из нор грызунов, погребенных в вечномерзлотных толщах Вид растений Сем. Осоковых Возраст семян 32800±400 Смолевка 32800±400 Костянка 27700±300 Горец 31800±300 Полученный результат Разрастание семядоли у единичного семени Индукция начальной стадии прорастания зародышевого корешка и каллусообразование на основе полученных клеток корня Активация роста зародышевого корешка Развитие до стадии образования семядольных листьев у единичного семени П. Беккерель исследовал жизнеспособность семян, полученных им из хранилищ парижского Национального музея. Семена были собраны в период с 1819 г. по 1853 г., а способность их к прорастанию изучалась в 1906 г. и затем в 1934 г. Для 13 видов П.Беккерель установил длительность жизни, равную 55-158 г.г., а для ряда видов семейства бобовых - около 200 лет (Becquerel P., 1932, 1934) Astragalus massiliensis Lam. Cassia bicapsularis L. Классификация семян по долголетию • Микробиотики ( меньше 3 лет) • Мезобиотики (3-15 лет) • Макробиотики ( больше 15 лет) Ewart A.J. On the longevity of seeds. Proc. Roy. Soc, Victoria. 1908. 21, 1210 Ewart, Alfred J. (1872 - 1937) Макробиотики • • • • • • • • • • • • • • • Бобы Вика Вигна Горох Лен Нут Мягкая пшеница Овес Просо Свекла Твердая пшеница Хлопок Чечевица Эгилопс Ячмень Мезобиотики Горчица Кукуруза Кунжут Подсолнечник Рожь Редкие виды пшениц Тритикале Фасоль Микробиотики Гречиха Кабачки Лук Рис Соя Примеры долголетия семян в опытах лаборатории семеноведения ВИР Культура Гречиха Соя Кукуруза Бобы Лен Просо Пшеница Ячмень Срок хранения 39 40 54 42 37 40 65 54 Всхожесть 40 24 95 99 99 95 22 78 Условия хранения, влияющие на долголетие семян • Температура • Влажность • Парциальное давление кислорода Снижение температуры на каждые 5° увеличивает продолжительность жизни семян примерно в два раза . Это правило верно в пределах 0 до 50 °С (Леман Е., Айхеле Ф., 1936, HurringtonJ,F., 1963) Температуры ниже нуля благоприятно сказываются на сохранении жизнеспособности семенами, если их влажность не настолько велика, чтобы в них произошло повреждение клеток и тканей от промерзания (Von Sengbush, 1955) Увеличение влажности на 1% в интервале от 5 до 15% укорачивает вдвое период их жизнеспособности (Hurrington J.F., 1963) Величины критической влажности зерна и семян различных культур (%): гороха, фасоли, чечевицы - 15...16 пшеницы, ржи, ячменя - 14,5...15,5 кукурузы, пpoca, сорго, столовой свеклы 12,5...14 томатов – 11,5…12,5 подсолнечника (среднемасличного), моркови - 10...11 огурцов - 9,5...10,5 капусты – 9…10 подсолнечника (высокомасличного) – 0…8 • Рекальцитрантные семена содержат большое количество влаги, их нельзя высушивать при хранении ниже определенного уровня, который у них довольно высок. К рекальцитрантным относят семена древесных, тропических, цитрусовых и некоторых других видов растений. • Ортодоксальные семена можно высушивать до низкого уровня влажности -5% и даже ниже. К ним относятся семена подавляющего большинства культурных видов растений (Hong T.D., Ellis R.H.,1996) Влияние длительного хранения семян пшеницы сорта Диамант на их всхожесть Всхожесть,% 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Исходная всхожесть 99, исходная влажность 7,1 Исходная всхожесть 94, исходная влажность 7,1 Исходная всхожесть 99, исходная влажность 5,0 0 10 15 20 25 30• Число лет хранения Хранение семян в условиях контролируемой температуры и влажности показало, что увеличение парциального давления кислорода с 0 до 21% ведет к снижению всхожести. Дальнейшее его увеличение практически никакого действия не оказывает ( Abdalla F.H., Roberts E.H., 1968) В долговременных опытах по хранению лука и салата было показано, что семена лучше сохраняют жизнеспособность в ампулах с углекислым газом, чем с кислородом (Harrington B.J., 1966) Другие факторы, влияющие на жизнеспособность семян при хранении • • • • • • • • Всхожесть Наследственные факторы Матрикальная разнокачественность Фазы спелости Место выращивания Болезни и вредители Фумигация Механические повреждения Генетические изменения в семенах при длительном хранении Cемена Oenotera lamarkiana L. хранившиеся в течение пяти лет, дали значительно больше фенотипических вариантов, чем семена, хранившиеся в течение одного года (DeVries, 1901). Аналогичные результаты получил в 1931 году Н.Г.Нильссон, работавший с тем же видом (Nilsson N.H., 1931). В 1933 году М.С.Навашин, исследовавший семена скерды (Сrepis tectorum L.), обнаружил, что только 0,1% проростков свежих семян имели в корнях клетки с хромосомными транслокациями, в то время как после 7 лет хранения число таких растений возросло до 81%. Ф.Х.Пето, изучавший семена кукурузы (Zea mays L.), также наблюдал возрастание частоты хромосомных аберраций в кончиках корней проростков длительно хранившихся семян (Peto F.H., 1933) В настоящее время в генетических банках растений коллекции принято подразделять на три типа • Базовые • Активные • Дублетные • Как правило, семена из базовых коллекций не предоставляют непосредственно пользователям. Материал из них берут только для восстановления образца, когда жизнеспособность семян снижается ниже допустимого уровня, или когда образец не может быть получен ни из какого другого источника. Базовая коллекция – “золотой фонд” генетического банка растений. • Активные коллекции содержат образцы, которые служат для восстановления, размножения, рассылки, изучения и т.д. • Дублетные коллекции представляют собой дублетные образцы базовой коллекции, которые хранят отдельно от нее, чтобы увеличить надежность хранения. • Термины “базовая” или “активная” коллекция не являются синонимами условий хранения образцов. Однако обычно базовые коллекции хранят в условиях, обеспечивающих их длительное хранение (long – term conservation). • Активные коллекции хранят в более мягких условиях, что связано, в основном, с экономическими причинами и, отчасти, с удобством пользования. Такие условия обеспечивают среднесрочное хранение коллекций (medium – term conservation)- обычно не менее 10-20 лет. Условия хранения базовых коллекций Условия хранения активных коллекций Допустимо: Температура ниже 0 (<0 °C) и 3-7% влажность семян (в зависимости от вида). Предпочтительно: -18 ° C или ниже и 3-7% влажность семян (в зависимости от вида). Активные коллекции могут храниться в условиях, которые позволяют сохранять жизнеспособность образцов на уровне не менее 65% в течение 10 – 20 лет Состав коллекции ВИР Отдел ГРР Число образцов Пшениц Овса, ржи и ячменя Крупяных культур Масличных и прядильных культур Многолетних кормовых культур Зерновых бобовых культур Овощных и бахчевых культур Плодовых культур Картофеля Всего 51662 36509 48358 27471 30489 45845 50138 23734 9647 323853 64 ботанических семейства, 376 родов, 2169 видов С целью сохранения базовой коллекции в 1976 году на Кубанской опытной станции ВИР было построено Национальное хранилище семян. Оно представляет собой трехэтажное здание, в котором два этажа находятся под землей. На этих этажах расположены 24 камеры для хранения семян. Каждая камера может вмещать 15- 20 тысяч образцов в зависимости от размера контейнеров. Количество образцов коллекции ВИР, сохраняемых при разных температурных режимах в «Кубанском генетическом банке семян» Тип коллекции Базовая Дублетная Активная Температура, °С 4,5 -18 4,5 -18 4,5 -18 Итого Количество образцов 184320 4092 51923 374 12835 1367 254911 Снижение всхожести образцов коллекции ВИР в процессе длительного хранения в «Кубанском генетическом банке семян» Группа культур Количество образцов, шт. Доля образцов, нуждающихся в пересеве, %% заложено требует пересева Зерновые и крупяные 29997 1046 3,5 Просовидные 10800 217 2,0 Зернобобовые 4534 379 8,4 Овощные и бахчевые 6042 269 4,5 Масличные и технические 2220 194 8,7 Кормовые 5625 314 5,6 59218 2419 4,0 Итого Данные по проращиванию образцов семян в 2005-2009 г.г. Образцы были заложены на хранение в 1976-1994 г.г. В 2000 г. в Санкт-Петербурге в зданиях ВИР были введены в строй новые низкотемпературные хранилища Основные сведения о новых низкотемпературных хранилищах ВИР № Тип коллекции Характеристика хранящихся образцов Объем, м³ Температура, º С Число контейнеров 1 базовая все 334 -10 2184 2 активная 50 -10 336 3 активная Микробиотики, перекрестноопыляемые, редкие, трудные в размножении 50 -10 336 4 активная 218,5 4 1488 5 активная 218,5 4 1488 Макробиотики, мезобиотики Лаборатория длительного хранения семян является членом ISTA • International Rules for Seed Testing, 2010 •ISTA Working Sheets on Tetrasolium Testing, 2003 •ГОСТ 12038-84 Методы определения всхожести •ГОСТ 12041-82 Методы определения влажности. Подсушивание семян перед закладкой на хранение в сушильной камере при 20°C и 12%-й относительной влажности воздуха до 3-7%-й влажности семян (в зависимости от вида) Упаковка: фольговые ламинированные пакеты и стеклянные бутылочки Примеры динамики подсушивания семян в сушилках ВИР Низкотемпературное хранение образцов семян мировой коллекции ВИР в центре (на 1.10.2011 г.) Отдел ГРР Базовая коллекция -10° С 7894 -10° С 4° С 7469 13461 10489 9176 13562 Зерновых бобовых 6229 7165 7845 13187 25630 31007 Овощных и бахчевых 9597 11065 18205 Масличных и прядильных культур 7345 15154 14526 Многолетних кормовых культур 7041 16162 5810 2314 403 - Плодовых культур 713 221 ЛДХГР 864 - 57558 82775 Пшениц Овса, ржи, ячменя Крупяных культур Картофеля Активная коллекция - Всего 122201 В общей сложности на хранении находятся 262534 образца В 2004 г. в ВИР введен в строй криокомплекс КРИОХРАНЕНИЕ – ПЕРЕДОВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ХРАНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ РЕСУРСОВ РАСТИТЕЛЬНЫЕ ОБЪЕКТЫ Семена АКТУАЛЬНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Актуально для семян редких видов МЕТОДЫ КРИОСОХРАНЕНИЯ Неконтролируемое замораживание Неконтролируемое замораживание Пыльца Вегетативные почки Нет другой альтернативы Нет другой альтернативы Ступенчатое замораживание Витрификация Инкапсуляция Культура тканей и органов in vitro Нет другой альтернативы Криоконсервация плодовых растений в ВИР Отработаны методики криоконсервации • • • почек яблони (P.Forsline,1998) пыльцы большинства плодовых и ягодных культур семян диких видов яблони, груши, вишни, красной и черной смородины, крыжовника, малины, ежевики Идет разработка и модификация методик криоконсервации • черенков и почек груши, жимолости синей, крыжовника, смородины черной, черемухи Идет закладка на длительное хранение в парах жидкого азота Почек и черенков яблони, груши, крыжовника, черемухи, черной смородины пыльцы большинства плодовых и ягодных культур семян диких видов яблони, груши, вишни, красной и чернойсмородины, крыжовника, малины, ежевики Криоконсервация пыльцы плодовых культур •Пыльцу, подсушенную в комнатных условиях в течение 2-3дней, закладывают в азот прямым погружением. • Жизнеспособность определяют посевом на питательную среду (сахароза 10-20% + 0,5% агар-агар), с последующим подсчетом проросших пыльцевых зерен под микроскопом в 3-хкратной повторности. Влияние криоконсервации на жизнеспособность пыльцы яблони Сорт Жизнеспособность, % исходная после хранения при-196 º С Ароматное 48,0 ± 1,0 39,1 ± 0,7 Боровинка 56,0 ± 1,3 48,4 ± 3,2 Вкусная 40,7 ± 2,6 59,9 ± 3,3 Июньское Петрова 20,7 ±1,8 17,6 ± 1,9 Ранетка консервная 41,7 ± 1,3 36,6 ± 1,7 Процент завязывания ягод сортов черной смородины Risager, Белоплодная и Лазурь при опылении пыльцой, хранившейся при 186°С , составил 94,3-100%. Методика криоконсервации семян диких видов яблони, груши, красной смородины и крыжовника •Подсушивание семян до влажности 5-6 %, быстрое замораживание путем прямого погружения пробирок с семенами в жидкий азот и оттаивание их при комнатной температуре. Определение жизнеспособности семян плодовых культур тетразольно-топографическим методом Влияние криоконсервации семян яблони на их жизнеспособность 100 80 60 40 Динамика прорастания семян яблони после низкотемпературного и криохранения 20 0 Суммарная доля проклюнувшихся семян, % 100 M. baccata var.sibirica 96,0 90,4 79,5 80 M. floribunda var.Nikita исходная 72,0 60 M. baccata 49,3 46,0 40 Malus purpurea M.sargentii M. soulardii M. cerasifera M. orientalis после криоконсервации 100 96,0 34,0 31,5 89,9 80 20 16,4 0 16,0 0,0 0,0 0 10 20 30 60 40 50 60 70 80 90 M. cerasifera 54,0 100 48,5 40 34,0 26,0 100 96,0 20 79,5 80 0 M. purperea 49,3 46,0 40 34,0 31,5 20 16,4 0,0 0,0 0 0 16,0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 4,0 0,0 0 72,0 60 28,3 18,2 90,4 10 20 30 2,0 40 50 60 криохранение (-196°С) 70 80 90 100 низкотемпературное хранение (-18°С) Криоконсервация Образцы нарезают на однопочковые сегменты спящих почек яблони длиной до 35 мм и подсушивают в холодильнике при 5 °C до влажности 28-32%. Замораживание до -30°C проводят в программном замораживателе, понижая температуру со скоростью 1°C/час, затем погружают образцы в жидкий азот. Вынутые из жидкого азота образцы выдерживают в течение суток в холодильнике при температуре 4° C в эксикаторах над парами воды для гидратации. Для проверки жизнеспособности обычно используется метод окулировки почек Метод контроля аутентичности образцов черемухи в процессе хранения при сверхнизких температурах, основанный на использовании молекулярного маркирования 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 ISSR М10 Контроль Опыт 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 ISSR 812 Контроль В ходе работы было протестировано восемь ISSR-праймеров, два из которых показали наиболее полиморфную картину ПЦР, позволяющую выявить генетические различия между анализируемыми сортами. Метод ISSR-профилирования ДНК позволяет установить степень целостности ДНК почек черемухи, а также подтвердить аутентичность генетического материала, сохраняемого при сверхнизких температурах в условиях генбанка. Опыт ISSR-анализ ДНК образцов черемухи, выделенной из почек до (контроль) и после (опыт) сохранения при сверхнизкой температуре. Сорта: 1- Ранняя круглая, 2- Ольгина радость, 3Августина, 4- Гранатовая гроздь, 5- Сахалинская устойчивая. Хранение образцов плодовых культур и картофеля в парах жидкого азота (на 1.10.11 г.) Культура Груша Жимолость синяя Земляника Картофель Крыжовник Малина Слива Смородина черная Черемуха Черешня Яблоня Всего Число сохраняемых образцов, шт. пыльца черенки 70 21 4 26 11 4 50 81 25 10 15 17 160 464 5 63 114
