Лабораторная диагностика заболеваний, вызванных высокопатогенными штаммами вируса гриппа А и ОРВИ ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Брянской области» Зав. микробиологической лабораторией к.м.н. Аксютина Г.В. Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высокопатогенными штаммами вируса гриппа типа А (ВГА), у людей Временные методические рекомендации Издание официальное Москва 2009 Вирусы гриппа - классификация Семейство Orthomyxoviridae Рода Influenzavirus A Influenzavirus B Influenzavirus C А- люди, птицы, свиньи и лошади, морские млекопитающие В- только люди С- люди и свиньи AВС имеют антигенные различия (по особенностям строения нуклео и матрикс - протеинов) , Грипп A • Вызывает эпидемии и пандемии • Субтипы гриппа A отличающиеся по сочетанию двух поверхностных гликопротеинов: –Гемагглютинин (HA) = 16 типов –Нейраминидаза (NA) = 9 типов • Все субтипы вируса А циркулируют среди диких птиц • Сезонный грипп: только субтипы H1N1, H3N2 циркулируют среди людей в настоящее время • Грипп птиц – не характерные для человека субтипы (все кроме H1, H3, H2) Порядок проведения лабораторных исследований лабораторные исследования с целью диагностики ВГА проводятся у пациентов с респираторными заболеваниями тяжелого течения и неясной этиологии при наличии как минимум двух из перечисленных симптомов: - фебрильная лихорадка с температурой тела выше 380C; - насморк или заложенность носа; - боль в горле; - кашель; симптомы интоксикации; - затрудненное дыхание или дыхательная недостаточность; боли в животе Правила сбора клинического (секционного) материала • Забор материала от пациентов (или умерших) с подозрением на грипп проводят в ЛПУ после изоляции больного. • Сбор клинического материала и его упаковку осуществляет медицинский работник ЛПУ, обученный требованиям и правилам биологической безопасности при работе и сборе материала, подозрительного на зараженность ВГА. Все процедуры по забору клинического материала обученный медицинский персонал осуществляет в средствах индивидуальной защиты органов дыхания, защитных очках или щитках для защиты лица, резиновых перчатках. После процедуры отбора материала перчатки обрабатываются растворами дезинфицирующих средств, руки после снятия перчаток обрабатываются антисептиками. • Выбор времени забора клинического материала очень важен, так как наиболее высокое содержание вируса в дыхательных органах человека регистрируется в течение первых четырех дней после появления признаков заболевания. Образцы должны быть собраны в течение 3 суток после появления клинических признаков. • Для постмортальной диагностики используют аутоптаты легких, трахеи. Для исследования забирают следующие виды клинического материала: • мазки из полости носа и ротоглотки Задняя стенка глотки Зонды для взятия мазков из верхних дыхательных путей Зонды для мазков из носа и ротоглотки Не использовать зонды на деревянной основе Не использовать зонды с хлопковыми тампонами Зонды для мазков из носоглотки Как правильно держать зонды НЕ правильно Возможна травматизация пациента ! Правильно Мазки из ротоглотки 1. Мазки берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями с поверхности небных дужек, миндалин и задней стенки ротоглотки 2. Рабочую часть зонда с ватным тампоном помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида 3. Конец зонда отламывают или отрезают с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки 4. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают Мазок с задней стенки глотки Не касаться языка ! Мазки из носа / носоглотки 1. Мазки берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами 2. Зонд с ватным тампоном вводят легким движением по наружной стенке полости носа на глубину 2-3 см до нижней носовой раковины 3. Затем зонд слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, и удаляют вдоль наружной стенки полости носа, производя вращательные движения Объединенный образец Мазок из верхнего или нижнего носового хода глубина 3-5 см Мазок с задней стенки глотки, дужек и миндалин СЕКЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ • В качестве секционного материала используются ткани легких, трахеи, сегментарных бронхов • Секционный материал собирают в одноразовые полипропиленовые флаконы с завинчивающимися крышками объемом 50 мл. Направление Лечебное учреждение Отделение Ф.И.О. Возраст Материал Диагноз Дата заболевания Дата и время забора Эпидемиологический анамнез Ф.И.О. забиравшего материал Упаковка образцов 1. Все материалы, доставляемые в лабораторию, должны быть герметично упакованы: • 1) в транспортную емкость (плотно закрывающиеся пластмассовые пробирки или флаконы с завинчивающимися крышками, проверенные на герметичность); • 2) в плотный полиэтиленовый пакет подходящего размера с ватой (или другим гигроскопичным материалом) в количестве достаточном для адсорбции всего образца в случае его утечки; полиэтиленовый пакет следует герметично заклеить или запаять. 2. В отдельный полиэтиленовый пакет вкладывают бланк направления. 3. Пакеты с образцами от одного пациента вместе с направлением упаковывают во второй плотный полиэтиленовый пакет. Не допускается упаковывание образцов материалов от разных людей в один и тот же пакет. Условия хранения материала • При температуре от 2 до 8 С – в течение суток. • При температуре минус 70С или в жидком азоте – длительно. • Допускается только однократное замораживаниеоттаивание материала. Условия транспортирования материала В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: • при температуре 0-4 С – не более трех суток ПЦР - диагностика гриппа наборы для ПЦР-FRT/FEP (ФГУН ЦНИИЭ) семейство Orthomyxoviridae ВКО - FAM «Influenza virus A/B» Inf B - JOE Inf A - ROX Типирование вирусов гриппа «Influenza virus A-тип-FL» ВКО - FAM ВКО - FAM H1 - JOE H3 - JOE N1 - ROX N2 - ROX «Influenza virus A H5/N1» «Influenza virus A/H-swine» H5 - FAM N1 - JOE H5 - FAM H7 - JOE H9 - ROX ВКО - FAM Н1-swine - JOE Алгоритм проведения ПЦР-анализа (Грипп) Наличие эпидпоказаний для тестирование на пандемический грипп ПЦР-FRT «Influenza virus A/B» Influenza virus A - Реакция ОТ (37ºС) 45-60 мин РНК-10 мкл - кДНК (20 мкл) Разведение 1:2 (40 мкл) Influenza virus A + 2-2,5 ч «Influenza virus A/H1-swine» Influenza virus A/H1-swine + Influenza virus A/H1-swine - 2-2,5 ч «Influenza virus A - тип» Экстракция НК (50-100 мкл) «Рибо-преп», 20-40 мин «Рибо-сорб», 40-60 мин Influenza virus A/H1N1 + Или Influenza virus A/H3N2 + 15-30 мин Influenza virus A/H1N1 И Influenza virus A/H3N2 - Неизвестный субтип! Требуется изучение референс-центрах в ПЦР-FEP-детекция (качественный анализ)