Московская гимназия на Юго-западе № 1543

Московская гимназия на Юго-западе № 1543
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
РАН
Генотипирование генов главного комплекса
гистосовместимости по локусу HLA.
Юртаева С., Коробко Е.
Научный руководитель:
Доктор биологических наук Юрий Борисович Лебедев.
Москва 2011
Введение.
Аутоиммунные заболевания – это
заболевания, нарушающие работу иммунной
системы, которая начинает уничтожать
собственные клетки организма.
Анкилозирующий спондилит (АС) –
аутоиммунное заболевание, для которого
характерно развитие воспаления суставов
осевого скелета с последующим
формированием участков окостенения.
Наша гипотеза:
Мы предположили ассоциацию риска развития
заболевания с однонуклеотидной заменой в
гене MICA, находящегося в HLA – локусе шестой
хромосомы человека
HLA–локус содержит весь кластер генов главного комплекса
гистосовместимости (MHC).
MHC – это большая группа белковых молекул на поверхности
большинства клеток здорового человека, которая служит для
распознавания своих и чужих пептидных цепочек.
Белки МНС включают два основных класса:
Еще одна функция МНС белков состоит во
взаимодействии с NK
клетками (клетками врожденного иммунитета).
MICA – стрессиндуцируемый HLAподобный белок.
Этот белок
распознается
специальным(и)
рецептором(ами)
NKG на поверхности
NK- и некоторых Тклеток .
ПЦР
Из приблизительно 50-ти известных аллельных вариантов, отличающихся
один от другого набором однонуклеотидных замен, лишь несколько замен
предполагают функциональные последствия, так как приводят к замене
аминокислоты. Для определения нуклеотидной замены мы использовали
метод ПЦР (полимеразная цепная реакция), который позволяет добиться
значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов
ДНК в пробе.
Мы исследовали
три возможные
однонуклеотидные
замены в 3-ем
экзоне гена
(Met на Val в двух
различных
участках гена
MICA, и замены His
на Leu в одном
случае.)
А) rs1051792(Met152Val)
Б) rs41560824(Met174Val)
Цели и задачи
Целью нашей работы было сравнение
вариабильности геномов по локусу гена главного
комплекса гистосовместимости (HLA-локусу) MICA в
выборках здоровых доноров и больных
аутоимунными заболеваниями (анкилозирующим
спондилитом).
Для выполнения данной цели нами были поставлены
следующие задачи:
• Определить частоты трех однонуклеотидных замен
(SNP) в исследуемых выборках.
• Выяснить, существует ли разница в частоте
исследуемых аллелей между группой больных и
здоровых людей.
Этапы постановки ПЦР
1) промотор 2)некодирующая область 3) экзон 4)интрон 5)прямой
праймер 6)обратный праймер 7)однонуклеотидные замены
Праймер
Нуклеотидная последовательность (5’ Примечания
– 3’)
MICA-For1
GGAGGGCCAGGGAGGCATAC
MICA-Rev1
GAGGGTTTCCCTGGACACAT
MICA-For2
CTCCAGGAGATTAGGGTCTGT
MICA-Rev2-С(Val) GCTCTGGAGGACTGGGGAAC
MICA-Rev2Т(Met)
GCTCTGGAGGACTGGGGAAT
MICA-Rev2-Н
TGCATGCATAGCGTGATTGT
MICA-Rev2-L
TGCATGCATAGCGTGATTGA
MICA-Rev2-M
TGATAGTGTGTCTTGGTCTTGAT
MICA-Rev2-V
TGATAGTGTGTCTTGGTCTTGAC
I ПЦР
прямой для II
ПЦР
для маркера
rs1051792
для маркера
rs3819268
для маркера
rs41560824
Мы проводили генотипирование
среди двух выборок: 25 здоровых
людей и 20 людей больных
анкилозирующим спондилитом
Результаты ПЦР-I
Результаты ПЦР-II
(маркер rs1051792)
генотип
T/T
C/T
C/T
C/T
Группа
Больные
ID (№)
аллели
Генотип MICA
rs1051792
rs3819268
rs41560824
M
V
H
M
V
91
+
+
+
-
+
+
M/V,H/H,M/V
92
+
+
+
-
+
-
M/V,H/H,M/M
93
+
+
+
-
+
-
M/V,H/H,M/M
94
+
-
+
-
+
+
M/M,H/H,M/V
L
Далее мы посчитали частоты встречаемости
гомо и гетерозигот для выборки больных и
здоровых доноров и частоту встречаемости
отдельного аллеля в этой выборке.
маркер
Rs1051792
генотип
среднепопуляционная
частота
выборка
Больные
(n=25)
Здоровые
(n=20)
C/C
0,04(1)
0,10 (2)
C/T
0,60 (15)
0,60 (12)
T/T
0,36(9)
0,28(6)
0,34
0,40
fc
0,793
p
0.7126
Для проверки статистической
достоверности различий в частотах
встречаемости минорных аллелей
между выборками больных и здоровых
доноров мы использовали пакет
программ для статистической
обработки данных генотипирования
OpenEpi.
Учитывая небольшой размер
анализируемых выборок мы применяли
оценку по точному критерию Фишера.
В качестве примера представлена «2х2 Таблица» интернет-ресурса
OpenEpi, заполненная в соответствии с частотами аллелей по маркеру
rs1051792.
Disease
Exposure
(+)
(-)
(+)
17
16
33
(-)
33
24
57
50
40
90
Выводы
По результатам генотипирования нами установлено, что в
исследованных выборках:
- отсутствует полиморфизм по маркеру Rs38(HL), т.к.
частота минорного аллеля равняется нулю.
- частоты встречаемости аллелей «С» по маркерам
rs1051792 и Rs415 существенно отличаются от
представленности данных аллелей в усредненной
популяции европеоидов, что может свидетельствовать о
сцепленности маркеров с другим геном HLA-локуса –
геном HLA B27
- обнаруженные отличия частот аллелей у больных и
здоровых не являются статистически достоверными
Для российской популяции показано отсутствие
ассоциации стресс-индуцируемого HLA-подобного гена
MICA с развитием аутоиммунных артропатий.
Благодарности.
Мы выражаем свою благодарность Институту биоорганической
химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
и всю лабораторию сравнительной и функциональной геномики
за предоставленную возможность выполнить нашу научную
работу.
Особенно мы хотим поблагодарить нашего научного
руководителя Юрия Борисовича Лебедева за чуткое
руководство, отзывчивость и неоценимую помощь.
Также мы благодарим Сергея Менделевича Глаголева за
организацию практики.