Генотипический анализ MDR-штаммов M. tuberculosis

Определение источника возникновения
MDR-изолятов на основе анализа
лекарственно-устойчивых штаммов
M.tuberculosis в Новосибирской и Томской
областях
Лаборатория молекулярной
биологии туберкулеза НИИ
биоинженерии ГНЦ ВБ «Вектор»
Актуальность проблемы:
Около
трети
населения
инфицировано туберкулезом.
нашей
планеты
В течение нескольких последних лет постоянно
увеличивается
количество
больных,
инфицированных MDR-штаммами M.tuberculosis
Заболеваемость туберкулезом в Новосибирской
области составляет 125,4 на 100 тыс. населения,
что в 1,41 раза выше общероссийского уровня.
Не выявлен основной механизм распространения
MDR-штаммов в популяции больных туберкулезом.
Возможные механизмы распространения
MDR – штаммов M.tuberculosis
Поскольку у M.tuberculosis не обнаружены плазмиды и
отсутствует механизм обмена ДНК между штаммами,
единственной причиной возникновения лекарственной
устойчивости
являются
спонтанные
хромосомные
мутации.
Таким образом остается 2 основных механизма:
Селекция
спонтанно
возникающих
мутантных
микобактерий в результате неадекватного лечения
больного туберкулезом либо при несоблюдении курса
лечения больным.
Инфицирование
больного
извне
резистентными
мутантными микобактериями.
Для выявления доминирующего пути в
распространении устойчивых штаммов
M.tuberculosis мы планировали:
Провести детекцию мутаций в генах rpoB и katG с помощью
биочипов, производства Московского института молекулярной
биологии РАН.
Провести
генотипирование
популяции
M.tuberculosis
Новосибирской области методом IS 6110 Inverse PCR.
из
Провести генотипирование популяции M.tuberculosis из тюрем
Томской области методом MIRU-VNTR.
Выявить наличие корреляции между определенной мутацией и
принадлежностью изолята к определенному кластеру. Если
взаимосвязь существует, то это говорит в пользу распространения
MDR штаммов по пути инфицирования извне. Если взаимосвязь не
обнаружится, то это значит, что образование MDR-штаммов идет по
пути спонтанного мутагенеза.
Определение мутаций в генах rpoB и kаtG
методом гибридизации на биочипе
Наработка анализируемого фрагмента
ДНК с помощью ПЦР.
Гибридизация реакционной смеси на
биочипе.
Детектирование флуоресцентных
сигналов после гибридизации.
Обработка сигналов, выявление
доминирующих мутаций.
Принцип метода генотипирования
6110 Inverse PCR:
Особенностью этого метода является то, что
праймеры подбирают к фланкирующим районам
IS6110
в
такой
ориентации,
чтобы
амплифицировались фрагменты между соседними
инсерционными элементами IS6110.
Метод MIRU-VNTR
Variable Number of Tandem Repeats
– Frothingham et al
Mycobacterial Interspersed Repetitive Units
– Supply et al
Спектр мутаций в гене rpoB, выявленных от 170
больных туберкулезом на территории
Новосибирской области
Генотипирование 170 изолятов из
Новосибирской области методом IS6110 inverse
PCR
Изоляты, входящие в 6-ой и 5-ый
кластеры, представлены двумя
наиболее распространенными в
Новосибирской
области
генотипами и обладают более
высокой трансмиссивностью по
сравнению
с
некластеризующимися
изолятами.
Изоляты,
образующие
кластеры, которые состоят не
более чем из 6 изолятов на наш
взгляд, обладают недостаточной
способностью к распространению
в Новосибирской области либо
могут
быть
завезенными
штаммами.
Спектр мутаций, выявленных в генах rpoB и katG у
изолятов от больных из тюрем Томской области
Ген katG
4%
14%
KatG_Arg315(1)
2%
KatG_Thr315(2)
KatG_Thr315(2) +
KatG_Gly328
нет мутации
80%
Ген rpoB
2%
2%
2%
2%
2%
Ser 531--> Leu
нет мутации
Leu 533 --> Pro
His 526 --> Cys
20%
70%
His 526 --> Asp
His 526 --> Asn
Asp 516 --> Val
Результат генотипирования 51 изолята из
тюрем Томской области методом MIRU-VNTR
Среди
изолятов
идентифицировано
28
генотипов.
Процент кластеризации
составил
63%,
а
максимальный
размер
кластеров не превышал 5
изолятов.
Все проанализированные
изоляты
образуют
4
близкородственные
группы, состоящие из 27,
13, 8 и 3 изолятов.
Сравнительная характеристика доминирующих
путей возникновения MDR изолятов
Для определения механизмов распространения MDR-штаммов
M.tuberculosis нами были проанализированы частоты встречаемости
мутаций генов rpoB и katG в кластерах, обнаруженных при анализе 170
изолятов из Новосибирской области, и 51 изолята, полученного из
бактериологической лаборатории УИН Томской области.
Статистический анализ достоверности различия средних значений
осуществляли с помощью критерия Стьюдента с φ-преобразованием
Фишера и поправкой Йетса на непрерывность.
В результате анализа достоверности различия частот
появления мутаций Ser531Leu в гене rpoB в популяции
больных из Новосибирской области, нами установлено:
1.
Частота
появления
мутаций
среди
кластеризующихся штаммов M.tuberculosis
(66,7%, кластер 2, рис.1) достоверно выше, чем
частота у некластеризующихся изолятов (35,9%,
кластер 1, рис.1), устойчивых к рифампицину.
2. Частоты встречаемости мутации Ser531 Leu
у изолятов двух доминирующих кластеров 5 и 6
на рис. 1 достоверно выше, чем частоты как у
кластеризующихся изолятов (кластер 2), так и в
среднем по выборке и составляют 85,7% и
77,7% соответственно.
% встречаемости
Процент встречаемости мутации Ser 531-->Leu в
кластерах выборки из новосибирской области
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
78,5
66,7
66,7
35,9
25
28,5
26,3
Кл
ас
те
р
1
Кл
ас
т
Кл
ер
ас
2
те
р
3
Кл
-5
ас
те
р
4
-6
Кл
ас
те
р
5
Кл
Кл
ас
ас
те
те
р
6
р
2
-(
5+
6)
3. Сравнение частот встречаемости мутации
Ser531  Leu у изолятов двух доминирующих
кластеров 5 и 6 не выявил достоверных отличий.
В результате анализа достоверности различия частот
появления мутаций Ser531  Leu в гене rpo B, и Ser315 
Thr в гене katG в популяции, генотипированной методом
MIRU VNTR, нами установлено:
1. Достоверных различий между
частотами выявления мутации
Ser531  Leu в гене rpoB в
различных кластерах не было
выявлено.
2. Частота встречаемости мутации
Ser315  Thr в гене katG
достоверно выше в кластере №4
рис. 2, чем в среднем в популяции
и составляет 96,4%.
Процент встречаемости мутаций Ser 531-->Leu и KatG_Thr315(2) в
кластерах выборки из Новосибирской области
100
90
80
70
KatG_Thr315(2)
60
% 50
40
SER531 > LEU
30
20
10
0
1
2
3
Номер кластера
4
Результаты использования биочипов для определения
устойчивости к рифампицину и изониазиду.
В 85-87% случаев выявление мутации у изолята
M.tuberculosis совпадало с наличием устойчивости,
определенным с помощью метода ингибирующих
концентраций.
Спектр мутаций в гене rpoB как в Новосибирской,
так и в Томской областях ограничен и включает в себя
4 основных мутации с явным доминированием
мутации Ser531  Leu
Мы рекомендуем внедрить технологию биочипов в
клиническую
практику
как
экспресс
метод
определения устойчивости к рифампицину и
изониазиду
Анализ полученных результатов.
Во всех выявленных кластерах нами были
обнаружены мутантные штаммы. Видимо, в ходе
лечения больных туберкулезом постоянно
происходит селекционный отбор устойчивых
штаммов M.tuberculosis, образовавшихся в
результате спонтанного хромосомного мутагенеза.
Выявленная связь между кластерами и
частотами детектирования мутаций как в гене
rpoB, так и в гене katG говорит о преобладающей
роли инфицирования первично резистентными
микобактериями в распространении MDR –
штаммов.
Данная работа создана коллективом авторов:
*Сивков А.Ю., *Болдырев А.Н., *Азаев М.Ш., *Боднев
С.А., **Медведева Е.В., **Баранова О.И., **ИвлевДунтау А.П., ***Блинова Л.Н., ****Пасечников А.Д.,
*Татьков С.И.
* Государственный научный центр вирусологии и
биотехнологии “Вектор”, Кольцово, Новосибирская
область, Россия
**НМУ СМО «ФТИЗИАТРИЯ», г. Новосибирск, ул.
Петропавловская, 8, 630034
*** УИН Томской области
**** НГО "Партнеры во имя здоровья", Гарвардская
Медицинская Школа, Томск, Россия.
Работа поддержана проектами МНТЦ #2019 и #1980
Благодарю за внимание.