Московская гимназия на Юго-западе № 1543 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Генотипирование генов главного комплекса гистосовместимости по локусу HLA. Юртаева С., Коробко Е. Научный руководитель: Доктор биологических наук Юрий Борисович Лебедев. Москва 2011 Введение. Аутоиммунные заболевания – это заболевания, нарушающие работу иммунной системы, которая начинает уничтожать собственные клетки организма. Анкилозирующий спондилит (АС) – аутоиммунное заболевание, для которого характерно развитие воспаления суставов осевого скелета с последующим формированием участков окостенения. Наша гипотеза: Мы предположили ассоциацию риска развития заболевания с однонуклеотидной заменой в гене MICA, находящегося в HLA – локусе шестой хромосомы человека HLA–локус содержит весь кластер генов главного комплекса гистосовместимости (MHC). MHC – это большая группа белковых молекул на поверхности большинства клеток здорового человека, которая служит для распознавания своих и чужих пептидных цепочек. Белки МНС включают два основных класса: Еще одна функция МНС белков состоит во взаимодействии с NK клетками (клетками врожденного иммунитета). MICA – стрессиндуцируемый HLAподобный белок. Этот белок распознается специальным(и) рецептором(ами) NKG на поверхности NK- и некоторых Тклеток . ПЦР Из приблизительно 50-ти известных аллельных вариантов, отличающихся один от другого набором однонуклеотидных замен, лишь несколько замен предполагают функциональные последствия, так как приводят к замене аминокислоты. Для определения нуклеотидной замены мы использовали метод ПЦР (полимеразная цепная реакция), который позволяет добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов ДНК в пробе. Мы исследовали три возможные однонуклеотидные замены в 3-ем экзоне гена (Met на Val в двух различных участках гена MICA, и замены His на Leu в одном случае.) А) rs1051792(Met152Val) Б) rs41560824(Met174Val) Цели и задачи Целью нашей работы было сравнение вариабильности геномов по локусу гена главного комплекса гистосовместимости (HLA-локусу) MICA в выборках здоровых доноров и больных аутоимунными заболеваниями (анкилозирующим спондилитом). Для выполнения данной цели нами были поставлены следующие задачи: • Определить частоты трех однонуклеотидных замен (SNP) в исследуемых выборках. • Выяснить, существует ли разница в частоте исследуемых аллелей между группой больных и здоровых людей. Этапы постановки ПЦР 1) промотор 2)некодирующая область 3) экзон 4)интрон 5)прямой праймер 6)обратный праймер 7)однонуклеотидные замены Праймер Нуклеотидная последовательность (5’ Примечания – 3’) MICA-For1 GGAGGGCCAGGGAGGCATAC MICA-Rev1 GAGGGTTTCCCTGGACACAT MICA-For2 CTCCAGGAGATTAGGGTCTGT MICA-Rev2-С(Val) GCTCTGGAGGACTGGGGAAC MICA-Rev2Т(Met) GCTCTGGAGGACTGGGGAAT MICA-Rev2-Н TGCATGCATAGCGTGATTGT MICA-Rev2-L TGCATGCATAGCGTGATTGA MICA-Rev2-M TGATAGTGTGTCTTGGTCTTGAT MICA-Rev2-V TGATAGTGTGTCTTGGTCTTGAC I ПЦР прямой для II ПЦР для маркера rs1051792 для маркера rs3819268 для маркера rs41560824 Мы проводили генотипирование среди двух выборок: 25 здоровых людей и 20 людей больных анкилозирующим спондилитом Результаты ПЦР-I Результаты ПЦР-II (маркер rs1051792) генотип T/T C/T C/T C/T Группа Больные ID (№) аллели Генотип MICA rs1051792 rs3819268 rs41560824 M V H M V 91 + + + - + + M/V,H/H,M/V 92 + + + - + - M/V,H/H,M/M 93 + + + - + - M/V,H/H,M/M 94 + - + - + + M/M,H/H,M/V L Далее мы посчитали частоты встречаемости гомо и гетерозигот для выборки больных и здоровых доноров и частоту встречаемости отдельного аллеля в этой выборке. маркер Rs1051792 генотип среднепопуляционная частота выборка Больные (n=25) Здоровые (n=20) C/C 0,04(1) 0,10 (2) C/T 0,60 (15) 0,60 (12) T/T 0,36(9) 0,28(6) 0,34 0,40 fc 0,793 p 0.7126 Для проверки статистической достоверности различий в частотах встречаемости минорных аллелей между выборками больных и здоровых доноров мы использовали пакет программ для статистической обработки данных генотипирования OpenEpi. Учитывая небольшой размер анализируемых выборок мы применяли оценку по точному критерию Фишера. В качестве примера представлена «2х2 Таблица» интернет-ресурса OpenEpi, заполненная в соответствии с частотами аллелей по маркеру rs1051792. Disease Exposure (+) (-) (+) 17 16 33 (-) 33 24 57 50 40 90 Выводы По результатам генотипирования нами установлено, что в исследованных выборках: - отсутствует полиморфизм по маркеру Rs38(HL), т.к. частота минорного аллеля равняется нулю. - частоты встречаемости аллелей «С» по маркерам rs1051792 и Rs415 существенно отличаются от представленности данных аллелей в усредненной популяции европеоидов, что может свидетельствовать о сцепленности маркеров с другим геном HLA-локуса – геном HLA B27 - обнаруженные отличия частот аллелей у больных и здоровых не являются статистически достоверными Для российской популяции показано отсутствие ассоциации стресс-индуцируемого HLA-подобного гена MICA с развитием аутоиммунных артропатий. Благодарности. Мы выражаем свою благодарность Институту биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и всю лабораторию сравнительной и функциональной геномики за предоставленную возможность выполнить нашу научную работу. Особенно мы хотим поблагодарить нашего научного руководителя Юрия Борисовича Лебедева за чуткое руководство, отзывчивость и неоценимую помощь. Также мы благодарим Сергея Менделевича Глаголева за организацию практики.