Щелочная фосфатаза E.coli

Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях
5. Аллостерические ферменты.
Функциональные димеры, механизм их
функционирования
Аллостерические ферменты
Аллостерические
эффекторы
Отрицательные
Аллостерические
ингибиторы
Снижают активность
фермента
Положительные
Аллостерические
активаторы
Повышают активность
фермента
Гомотропная регуляция –
аллостерическая регуляция, когда субстрат
может выступать в качестве эффектора
(эффектор и субстрат - одно и то же вещество).
Функционирование аллостерических ферментов, при взаимодействии с
аллостерическим ингибитором (А) и аллостерическим активатором (Б)
Аспартат карбамоил-трансфераза (АКТ-аза)
АКТ-аза – фермент биосинтеза пиримидинов, обеспечивает
образование карбамоиласпартата – одного из промежуточных
продуктов синтеза СТР.
Карбамоилфосфат
L-аспартат
карбамоиласпартат
Бактериальная АКТ-аза E. coli
6 каталитических субъединиц
6 регуляторных субъединиц
(34 кДа, 2 тримера)
(16 кДа, 3 димера)
Работа регуляторных субъединиц АКТ-азы
Регуляторные субъединицы
СTP
Аллостерический
ингибитор
АТР
Аллостерический
активатор
Протекание реакции во времени приводит к появлению СTP – конечного
продукта цепи. По мере накопления СTP и его связывания с ферментом
сродство к субстратам снижается и фермент включается в работу только
при гораздо больших концентрациях субстрата. АТР конкурирует с СTP
и может устранять его ингибирующее действие. Регуляция является
обратимой и при изменении в клетке концентрации АТР или СTP скорость
работы фермента изменяется.
Таким образом АКТ-аза обеспечивает постоянное присутствие
в клетке нужных количеств СТР.
O
NH
CH
C
O
+
ClHg
COOH
-HCl
SH
Две –SH группы остатков Cys
на каждую регуляторную
субъединицу
CH
S
Hg
COOH
р-ClHg-бензоат
Номер фракции
Разделение каталитических и регуляторных субъединиц аспартат
карбамоил-трансферазы (АКТ-азы) на анионообменнике в градиенте
соли KCl. Первый пик (1) – каталитические субъединицы, второй
пик (2) – регуляторные субъединицы.
S-образная кривая зависимости скорости
реакции от концентрации субстрата
Впервые S-образные функции для насыщения были
получены в 1909 году (А. Хилл)
График зависимости скорости реакции от
концентрации субстрата в виде S-образной
кривой на примере АКТ-азы: без эффектора,
с АТР, с СTP. Субстрат – аспартат.
Арчибальд Хилл
1886-1977
Английский физиолог
Нобелевская премия по
физиологии и медицине
1922 г.
Кооперативное связывание
Аллостерические ферменты обладают
свойством кооперативности:
взаимодействие эффектора с
аллостерическим центром вызывает
последовательное кооперативное изменение
конформации всех субъединиц, приводящее
к изменению конформации активного
центра и к изменению сродства фермента
к субстрату, что снижает или увеличивает
каталитическую активность фермента.
Коэффициент Хилла h – безразмерная величина, характеризующая
кооперативность связывания лиганда ферментом
[L] h
Y
h
[L] 0,5
 [L] h
Y – степень насыщения, [L] – равновесная концентрация
лиганда и [L]0,5 – равновесная концентрация лиганда, при
которой Y=0,5 от максимального насыщения.
v  Vmax
[S 0 ] h
h
[S] 0,5
 [S 0 ] h
Vmax – максимальная скорость при S0→∞, [S]0,5 – концентрация
субстрата при половине максимальной скорости, которая
входит в уравнение вместо константы Михаэлиса KМ.
Графическое определение
коэффициента Хилла
lg(v/( Vmax-v)) = h lg[S0] – h lg[S]0,5
• Для изостерических ферментов, у которых
кооперативного взаимодействия между активными
центрами нет, то есть сродство фермента к
субстрату не зависит от уже присоединенных
молекул субстрата, h=1.
• Положительная кооперативность (h>1)
характеризуется тем, что присоединение одной
молекулы субстрата к активному центру фермента
увеличивает сродство к субстрату остальных
активных центров.
S-образные кривые зависимости скорости реакции от
концентрации субстрата характерны для положительной
кооперативности. Связывание кислорода с гемоглобином,
имеющим 4 центра связи, характеризуется параметром
Хилла h=2,9.
• Отрицательная кооперативность (h<1)
характеризуется тем, что присоединение одной
молекулы лиганда к активному центру фермента
уменьшает сродство к лиганду остальных активных
центров.
Конформационные состояния и возможные переходы между
ними при аллостерических взаимодействиях протомеров
тетрамерного белка
Конформации белка, соответствующие диагонали, проведенной из
верхнего левого угла в правый нижний, представляют собой состояния,
для которых переход из одного в другое индуцируется лигандом
Белковый олигомер может находиться в одном из двух состояний:
Т-состоянии (от англ. tense – напряженное) и
R-состоянии (от англ. relaxed – расслабленное).
АКТ-аза:
субстрат и эффекторы влияют на равновесие
между Т- и R-формами и тем самым на
сигмоидность кривой. С возрастанием
концентрации аспартата равновесие
смещается к R-форме. АТР стабилизирует
R-состояние путем связывания с
регуляторной субъединицей. Напротив,
присоединение СTP содействует переходу
в Т-состояние.
Функциональные димеры
Примеры структур функциональных димеров
α2
α4
α2β2
Ассоциация мономеров позволяет
уменьшить объем гидрофобной
поверхности белка, и это более
экономично провести через
ассоциацию мономеров, чем путем
увеличения молекулярного веса
белка в пересчете на активный центр.
Жак Люсьен Моно
1910, Париж – 1976, Канн
французский биохимик
и микробиолог
Нобелевская премия по
физиологии и медицине
1965 г.
Это позволяет организовать в
олигомер субъединицы различной
химической природы, на которых в
случае регуляторных ферментов
можно расположить аллостерически
активные центры и регуляторные
участки, и тем самым разделить их в
пространстве.
Ряд ферментов-олигомеров подчиняется Михаэлисовской
кинетике и проявляет свойство отрицательной
кооперативности при связывании субстратов
Возможные причины ухудшения связывания второго
субстрата для фермента, состоящего из двух
субъединиц:
1. Активные центры, расположенные на субъединицах,
изначально неравноценны.
2. Центры изначально равноценны, но их
неэквивалентность возникает в результате
гетерологической укладки субъединиц.
3. Один из центров экранирован, сродство фермента ко
второму субстрату снижается по стерическим
причинам.
4. Изменение структуры второго центра, приводящее к
уменьшению сродства фермента к субстрату в
результате конформационных взаимодействий
субъединиц.
Механизм реакционной способности половины
активных центров (half-of-the-sites reactivity)
Отрицательная кооперативность для
ферментов, подчиняющихся Михаэлисовской
кинетике, может проявляться не только при
связывании субстратов, но и в процессе
формирования продуктов реакции.
При механизме реакционной способности
половины активных центров
только один активный центр функционирует
в единицу времени
и продукт формируется на 1 центре фермента.
Щелочная фосфатаза E.coli
E + ROPO32-
E~O-PO32- + ROH
E + HPO42-
• Димер с молекулярным весом 94 кДа.
• Гидролаза, дефосфорилирующая многие типы молекул,
например, нуклеотидов, белков и алкалоидов.
• Проявляет наибольшую активность в щелочной среде.
• На каждой субъединице имеет три центра связывания
двухвалентных металлов Zn2+, а также Mg2+, Co2+, Cd2+
и др., из которых два являются прочно связывающими.
Щелочная фосфатаза E.coli
Фосфорилирование гидроксильной группы остатка серина происходит
как при действии субстрата, так и продукта реакции. Нековалентное
связывание ортофосфата с Zn2+ идет по двум сайтам фосфатазы.
Соответствующие константы диссоциации отличаются на порядок, что
обусловлено выраженной отрицательной кооперативностью связывания.
?
Имеет ли место
отрицательная кооперативность при
образовании ковалентных производных?
Щелочная фосфатаза E.coli
Фосфорилирование активных центров Zn2+
препаратов фосфатазы
Отрицательная кооперативность была обнаружена в
кислых рН, когда ковалентные производные
устойчивы.
При фосфорилировании второго центра концентрацию
[32Р]-ортофосфата повышали:
– при рН 4,2 в 20-40 раз,
– при рН 5 на три порядка.
При щелочном рН, которое оптимально для катализа,
обнаруживается фосфорилирование фермента строго
по одному центру.
Щелочная фосфатаза E.coli
*Е и **Е указывают на внутри и межсубъединичные
взаимодействия соответственно. *E-S – нековалентное
присоединение субстрата, Е-Р или * Е-Р – ковалентное
фосфорилирование. Межсубъединичные взаимодействия
необходимы как для фосфорилирования (*Е), так и для
дефосфорилирования (**Е).
Внутрисубъединичная кооперативность
обуславливает фосфорилирование,
а межсубъединичная – дефосфорилирование.
Щелочная фосфатаза E.coli
Реакция может быть представлена в виде следующей схемы (графа):
Для этой схемы:
Vmax
k 2k 4

E0
k2  k4
V=
KM 
Vmax
KM
1
S
k2
(k -3  k 3 )
 k4
k3
k2  k4
k -1
k1
• В случае функционального димера на 1 моль
фермента может приходиться 2 или 1,5 моль
субстрата. Когда вторая молекула субстрата
связывается с ферментом с меньшим сродством,
можно наблюдать связывание менее двух молей
субстрата на моль фермента. То есть
функциональными являются оба активных центра,
но функциональная активность второго во время
функционирования первого подавляется.
• При связывании двух субстратов, как правило,
Kd(2) (10-7 М) >> Kd(1) (10-9 М):
для первого субстрата Kd(1)=[E][S]/[ES],
для второго субстрата Kd(2)=[E][ЕS]/[ES2].
Функциональная димерность фермента нужна в основном
для повышения числа оборотов ферментативной реакции,
то есть для повышения каталитической активности
фермента.