Цитокинодиагностика: прошлое, настоящее и будущее Тотолян Арег Артемович Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Национальные дни лабораторной медицины России-2011 Москва, 5 октября 2011 года Цитокины – регуляторные белки, секретируемые лейкоцитами крови и другими клетками организма человека, плейотропные эффекты которых включают регуляцию клеток иммунной системы и модуляцию воспалительной реакции ЦИТОКИНЫ • Интерлейкины • Факторы некроза опухолей • Интерфероны • Колониестимулирующие факторы • Факторы роста негемопоэтических клеток • Хемокины • Конститутивные • Индуцибельные – провоспалительные – противовоспалительные Основные характеристики действия цитокинов Характеристика Плейотропность Комментарии Большинство цитокинов имеют много клеток-мишеней Избыточность эффектов Один цитокин имеет множество биологических эффектов Синергизм/Антагонизм Одновременное влияние на клетки двух или нескольких цитокинов может привести к качественно различным эффектам Цитокиновый каскад Цитокины могут повысить (или снизить) продукцию других цитокинов Модуляция рецепторов Цитокины могут повысить (или снизить) экспрессию рецепторов для других цитокинов МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СИСТЕМЫ ЦИТОКИНОВ Цитокины СИНТЕЗ • молекулярно-биологические – мРНК – планарные микрочипы • иммунохимические – проточная цитометрия • внутриклеточное содержание – иммуноцитохимический ПРОДУКЦИЯ • иммунохимические – ИФА – проточная цитометрия • концентрация (мультиплексный анализ) БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ • биологические – хемотаксис – пролиферация – дегрануляция и т.д. Рецепторы цитокинов СИНТЕЗ • молекулярно-биологические – мРНК – планарные микрочипы ЭКСПРЕССИЯ • иммунохимические – проточная цитометрия Клеточные линии для оценки биологической активности цитокинов Цитокины Клеточные линии Способ оценки активности Другие цитокины, активные в данном тесте ИЛ-1 Перв.культ. Пролиферация ИЛ-2, ИЛ-6; ИЛ-4, ФНО D10S Пролиферация ИЛ-2 ИЛ-2 CTLL-2 Пролиферация ИЛ-15, ТФР ИЛ-3 TF-1 Пролиферация ИЛ-4,5,9,13, ГМ-КСФ ИЛ-4 CTLL-2 Пролиферация ИЛ-15, ТФР ИЛ-6 B9 Пролиферация ИЛ-11, ИЛ-13 ИЛ-8 Перв.культ. Миграция Некоторые хемокины ИЛ-12 KIT-225 Пролиферация ИЛ-2,4,7,15,21 ИЛ-18 KG-1 Синтез ИФН-γ ИЛ-12, ИЛ-21 ФНО L929 Цитотоксичность Лимфотоксин ГМ-КСФ TF-1 Пролиферация ИЛ-3,4,5,9,13, ЭПО ИФН-α Перв.культ. Антивирусная активность А-549, 2D9, Daudi Антивирусная активность, продукция белка MxA Другие типы ИФН, видоспецифично А-549 Антивирусная активность Другие типы ИФН WiDr Подавление пролиферации - ИФН-γ Сравнительный анализ методов определения цитокинов Характеристика Биологические методы Выявляет только биологически активные молекулы Специфичность недостаточная (биологически активности различных цитокинов интерферируют); необходимо подтверждать с помощью нейтрализующих антител Интерференция специфические и неспецифические нативные ингибиторы цитокинов, антицитокиновые антитела Чувствительность Точность Длительность Иммунохимические методы число доступных эпитопов (биологически активные и неактивные молекулы) очень высокая белки сыворотки крови, компоненты комплемента, антицитокиновые антитела, ревматоидный фактор высокая очень высокая низкая (CV может достигать 100%) высокая (CV в пределах 5-10%) 1-4 дня несколько часов МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СИСТЕМЫ ЦИТОКИНОВ Цитокины СИНТЕЗ • молекулярно-биологические – мРНК – планарные микрочипы • иммунохимические – проточная цитометрия • внутриклеточное содержание – иммуноцитохимический ПРОДУКЦИЯ • иммунохимические – ИФА – проточная цитометрия • концентрация (мультиплексный анализ) БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ • биологические – хемотаксис – пролиферация – дегрануляция и т.д. Рецепторы цитокинов СИНТЕЗ • молекулярно-биологические – мРНК – планарные микрочипы ЭКСПРЕССИЯ • иммунохимические – проточная цитометрия ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОКИНОВ (2) • ПРОДУКЦИЯ IN VIVO • СПОНТАННАЯ ПРОДУКЦИЯ IN VITRO (активация in vivo) • ИНДУЦИРОВАННАЯ ПРОДУКЦИЯ IN VITRO – НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ (митогены, ЛПС) – СПЕЦИФИЧЕСКАЯ (аллергены, бактериальные антигены и т.д.) ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОКИНОВ (3) ПРОДУКЦИЯ IN VITRO • ВЫДЕЛЕННЫЕ ФРАКЦИИ КЛЕТОК • ЦЕЛЬНАЯ КРОВЬ • ТКАНИ Влияние тромбоцитов и плазмы на индукцию IL-8 в крови GBS 100 спонтанная продукция Цельная кровь IL-8 ng/ml 80 Кровь-Тромбоциты 60 * 40 20 * 25 0 Кровь-Плазма GBS 10 5 * Кровь-Плазма-Тромбоциты 15 * LPS * 0 1000 спонтанная продукция 800 IL-8 ng/ml IL-8 ng/ml 20 600 400 * 200 0 LPS xMap технология xMap микросферы 100 классов = 100 тестов Проточный цитофлуориметр • Проточная система и кювета • Двухлазерная компоновка • Детекция флюоресцентного сигнала Карта микросфер (регионы) • Каждый класс микросфер картируется – 100 регионов Приборы для х-МАР технологии Luminex FLEXMAP 3D Luminex-100 Luminex-200 MAGPIX Анализ цитокинов Гемопоэтическая: IL-1β, IL-6, G-CSF, GM-CSF, IFNγ Аутоиммунная: IL-1β, IL-6, IL-12, TNFα Воспалительная: IL-6, IL-8, G-CSF, TNFα Th1/Th2: IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFNγ, TNFα 17-плексная: IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, IFNγ, TNFα, MCP-1, MIP-1 23-плексная: IL-1α, IL-2R, IL-3, IL-12(p40), IL-16, IL-18, CTACK, GRO-α, HGF, ICAM-1, M-CSF, IFN-α2, LIF, MCP-3, MIF, MIG, βNGF, SCF, SCGF-β, SDF-1α, TNF-β, TRAIL, VCAM-1 27-плексная: IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL12(p70), IL-13, IL-15, IL-17, Basic FGF, Eotaxin, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1 (MCAF), MIP-1α, MIP-1β, PDGF-BB, RANTES, TNFα, VEGF Сравнительные характеристики ИФА и МИА методов определения цитокинов Сравниваемые параметры ИФА МИА Чувствительность Высокая: ≤10 пг/мл Высокая: несколько пг/мл Определение Количественное Количественное Специфичность Высокая Высокая Выявление Биологически активных и неактивных молекул Биологически активных и неактивных молекул Время проведения анализа Относительно небольшое (день) Более быстрый анализ (часы) Коэффициент вариации 5-10% 10-15% Интерференция отсутствует отсутствует Протокол исследования Относительно простой простой Объем образца Относительно большой (100-200 мкл на 1 определение) Небольшой (50 мкл на все определения – до 100 параметров) Стимуляция детекции Отсутствует Присутствует Срок хранения тестсистемы Небольшой Более продолжительный Разрешающая способность Определение 1 цитокина в одной биопробе Одновременное определение до 100 цитокинов в 1 биопробе Биологический материал для определения концентрации цитокинов • Периферическая кровь – сыворотка крови – плазма крови (ЭДТА) • Биологические жидкости – цереброспинальная жидкость – секреты – смывы – моча и т.д. • Экстракты тканей ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОКИНОВ • АКТИВАЦИЯ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ • ДИФФЕРЕНЦИРОВКА Th1 И Th2 • МОНИТОРИНГ ВОСПАЛЕНИЯ Уровни хемокинов в сыворотке крови больных системными васкулитами, Me [LQ; HQ] Хемокин, пг/мл Практически здоровые (n=20) Микроскопический полиангиит Гранулематоз Вегенера Синдром Черджа-Стросс (n=49) Узелковый полиартериит (n=36) CCL3/MIP-1α 3,2 [3,0; 3,6] 4,1 [3,3; 5,2] 3,4 [2,7; 4,4] CCL4/MIP-1β 11,0 [8,2; 13,3] 19,1 [16,6; 26,1] 15,6 [13,3; 19,9] CCL5/RANTES 144,1 [142,5; 149,1] 150,3 [146,5; 153,5] 146,1 [144,1; 150,9] CCL11/Eotaxin 7,7 [6,7; 10,0] 19,7 [15,6; 25,3] 17,9 [12,3; 26,8] CXCL8/IL-8 0,7 [0,5; 1,4] 1,9 [1,5; 2,8] 1,5 [1,2; 2,9] Уровни мРНК хемокинов в крови больных системными васкулитами, Me [LQ; HQ] мРНК хемокина Практически здоровые (n=20) Микроскопический полиангиит Гранулематоз Вегенера Синдром Черджа-Стросс (n=49) Узелковый полиартериит (n=36) CCL3/MIP-1α 9,7 [6,4; 12,8] 12,6 [7,2; 25,3] 16,8 [11,4; 26,4] CCL4/MIP-1β 1,9 [0,6; 6,4] 0,7 [0; 1,9] 0,5 [0; 1,1] CCL5/RANTES 5,2 [4,3; 9,4] 1,3 [0; 3,8] 1,0 [0; 4,5] CCL11/Eotaxin 3,7 [2,2; 5,9] 1,9 [0,4; 3,6] 0,9 [0; 2,4] CXCL8/IL-8 1,3 [1,1; 1,6] 0,6 [0; 1,3] 0,8 [0; 1,3] УРОВЕНЬ IL-8 (пкг/мл) ПРИ ОСТРОМ ГНОЙНОМ ГАЙМОРИТЕ смывы из гайморовых пазух 4500 3000 1500 0 острая фаза подострая фаза период реконвалесценции Уровень цитокинов IL-1β, IL-6, IFN-γ, G-CSF (пг/мл) в сыворотке крови больных СКВ 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 20 ** *** контрольная группа 15 ** больные СКВ 10 5 ** 0 IL-1beta IFN-gamma G-CSF IL-6 21 Уровень IL-1ß, IL-6, IFN-γ (пг/мл) в сыворотке крови больных СКВ с негативными и позитивными значениями АНФ, антител к дсДНК , антител к КЛ IgG/IgM IL-1β 0,35 ** 0,3 20 0,25 4,5 ** ** 4 3,5 3 15 2,5 0,2 2 10 0,15 IFN-γ IL-6 25 0,4 1,5 0,1 1 5 0,5 0,05 0 0 0 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Условные обозначения: ■ - антитела обнаружены □ - антитела не обнаружены *p<0,05 1 - АНФ 2 - антитела к дсДНК IgG 3 - антитела к кардиолипину IgG/IgM 22 Вклад клинических критериев и лабораторных показателей в диагностику СКВ (n=105) 80 70 % повышенных значений/ патологических поражений 60 50 40 30 20 10 0 * * в к и ma SF* 1be ta а во оче m C кож т п a с е g е G у с IL ни ни IFN же ние ораже а е р аж п по пор Э СО СР Б 6* лин у ILб ло а-г м гам * больные СКВ в сыворотке которых была измерена концентрация цитокинов (n=61) ** больные ДКВ и СКВ которым был выполнен ТВП (n=15) Ф АН П* ТВ * 23 Псориаз IL-1α IL-1β IL-12 (p40) Практически здоровые (n=10) Me (min-max) 0 (0 – 0) 0,1 (0 – 0,95) 0 (0 – 0) IL-12(p70) Цитокины, пг/мл Провоспалительные цитокины Противовоспалительные цитокины Th1-цитокины Больные псориазом с индексом PASI (n=10): PASI< 10 Me (minPASI>20 Me (min-max) max) 0 (0 – 0,65) 0,5 (0,37 – 1,18) 1,7 (0,59 – 3,15) * 0 (0 – 0) 0,4 (0,21 – 0,55) 3,4 (1,12 – 5,97) * 3,5 (0 – 5,04) 1,33 (0 – 2) 0,1 (0 – 1,68) IL-16 1,7 (0 – 2,17) 2,5 (1,79 – 3,32) 2,4 (2,08 – 2,9) IL-17 0 (0 – 0) 0 (0 – 0) 0 (0 – 0) IL-18 61,4 (0 – 176,6) 159 (118,2 – 229,5) 173,3 (140,5 – 195,6) TRAIL 79 (0 – 196,1) 125,8 (107,9 – 137,9) 109,9 (81,2 – 176,3) IL-10 0 (0 – 3,43) 0,7 (0,02 – 1,04) 0 (0 – 0,82) IL-1RA 0 (0 – 207,3) 61,1 (0 – 328,5) 55,4 (0 – 122,2) IL-2Rα 52,9 (42,0 – 69,7) * 63,4 (46,6 – 87,8) * IFNα-2 20,6 (17,7 – 25,1) 4,3 (0 – 20,1) 36,2 (32,6 – 47,7) * 38,0 (33,5 – 51,5) * IFN-γ 1,3 (0 – 48,9) 17,0 (12,4 – 32,9) 5,4 (2,71 – 12) IL-5 0,01 (0 – 2,38) 1,1 (0,03 – 1,49) 0,3 (0,14 – 0,65) IL-9 0 (0 – 8,85) 88,6 (4,6 – 442,5) 22,5 (0 – 518) IL-13 0,5 (0 – 14,41) 36,7 (8,0 – 53,8) 5,3 (1,2 – 33,6) LIF 0 (0 – 0,16) 35,8 (0 – 55,7) 24,2 (0 – 56,8) Th2-цитокины Содержание цитокинов (пг/мл) в сыворотке крови больных псориазом, групп сравнения и практически здоровых лиц 8 7 6 5 4 3 2 1 0 IL-2 IL-6 практически здоровые лица GM-CSF атопический дерматит IFN-γ склеродермия TNF-alpha псориаз достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, при p<0,01 достоверность различий показателя по сравнению с группой больных атопическим дерматитом, при p<0,01 Содержание IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α (пг/мл) в сыворотке крови больных псориазом в зависимости от индекса PASI 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 IL-2 IL-6 IL-10 практически здоровые лица GM-CSF PASI<10 IFN-γ PASI от 10 до 20 TNF-alpha PASI>20 достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, при p<0,001 достоверность различий показателя между группами с индексом PASI до 10 и индексом PASI более 20, при p<0,01 достоверность различий показателя между группами с индексом PASI от 10 до 20 и индексом PASI более 20, при p<0,01 Содержание цитокинов (пг/мл) в моче больных псориазом, групп сравнения и практически здоровых лиц 6 5 4 3 2 1 0 IL-2 IL-4 практически здоровые лица IL-8 IL-10 атопический дерматит GM-CSF склеродермия IFN-γ TNF-alpha псориаз (группав целом) - достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, при p<0,05 - достоверность различий показателя по сравнению с группой больных склеродермией, при p<0,01 - достоверность различий показателя по сравнению с группой больных атопическим дерматитом, при p<0,01 Содержание IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α (пг/мл) в моче больных псориазом в зависимости от индекса PASI 8 7 6 5 4 3 2 1 0 IL-8 IL-10 практически здоровые лица GM-CSF PASI<10 IFN-γ PASI от 10 до 20 TNF-α PASI>20 достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, при p<0,001 достоверность различий показателя между группами с индексом PASI до 10 и индексом PASI более 20, при p<0,01 Корреляционные зависимости между содержанием некоторых цитокинов от клинических и лабораторных показателей Кореляция между IL-6 в моче и уровнем белка в моче (r=0,4, p<0,006) 0,24 0,22 0,20 Взаимосвязь между уровнем IL-6 (r=0,4, p<0,006) и содержанием белка в моче может указывать на диагностическую значимость этого цитокина как маркера “активности поражения почек “ 0,18 белок моча 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 -0,02 -10 0 10 20 30 IL-6 40 50 60 70 ЭКСПРЕССИЯ ХЕМОКИНОВ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ В БИОПТАТАХ ВИЗУАЛЬНО ЗДОРОВОЙ И ПОРАЖЕННОЙ КОЖИ ПРИ ПСОРИАЗЕ 25 * * 20 ХЕМОКИНЫ 15 норма * 10 5 0 * * Eotaxin2 пораженная кожа * * * Eotaxin здоровая кожа MIP-1a MIP-1b RANTES IL8 * 60 50 РЕЦЕПТОРЫ ХЕМОКИНОВ *- достоверные 40 * 30 20 * 10 0 CCR1 CCR3 CCR5 CXCR1 CXCR2 * отличия по сравнению с контролем при p<0,05 Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов в визуально здоровой коже пациентов псориазом и склеродермией % к бета-актину * Достоверные отличия 40 от практически здоровых при p<0,05 35 30 25 20 * 15 10 5 * * * * * 0 Эотаксин Эотаксин 2 MIP-1α MIP-1β Здоровые добровольцы RANTES IL8 ССR1 Склеродермия ССR3 ССR5 СXCR1 Псориаз СXCR2 Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов в визуально здоровой коже пациентов псориазом % к бета-актину 25 * * Достоверные отличия от практически здоровых при p<0,05 20 15 5 * * 10 * ** * * * * 0 Эотаксин Эотаксин 2 MIP-1α MIP-1β RANTES IL8 40 Практически здоровые % к бета-актину 35 30 PASI < 10 25 * 20 15 * 10 * * * * 5 0 ССR1 ССR3 ССR5 СXCR1 СXCR2 PASI (10-20) PASI>20 Экспрессия внутрипеченочной MCP-1 при ХГС r=0,37 p=0,013 8 7 6 25,0 ИГА 5 20,0 ИГА печени 4 3 2 15,0 1 0 -2 10,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 мРНК MCP-1 в биоптате r=0,45 p=0,002 5,0 4 0,0 F1 F2 F3 ФИБРОЗ 3 фиброз печени 2 F1 – слабый фиброз 1 F2 – умеренный фиброз -2 F3 – тяжелый фиброз 0 2 4 6 8 10 12 14 мРНК MCP-1 в биоптате 16 18 20 22 24 Средние значения уровней цитокинов в ларингеальном секрете больных папилломатозом и здоровых лиц 40 p=0,035 35 30 p=0,031 пкг/мл 25 20 15 10 p=0,044 5 0 TNF IFN GMCSF IL13 Больные РРП IL12 IL2 IL10 Здоровые IL5 IL4 Эндоскопическая картина гортани пациента с респираторным папилломатозом до и после курса ингаляционной интерфероновой терапии до лечения после лечения Исходные уровни TNFα в ларингеальном секрете больных папилломатозом в зависимости от результата лечения * пкг/мл 60 40 20 0 Группы обследованных Частичный регресс Полный регресс Норма * – различия между группами больных достоверны при р<0,05 Динамика уровней цитокинов в ларингеальном секрете больных с частичным и полным регрессом папиллом в результате лечения IFN-γ IL-12 30 6 * 20 пкг/мл пкг/мл 4 10 2 * • * • • 0 -10 0 до лечения через сутки через 5 суток после курса через 5 до через через 5 после суток лечения сутки суток курса суток после после курса через 5 Част ичный регресс Полный регресс Норма курса IL-2 * • 40 * • пкг/мл 30 * – различия с исходными значениями достоверны при р<0,05 , 20 • - различия с нормой достоверны при 10 при р<0,05 0 до лечения через су тки через 5 су ток после ку рса через 5 су ток после ку рса Выбор цитокина или комбинации цитокинов, методов их определения и биоматериала должно быть обусловлено исключительно задачами исследования Большой Арарат Большой Арарат (тень) БЛАГОДАРНОСТИ СКВ, васкулиты Мазуров В.И., Маслянский А.Л., Долгих С.В. ЛОР-патология Плужников М.С., Катинас Е.Б. МАПО, Ленинградская областная больница Кафедра ЛОР-болезней СПб ГМУ Гепатит С Лобзин Ю.В., Жданов К.В., Гусев Д.А., Чирский В.С., Шахманов Д.М. Псориаз Манахов К.Н., Хобейш М.М. Шемеровская Т.Г., Ильина Т.Н. Чухловин А.Б., Сысоев К.А., Лапин С.В., Мазинг А.В., Бельтюкова А.С. Кафедра инфекционных болезней Военномедицинской академии имени С.М.Кирова Кафедра дерматовенерологии СПб ГМУ им.акад.И.П.Павлова Санкт-Петербургский городской ревматологический Центр (ГБ №25) НМЦ по молекулярной медицине СПб ГМУ им.акад.И.П.Павлова