Документ 4842950

Генетические задачи решаются легко
только тогда, когда они предварительно
уже
решены
другими.
Поэтому
необходимо предостеречь тех, кто
впервые приступает к генетическому
анализу, от уныния и пессимизма, если их
первые попытки окажутся неудачными.
Александр Сергеевич Серебровский
1.
2.
3.
4.
Технологии анализа ДНК.
Гель-электрофорез.
ПДРФ-анализ и его модификации.
Общие принципы гибридизации.
Понятие марекера. Классификация ДНК-маркеров.
Маркеры
генетический
–
локус
хромосомы,
определяющий
конкретный
фенотипический признак;
селективный – основной или дополнительный ген, кодирующий
устойчивость к селектируемому фактору (к антибиотику), который
вводят в генетическую систему (вектор) для последующего отбора
трансформантов.
молекулярный (зонд, проба) – кДНК или любой другой фрагмент ДНК,
используемый в реакциях гибридизации - для идентификации - получения
специфического сигнала либо выявления полиморфизма ДНК.
ДНК-маркеры можно классифицировать на основании различных
критериев (Karp et al., 1997):
• по характеру проявления (доминантный, кодоминантный);
• по механизму передачи (обоеполое наследование, наследование только по
материнской или отцовской линии);
•
по локализации в геноме (ядерная ДНК, хлоропластная ДНК,
митохондриальная ДНК);
• по уровню изменчивости (мономорфность, гипервариабельность).
Несмотря на различия в существующих методологических подходах к
анализу ДНК, изучение полиморфизма основано на разнице нуклеотидных
последовательностей сравниваемых образцов. Это различие может быть:
- количественным (варьирование длины ДНК-фрагментов образцов);
- качественным (изменчивость в последовательности нуклеотидов);
- комбинацией 1 и 2 (Schlotterer, 2004).
Основные способы выявления изменчивости
Изменчивость
определяется:
в
последовательности
1)
электрофизическими
последовательностей;
свойствами
нуклеотидов
изучаемых
2)
наличием/отсутствием
сайтов
рестрикции
–
полиморфизм длины рестрикционных фрагментов и его
модификации (RFLP, PCR-RFLP (САР) и др.);
3)
наличием/отсутствием
комплементарного
взаимодействия (отжига) образцов ДНК/РНК с фрагментами,
нуклеотидная последовательность которых как правило
заранее известна:
- классические методы гибридизации;
- гибридизация, усиленная ПЦР (RAPD, DAF, AP-PCR, ISSR
(RAMS), STS и др.);
4) прямым метод анализа нуклеотидной последовательности
нуклеиновых кислот – секвенированием;
5) с использованием различных комбинаций методов.
Основные прннципы постановки
и проведения гель-электрофореза
Разделение нуклеиновых кислот основано на том, что смесь
их макромолекул в определенных средах под действием
электрического поля делится на ряд фракций в зависимости
от размера фрагмента и конформационной структуры
(кольцевая форма, линейная и др.).
С помощью этой простой техники можно быстро
разделить такие смеси фрагментов ДНК, которые не могут
быть
разделены
другими
способами,
например,
центрифугированием в градиенте плотности.
Следует отметить, что наиболее распространенным
методом является гель-электрофорез, т. е. фракционирование
в специальных гелевых пластинах или блоках. В качестве
поддерживающих носителей наиболее часто применяют
агарозу и полиакриламид.
Основные прннципы постановки и проведения гель-электрофореза
Скорость миграции ДНК через гель при электрофорезе определяется
пятью главными параметрами (Maniatis et al., 1989):
Размер
молекул
ДНК.
Молекулы
линейной
двухцепочечной
ДНК перемещаются в геле предположительно одним концом вперед со
скоростями, обратно пропорциональными десятичному логарифму их
молекулярных масс.
Концентрация
геля.
Фрагменты
ДНК
определенного
размера
перемещаются в геле, содержащем разные концентрации носителя
(агароза, полиакриламид), с разными скоростями. Существует прямая
зависимость между логарифмом электрофоретической подвижности
ДНК и концентрацией геля.
Диапазон нормального разделения линейных dsDNA молекул для гелей с
различной концентрацией агарозы:
% агарозы
0.3
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.2
1.5
2.0
Размер
DNA [kbp] 5-60 1-30 1-20 0.8-12 0.6-10 0.5-8 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
Меньший предел определяется диффузией полосы в геле (в гелях с низкой
концентрацией агарозы мелкие фрагменты вполне разделяются, но полосы
не четкие). Верхний предел сильно зависит от напряженности поля, при
которой проводится форез. Чем меньше напряженность поля, тем более
длинные молекулы можно эффективно разделить.
Основные прннципы постановки и проведения гель-электрофореза
Конформация ДНК. Молекулы ДНК, имеющие одинаковую
молекулярную массу, но разные конформации, например,
кольцевую линейную, движутся с разными скоростями.
Напряженность
электрического
поля.
При
низких
напряженностях скорость перемещения фрагментов линейной
ДНК пропорциональна приложенному напряжению. Однако с
увеличением
напряженности
электрического
поля,
подвижность фрагментов ДНК с высокой молекулярной массой
дифференциально возрастает. Таким образом, с увеличением
напряженности область эффективного разделения ДНК в геле
снижается. Максимальное разделение фрагментов происходит
при напряженности не превышающей 5 В/см.
Состав оснований и температура. Электрофоретическое поведение
ДНК в агарозных гелях, в отличие от поведения в
полиакриламидных гелях, слабо зависит от состава оснований
ДНК или температуры геля. В агарозных гелях в области
температур от 4 до 30°С изменения относительной
электрофоретической подвижности фрагментов ДНК разного
состава не наблюдается.
Основные прннципы постановки и проведения гель-электрофореза
Конформация ДНК. Молекулы ДНК, имеющие одинаковую
молекулярную массу, но разные конформации, например,
кольцевую линейную, движутся с разными скоростями.
Соотношении подвижностей при умеренной (~6V/cm) скорости фореза
(в скобках - при более быстром разгоне ~10-20V/cm)
Размер суперскруч. Размер линейной DNA [kbp] для различных % агарозного геля
DNA [kbp]
0.7%
1%
1.5%
2%
2
1.2
1.3
1.3 (1.6)
1.5 (1.0)
3
1.7
1.8
2 (2.4)
2.9 (1.8)
4
2.2
2.3
2.7 (3.7)
5
2.7
2.9
3.5 (5.5)
6
3.2
3.5
5 (8.5)
7
3.9
4.2
8.5 (>12)
8
4.4
5.0
>12
9
5.1
5.9
10
5.8
6.8
12
7
8.7
Относительная подвижность линейных и кольцевых молекул зависит от условий
фореза: % геля, скорость фореза. В присутствии 0.5 µg/ml EtBr разрешение
релаксированной и суперскрученной pDNA увеличивается примерно в 20 раз при
повышении ионной силы буфера до 4хТАЕ. Того же увеличения можно добиться
понижая концентрацию EtBr.
Основные прннципы постановки и проведения гель-электрофореза
Напряженность
электрического
поля.
При
низких
напряженностях скорость перемещения фрагментов линейной
ДНК пропорциональна приложенному напряжению. Однако с
увеличением
напряженности
электрического
поля,
подвижность фрагментов ДНК с высокой молекулярной массой
дифференциально возрастает. Таким образом, с увеличением
напряженности область эффективного разделения ДНК в геле
снижается. Максимальное разделение фрагментов происходит
при напряженности не превышающей 5 В/см.
При оценке напряженности поля
для
горизонтального
фореза
принято
пренебрегать
конкретной геометрией камеры
и
измерять
расстояние
непосредственно
между
электродами.
На рисунке показана схема
форезов, при разном напряжении.
Форезы
проводились
разное
время,
так
чтобы 0.5kb фрагмент прошел одинаковое расстояние. Видно, что
проведение фореза при высоком напряжении эквивалентно уменьшению
длины геля.
Основные прннципы постановки и проведения гель-электрофореза
Состав оснований и температура. Электрофоретическое поведение
ДНК в агарозных гелях, в отличие от поведения в
полиакриламидных гелях, слабо зависит от состава оснований
ДНК или температуры геля. В агарозных гелях в области
температур от 4 до 30°С изменения относительной
электрофоретической подвижности фрагментов ДНК разного
размера не наблюдается.
Подвижность красителей,
используемых при проведении
агарозного гель-электрофореза
Основные прннципы постановки и проведения гель-электрофореза
Электрофоретическое разделение проводят в вертикальных
или горизонтальных электрофоретических камерах. Для
агарозных гелей чаще применяются горизонтальные
камеры, а для полиакриламидных гелей — как
горизонтальные, так и вертикальные типы камер.
После
электрофоретического
фракционирования гель кладут в
кювету,
где
и
производят
окрашивание.
Для
флюоресцирующего
окрашивания
применяют
растворы:
бромистого
этидия
–
визуализация под УФ светом (240360нм);
- SyberGreen – визуализация под
УФ светом и в видимой области
синего света (240-450нм);
- SyberGold (нитрат серебра)_- для
анализа в спектре видимого света.
Основные прннципы постановки и проведения гель-электрофореза
Минимальное количество ДНК, которое можно обнаружить при
использовании агарозного геля, окрашенного бромистым этидием,
составляет около 1-2 нг при ширине полосы до 0,5 см.
Максимальное количество ДНК, которое можно внести в лунку,
зависит от числа фрагментов в пробе и их размеров. Если лунка
будет переполнена (в полосе указанной ширины будет содержаться
более 200 нг ДНК), то полоса окажется расплывчатой и будет
иметь шлейф. Этот дефект особенно выражен при разделении
крупных фрагментов. При анализе простого набора молекул ДНК
вносят 0,2-0,5 мкг ДНК. Если же пробы содержат очень большое
число фрагментов ДНК разных размеров (например, рестрикты),
то можно наносить до 2-10 мкг в лунку, не опасаясь существенного
снижения разрешающей способности электрофореза.
Условия разделения подбираются эмпирически в зависимости от
типа камеры, длины и плотности геля, размеров лунки (глубина,
длина, ширина), напряженности электрического поля, типа
используемого буфера и непосредственн самого образца пробы ДНК
(РНК).
Основные прннципы постановки и проведения гель-электрофореза
Заключительным этапом электрофоретического анализа
является описание выявляемых спектров - определение
количества зон и их обозначение. Для типировки каждой
фракции используется числовая величина размера (в парах
нуклеотидов) фрагментов ДНК, находящихся в данной
электрофоретической фракции. Вычисление размера молекул
ДНК каждой зоны спектра производится на основании
сравнения электрофоретической подвижности данной зоны
относительно молекул ДНК с известным размером, так
называемым электрофоретическим маркером. Маркер может
представлять собой смесь однотипных или различающихся
по размерам молекул ДНК. Для каждой фракции маркера
известен размер молекул ДНК, которые их составляют. В
качестве маркера могут быть использованы рестрикционные
фрагменты
бактериофагов,
плазмид,
искусственно
синтезированные цепочки ДНК, ПЦР-продукты с известным
размером и др.
Основные прннципы постановки и проведения гель-электрофореза
Основные прннципы постановки и проведения гель-электрофореза
Анализ и расчет размера фрагментов проводят с помощью специального
программного обеспечения (Image Master, Quantity, TotalLab и др.). При их
отсутствии для маркера в конкретном геле можно самостоятельно
составить калибровочную кривую и, используя ее, вычислить размер
фракций для других образцов; или «на глазок».
Методы гельэлектрофореза, позволяющие выявить
гетерогенность ДНК по нуклеотидному составу:
SSCP (single strand conformation polimorphism) – метод анализа
конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, предложен M.Orita и
соавторами, 1993. ПЦР, ПААГ, 50-300 н.п. 70-95%.
DGGE (denaturation gradient gel electrophoresis) – метод денатурирующего
градиентного гель-электрофореза основан на зависимости свойств
плавления небольших двунитевых молекул ДНК от их нуклеотидной
последовательности, а точнее от соотношения А-Т и G-C пар (Майерс и
др., 1990). ПЦР, ПААГ, градиент температуры, мочевины или
формалдегида, 50-400 н.п. 1н – 50%, более 2 н. из 600 н.н. – 95% с
использованием GC-зажимов.
Рестрикция и рестриктазы
В 1962 году Арбер выявил особый тип ферментов — рестриктазы,
которые способны разрезать молекулы ДНК только в тех местах (сайтах
рестрикции), где имеется определенная последовательность нуклеотидов.
Однако активное использование рестриктаз для анализа ДНК началось в
70-х годах.
Рестриктирующие эндонуклеазы (или рестриктазы) - ферменты,
"узнающие" определенные последовательности (сайты рестрикции) в
двухцепочечной ДНК и расщепляющие молекулу ДНК в этих сайтах. Их
выделяют преимущественно из прокариотических клеток. Рестриктазы
можно разделить на три группы.
Ферменты типа I и типа III обладают модифицирующей
(метилирующей) активностью и АТР-зависимой рестриктирующей
активностью (внесение разрывов), проявляемыми одним и тем же белком.
Ферменты обоих типов узнают неметилированые последовательностив
ДНК-субстрате, но ферменты типа I вносят случайные разрывы, в то
время как ферменты типа III разрезают ДНК в специфических участках.
Системы рестрикции-модификации типа II включают два отдельных
фермента: рестриктирующую эндонуклеазу и модифицирующую
метилазу. Было выделено большое число ферментов рестрикции типа
II, многие из которых используются в молекулярной генетике. Эти
ферменты разрезают ДНК внутри или около своих сайтов, которые
обычно имеют 4-6 нуклеотидов и обладают осью симметрии 2-го
порядка.
Рестрикция и рестриктазы
Например, фермент EcoR I узнает последовательность
гексануклеотидов ГААТТЦ. Подобно многим другим
ферментам рестрикции, вносит разрыв не точно по оси
симметрии 2-го порядка, а в точках двух цепей ДНК,
отстоящих друг от друга на четыре нуклеотида. В
результате такого разрыва образуются фрагменты ДНК с
выступающими (липкими) 5'-концами).
Размер и количество рестрикционных фрагментов после
обработки молекулы ДНК, зависят от нуклеотидной
последовательности, длины молекулы ДНК и типа
используемой рестриктазы. Так, например, наиболее простые
рестрикционные спектры свойственны для вирусов и
плазмид, и представлены небольшим числом фракций. Спектры сложной структуры характерны для
эукариотических организмов. На электрофореграммах они
имеют вид сплошного шлейфа, состоящего из множества
отдельных, ранжированных по размеру фракций рестриктов от наиболее крупных до самых мелких.
ПДРФ-анализ
Сущность методов, основанных на сайт-специфической рестрикции,
заключается в расщеплении молекулы ДНК рестриктазами на
фрагменты, концевые участки которых представляют остатки
рестрикционных сайтов. Изменение нуклеотидного состава в образцах
может приводить к возникновению новых сайтов (участков ДНК,
имеющих
определенную
последовательность
нуклеотидов)
или
исчезновению ранее существовавших, тем самым, изменяя длину
участков, что и является отражением полиморфизма. Одним из первых
методов, основанных на определении изменений на уровне нуклеотидных
последовательностей,
явился
метод
RFLP
(Restriction
Fragment Length Polymorphism), или в русской транскрипции - ПДРФ
(полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов). Суть анализа
заключалась в сравнении рестрикционных спектров суммарной ДНК
исследуемых образцов. На основе этого метода были построены для
различных организмов рестрикционные карты их ДНК, т.е. установлено,
где именно в молекуле ДНК располагаются сайты рестрикции.
Следует отметить, что получаемые электрофоретические спектры
часто содержали значительное число фракций, интерпретация которых
была достаточно трудоемким процессом. Впоследствии этот метод был
скомбинирован с технологией полимеразной цепной реакции, что
позволило разработать широкий ряд методов анализа полиморфизма —
AFLP, PCR-RFLP, PCR-RFLP-SSCP.
ПДРФ-анализ
Основные методы гибридизации
В 1975 году Саузерн создал технологию анализа ДНК с
помощью метода гибридизации. Суть этой технологии
состоит
в
получении
рестрикционных
фрагментов
исследуемой ДНК, их электрофоретическом разделении,
перенесении на нитроцеллюлозный фильтр и проведении
реакции гибридизации со специфическим нуклеотидным
зондом (каким-либо определенным фрагментом ДНК,
наличие или отсутствие которого необходимо выявить в
анализируемом образце), помеченным с помощью изотопных
маркеров (Southern, 1975).
В настоящее время существует большое количество
модификаций гибридизации по Саузерну, различающихся
способами переноса ДНК на фильтры и типами используемых
зондов.
Позднее появились другие методы блот-гибридизации:
Нозерн-блоттинг — для визуализации фрагментов РНК;
Вестерн-блоттинг — для связывания электрофоретически
разделенных белков, фиксированных на фильтрах с мечеными
антителами.
Основные этапы проведения гибридизации по Саузерну
Для проведения гибридизации с меченой пробой исследуемые образцы ДНК
должны быть иммобилизированы на поверхности носителя. Для
микрочипов носителем являются специальные стеклянные или
полимерные пластины. Точечное нанесение образцов производится с
помощью специального автоматического устройства. В случае блотгибридизации образцы ДНК наносятся на поверхность нейлоновой или
нитроцеллюлозной мембраны. При переносе по Саузерну, продукты
электрофоретического фракционирования из геля переносятся на
мембрану с помощью специальной процедуры — блоттинга. Вследствие
применения различных приемов переноса выделяют три вида блоттинга:
капиллярный, вакуумный и электроблоттинг.
В целом процедура переноса заключается в следующем:
депуринизация ДНК в растворе соляной кислоты;
денатурация ДНК в щелочном растворе;
нейтрализация щелочного раствора;
перенос
денатурированной
ДНК
на
мембрану
в высокосолевом или среднесолевом буфере;
заякоривание ДНК - дополнительная иммобилизация перенесенных
фрагментов на мембране с помощью тепловой обработки или УФоблучения.
При блоттинге используется влажный, полусухой и сухой способ переноса
ДНК из геля на мембрану.
Основные этапы проведения гибридизации по Саузерну
Меченая проба – зонд представляет собой молекулу ДНК с известной
последовательностью. В качестве метящего агента в эту молекулу,
при ее синтезе in vitro, вводятся радиоактивные изотопы, например
Р32, или к уже готовой молекуле присоединяются нерадиоактивные
метящие агенты (термостабильная щелочная фосфатаза, биотин,
йодацетамидфлюоресцин и др.), способные вызывать при определенных
условиях флюоресценцию или люминесценцию, либо хромогенная детекция.
От применяемого метящего агента напрямую зависит разрешающая
способность пробы. Так, например, чувствительность радиоактивных
меток на порядок выше, чем щелочной фосфатазы. Однако сохранность
радиоактивных проб невысока, поскольку постоянно происходит потеря
удельной активности вследствие распада изотопов, в то время как
замороженные при -20°С нерадиоактивные пробы могут храниться в
течение нескольких лет без заметной потери сигнальных свойств. Также
следует
отметить,
что
используемые
в
настоящее
время
флюоресцентные красители по чувствительности анализа не уступают
радиоактивным меткам.
В ходе гибридизации происходит образование устойчивого комплекса
между исследуемой ДНК, иммобилизированной на носителе, и внесенной
меченой пробой. Для предотвращения неспецифического связывания
меченой пробы с мембраной в случае блот-гибридизации, перед ее
внесением проводят процедуру прегибридизации. Она заключается в
следующем: мембрану, содержащую образцы ДНК, некоторое время
инкубируют в растворе, который содержит блокирующий реагент.
Основные этапы проведения гибридизации по Саузерну
Обычно в качестве блокирующего агента выступают различные
препараты денатурированной ДНК: из спермы лосося, тимуса теленка,
цыпленка (в среднесолевых буферах часто импользуют молоко). В
результате достигается полная адгезия неспецифических мелких
фрагментов ДНК (блокирующий реагент) участками фильтра, не
связанными с образцами ДНК.
Далее в гибридизационный раствор вносится меченая проба. Важным
фактором, который определяет специфичность взаимодействия
образец-проба, является температура, при которой происходит
гибридизация. Обычно она варьирует от 40 до 80°С. Следует отметить,
что более высокие значения данного температурного интервала
обеспечивают наибольшую специфичность связывания. Однако, в случае
использования нерадиоактивных проб (с щелочной фосфатазой, хемо- или
флюоресцирующих) температура не должна превышать 65°С, т. к. это
может привести к денатурации фермента.
После проведения гибридизации (4-16 часов) блот отмывают в
специальных буферных растворах для удаления несвязавшейся пробы.
Температура отмывки мембраны не должна превышать те значения, при
которой велась гибридизация, т. к. это также влияет на устойчивость
образовавшегося комплекса образец-проба. Обычно на первых этапах
отмывки эта температура совпадает с температурой, при которой велась
гибридизация, на последующих – она ниже.
Основные этапы проведения гибридизации по Саузерну
Отмытый блот проявляют.
В случае использования радиоактивной метки мембрану заворачивают в
пленку и экспонируют ее с рентгеновской пленкой либо на радиосканере.
Пленку проявляют. После проявки пленки на негативе радиограмм
гибридные зоны выявляются в виде темных полос на светлом фоне.
В случае использования флюоресцентной или люминесцентной метки
мембрану обрабатывают реагентами, вызывающими флюоресценцию или
люминесценцию меченых молекул, заворачивают в пленку и экспонируют
либо с ренгеновской пленкой, либо на сканере. Пленку проявляют. После
проявки пленки на негативе гибридные зоны выявляются в виде темных
полос на светлом фоне.
В случае использования ферментативной метки и хромогенного субстрата
мембрану обрабатывают реагентами, вызывающими химическую (как
правило цветную) реакцию по превращению бесцветного субстрата в
окрашенный продукт и его мобилизацию на мембране. После химической
экспозиции реакцию останавливают, мебрану заворачивают в пленку и
подвергают анализу. Гибридные зоны выявляются в виде темных полос на
светлом фоне.