Компоненты ИФА • Аналит – определяемое вещество • Лиганд – вещество избирательно связывающееся с аналитом • Метка – легкоопределяемое соединение, добавляемое в анлитическую систему для измерения количества аналита • Авидность – прочность комплекса АГ-Ат • Афинность – сродство активного центра Ig с АГД Иммуноферментный анализ • Гомогенный - все 3 стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся ИК от непрорегировавших компонентов. Для определения низкомолекулярных субстанций. Иммуноферментный анализ • Гетерогенный – анализ проводится в • двухфазной системе с участием твердой фазы (носителя) и обязательной стадией разделения ИК от непрореагировавших компонентов (отмывка). Гетерогенные методы, в которых формирование ИК на 1 стадии протекает на твердой фазе ,называют твердофазными. Гетерогенный твердофазный ИФА По типу реагентов присутствующих первой стадии: 1.Конкурентный На первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментом и конкурирующий за центры специфического связывания с ним. 2. Неконкурентный – характерно присутствие в системе на 1 стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания. Этапы ИФА • Взаимодействие аналита с лигандом • Формирование меченного комплекса • Измерение сигнала Конкурентный ИФА для определения антигенов Искомый антиген(1) и меченыйферментом антиген(2) конкурируют друг с другом за антитела (3), сорбированные на твердой фазе. . Определение АТ в сыворотке больного (в лунках планшеток с сорбированным АГ (прямой ИФА) Определение АГ в сыворотке больного (в лунках планшеток с сорбированным АТ)прямой ИФА Твердая фаза Полистирол,поливинилхлорид,полипропилен устойчивость к растворам, используемым в реакциях наличие высокой специфической емкости, т.е. способности сорбировать на своей поверхности АГ или АТ в количествах, необходимых для проведения реакции низкая неспецифическая сорбция белков из исследуемых образцов и конъюгатов Пути решения этой проблемы: добавить белок, заполняющий свободные центры связывания на поверхности пластика «забивка» развести сыворотку в 10-100 раз Конъюгат • Конъюгат – продукт химической сшивки АТ ( АГ) с ферментным маркером (вторые АТ). Используют АТ к Ig того класса, который мы желаем выявить. Конъюгат должен обладать следующими свойствами • Высоким антительным титром и высокой афинностью к АГ. • Достаточной специфичностью в рабочем разведении • Преобладанием мономерных форм над полимерными • Оптимальным молярным соотношением между ферментом и АТ (1:1) • Достаточной ферментативной активностью Субстрат • Бесцветное вещество –хромоген • Ортофенилендиамин • Тетрамитилбензидин Основные требования к субстрату • Обеспечение высокой чувствительности • Образование хорошо учитываемых продуктов реакции фермент-субстрат • Должен быть безопасным, дешевым, доступным,удобным в применении. • Чаще используют хромогенные субстраты, которые разрушаясь образуют окрашенное вещество Ферменты и субстраты, наиболее широко используемые в ИФА Фермент Пероксидаза хрена Источник получения Хрен Молек. масса(к Да) 40 Субстрат (рекоменд.длина Конъюгирующий реагент волны при фотометр.,нм) 1.Глутаральдегид Oфенилендиаминдигидрохлор ид β -галактозидаза (Armoracia (ОФД,492 нм), 2.Мета-периодат натрия Rusticana) 5-аминосалициловая кислота(450 нм), диаминобензидин, одианизидин 3.N-сукцинимидил 3 пропионат О-нитрофенил-β-D-галактозид Метамалеимидобензо л-Nгидроксисукцин имидный эфир Escherichia 540 (420 нм) Coli Щелочная форфатаза E.coli,слизистая кишечника теленка 84-150 Р-нитрофенилфосфат(405нм) 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат Глутаралдегид Этапы проведения ИФА Положительный результат • Отрицательный результат Добавление аналита Добавление конъюгата • Положительный результат • Отрицательный результат Схема взаимодействия активного центра АТ и антигенной детерминанты Определение АТ • Сероконверсия • первая сыворотка отрицательная • Вторая -положительная Метод «парных сывороток» • Сравнение двух последовательных анализов, причем повторный анализ рекомендуется делать через 10-14 дней Иммуноглобулин G • Строение Иммуноглобулины • IgM определение АТ этого класса • необходимо для диагностики острого периода заболевания IgG появляются в период реконвалесценции и у переболевших сохраняются 10 лет и более.Используется для оценки напряженности поствакцинального иммунитета и определение инфекции в анамнезе. Определение специфических IgE специфический АГ на бумажном диске IgE Определение специфических IgE HPR развитие цветной реакции СА-242 («сэндвич» вариант ИФА) Дженскрин Плюс ВИЧ АГ-АТ Твердая фаза –МАТ против р24 ВИЧ 1 Конъюгаты -1. Биотил.анти-р24 Твердая фаза 2.Авидин-пероксидазный Коньюгат Сыворотка/плазма Дженскрин Плюс ВИЧ АГ-АТ Твердая фаза-gp160, gp36, композ.пептид Конъюгат – gp41,gp36 и пероксидаз. конъюгаты Твердая фаза Коньюгат Сыворотка/плазма IgG, IgA, IgM Тест полоски - Иммунодот Комбинация АГ на полосках 1 Название 1 набора MONO IgG + (инфекционный Мононуклеоз) 2 2 EBV 3 4 3 EBNA VCA G 1G 5 6 4 5 6 CMVG Toxo O G Преимущества ИФА • Высокой чувствительностью, позволяющей • • • • • • определять концентрации до 0,05 нг/мл Минимальные объемы исследуемого материала Стабильностью при хранении всех ингредиентов Простотой проведения реакции Наличием как инструментального, так и визуального учета Возможностью автоматизации всех этапов реакции Относительно низкой стоимостью диагностических наборов Полезные советы • Выбор фирмы поставщика o o o o o Цена не должна быть приоритетом Желательно комплектация 1-3 уровнями контр.кач. Совместимость с международ. контр.материалами Стабильность реагентов после открытия набора Срок годности тест-системы Неправильная форма калибровочной кривой • Не правильно приготовлен раствор стандарта • Стандарт не был разбавлен разбавителем • • • стандарта или рабочим буфером Неправильная промывка Ошибка при внесении стандарта или последующих шагах Использование реагентов из других наборов или наборов другого лота Полезные советы • Точность пипетирования ( от ячейки к ячейки не > 2%) • Не хранить реагенты в саморазмораживающимся • • • • • холодильнике Не используйте инкубаторы с конвективным нагревом Оптимальное промывание Регулярно проверять точность работы обрудования Рекомендуется, чтобы все сыворотки анализ. в дублях (разброс для 1 образца не > 5%) Проблемы ИФА • Повышенный фон o Недостаточная промывка o Контаминация субстрата ионами металлов или o o o o o o окисляющими реагентами Загрязнение дозатора или субстрата конъюгатом стрептовидина с ПХ Неправильное разведение конъюгата Стреп.сПХ Хромоген. субстрат находился на свету Неправиьное время/ или Т0 инкубации Испарение содержимого во время инкубации Неправильное количество ФК или ХС Повышенные оптические плотности образцов/стандартов • Не правильно разбавлены стандарты, • • • • • конъюгаты Микропланшет накрыт пленкой во время инкубации с субстратом Превышение времени инкубации Нарушение Т0 режима Контаминация наконечника, субстрата Ф.К. Субстрат находился на свету перед использованием • • • • • • • • • • • Отсутствие или слабое развитие окраски Реагенты не достигли комнатной Т0 (25±20) Не правильное хранение набора Инкубация с Ф.К. при 370 вместо комнатной Т0 Пропущена одна из инкубаций Высыхание ячеек в ходе проведения анализа Использование неподходящего субстрата или стоп-реагент. Низкая Т0 в помещении <220 Истечение срока годности реагентов Не соответствующая длина волны считывания Не правильное разбавление Ф.К. Советы • Спектрофотометр перед измерением прогреть • 1 включение = 40 минут работы лампы • Увеличение сигнала при использовании марли обработанной хлорамином • Дистиллированная вода комн.Т. Не хранить воду более 2-3 дней. • Планшет для предварит. Разведения использовать однократно. Советы • Не сокращать время инкубации с ОФД • Не допускать подсыхания лунок • При промывке лунки заполняются до самого верха • Особенно тщательно промывать после инкубации с конъюгатом • При отказе спектрофотометра – добавить стоп-реагент и быстро заморозить Сомнительный результат • Ошибка дозирования 5% • Ошибка измерения спектрофотометра 10% • Серая зона Сыворотки, оптическая плотность которых отличается не более 15% от ОПкрит следует признать сомнительными Сut off • Пороговое значение, превышение которого является положительным результатом ОФД, ТМБ • Отдельная посуда и наконеники • Обработка 50% спиртом • Промыть дистиллированной водой • Измерять оптическую плотность не позже 30 мин Автоматические пипетки • Погрешность пипеток не должна превышать 5% • 1мкл Н20 =1мг • Дозирование объема менее 10 мкл Сбор, подготовка и транспортировка образцов для исследования на наличие антител к вирусу краснухи класса IgM и IgG • • • • • • • • • • • • Материал для исследования - сыворотка крови. Тестированию подлежит сыворотка, не содержащая примеси эритроцитов, бактериальной контаминации, хилеза, гемолиза.При наличии любого из указанных признаков сыворотка уничтожается и назначается повторный забор крови. Приготовление сыворотки. Венозная кровь берется без антикоагулянта. Отстаивается при комнатной температуре (1520град) в течении 30 минут до полного образования сгустка. По окончании образования сгустка пробирки открывают и осторожно проводят тонкой стеклянной палочкой по внутренним стенкам пробирки для стделения сгустка от стенок пробирки.Сыворотку сливают в другую центрифужную пробирку, придерживая сгусток стеклянной палочкой, и центрифугируют, либо центрифугируют в тех же, первичных, пробирках. После центрифугирования отделяют сыворотку от сгустка и клеток крови и помещают в холодильник при +2-+8 град. При необходимости более длительного хранения ее необходимо хранить при - 20 град. Допускается замораживать сыворотку только 1 раз. Условия транспортировки. Правильно собранная сыворотка должна быть своевременно доставлена в лабораторию. Сыворотка крови стабильна при +2-+8 град в течении 12 часов. Во время транспортировки пробирки с сывороткой должны быть соответствующим образом защищены от вредного воздействия окружающей среды и погодных условий. Пробирки должны быть промаркированы, упакованы и плотно закрыты. Минимальное количество сыворотки, необходимое на 1 исследование - 200 мкл. Для определения динамики антителообразования сыворотку исследуют дважды. Интервал между исследованиями 1-2 недели. ( метод "парных" сывороток) Спектрофотометры Спектрофотометры • Спектрофотометры • Обычно требуют длительного времени прогрева (указано в инструкции). Поэтому если ожидается измерение оптической плотностичерез 30 мин после очередного измерения, прибор лучше оставить включенным ( 1 включение равносильно 40 мин работы лампы). • Спектрофотометры имеют допустимую погрешность измерения до 10%.Проверить это можно, промеряя дважды один и тотже планшет и вычисляя различие в величине оптической плотности в одинаковых лунках. При этом планшет разворачивают так, чтобы лунка А1 заняла место Н12. • При оптической плотности выше 1,5 о.е. погрешность спектрофотометра может возрастать. Марля или фильтровальная бумага • При многократном использовании марли, обработанной хлорамином, возможно повышение сигнала (при попадании хлорамина в лунки) Дистиллированная вода • Не хранить более 2-3 дней. Не добавлять азид натрия в качестве консерванта.. Он является ингибитором пероксидазы. Если вода хранилась в холодильнике, необходимо прогреть до комнатной t°. Планшет для предварительного разведения сывороток • Использовать однократно. Инструкции по применению – – – – – – – – – При получении новой серии наборов даже хорошо знакомой тест-системы – необходимо прочитать инструкцию. Сознательные нарушения инструкции – сокращение времени инкубации с р-ром субстрата.Такие изменения протокола ИФАмогут существенно снизить выявляемость слабоположительных образцов, т.е. привести к ложноотрицательным результатам. Перед вскрытием пакета с планшетом его следует выдержать при комнатной Т° для предотвращения конденсации влаги на планшете если планшет разборный и используются не все стрипы сразу,то после вскрытия оставшиеся стрипы следует поместить в пакет, край покета завернуть и зажать скрепками.Не следует удалить покетик с влагопоглотителем. Для предотвращения загрязнения не следует трогать верхнюю часть стрипов пальцами. Перед использованием убедитесь, что растворы и реагенты гомогенны. В случае необходимостидлительного перерыва следует положить планшет вверх донышками на смоченную водой марлю или фильтровальную бумагу. Реакция связывания АТ с АГ начинается сразу после внесения сыворотки в лунку, поэтому желательно уменьшить период между внесением первой и последней сыворотки в планшет. Рабочий раствор конъюгата желательно готовить непосредственно перед применением. Особенно тщательно следует промывать планшет после инкубации конъюгата. Отказ спектрофотометра • Быстро заморозить планшет после добавления серной кислоты с последующим быстрым оттаиванием перед измерением оптической плотности.Следует учмтывать, что о.п. все-таки возрастает, а относительный прирост сигнала более высок для небольших значений о.п. Отказ термостата • Универсальных рецептов нет Ошибки при постановки ИФА • Инкубация при комнатной t° (18-25°) • На практике t° в помещениях лабораторий варьирует • от 12-30°. Общих формул оценки влияния соотношения t° и времени инкубации на оптическую плотность не существует.Единственный способ избежать ошибки – установка планшета в термостат, настроенный на комнатную t°. Перед постановкой тест-системы концентраты р-ров необходимо развести дистиллированной водой. Вода должна иметь комнатную t°. Особенно это важно для разведения конъюгата и сывороток. Вероятность получения неправильного результата выше, если продолжительность инкубации мала (30мин) Относительная влажность воздуха • Относительная влажность воздуха • Длительная инкубация при комнатной t°, при сухом воздухе(зимой) может вызвать подсыхание р-ра с образованием «ободка» на боковой поверхности лунки, который при промывки может сохраниться. Лучше использовать влажную камеру. Промыватели планшетов • Засорение каналов промывателей.недостаточная • промывка приводит к завышению сигнала.Обнаружить это просто – при использовании рядного промывателяповышенный сигнал имеет один из рядов, при использовании 96-канального – одна и таже лунка разных планшетов Менее частовстречается засорение пространства между иглами промывателя кусочками марли или ваты.Это приводит к заносу растворов из одной лунки в другие.