«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» Руководитель проекта: с.н.с., к.с-х.н. Чернухин В.А. Приоритетное направление: Науки о жизни. Критическая технология: Биокаталитические, биосинтетические и биосенсорные технологии. Плановое финансирование проекта: 8,75 млн. руб. Бюджетные средства: 3,5 млн. руб., Внебюджетные средства: 5,25 млн. руб,, в том числе: - в 2014 году в размере 1 250 000 (Один миллион двести пятьдесят тысяч) рублей, - в 2015 году в размере 4 050 000 (Четыре миллиона пятьдесят тысяч) Исполнитель: Общество с ограниченной ответственностью «СибЭнзайм» Проект направлен на Расширение методологической базы для поиска и клонирования генов новых ферментов. Связанной с этим поиском расширением ферментной базы для эпигенетики, в частности, онкодиагностики. Цели проекта 1. 2. 3. Поиск в коллекции природных штаммов энтеробактерий продуцента новой МD-эндонуклеазы, кодируемой геном, последовательность которого гомологична гену МDэндонуклеазы MteI. Создание методами биоинженерии рекомбинантного штамма-продуцента новой метилзависимой сайтспецифической ДНК-эндонуклеазы (МD-эндонуклеазы), востребованной для использования в эпигенетике и онкодиагностике. Исследование полученной генетической конструкции, технологических характеристик штамма-продуцента и специфичности продуцируемой рекомбинантной МDэндонуклеазыi Конечные продукты Рекомбинантный штамм-продуцент новой метилзависимой сайт-специфической эндонуклеазы (MD-эндонуклеазы) Препарат фермента, выделенного из него. Новый фермент должен позволять детектировать эпигенетические изменения генома, проявляющиеся как определённый узор метилирования ДНК, что делает его важным инструментом в эпигенетике и онкодиагностике. Обоснование принципов детекции опухолевых клеток с помощью нового фермента. Предлагаемый принцип получения рекомбинантных штаммов-продуцентов новых MD-эндонуклеаз За основу поиска взята первичная структура белковой последовательности MDэндонуклеазы MteI (узнаёт метилированную последовательность 5’-GCGCNGCGC-3’). В базе данных ищутся гомологи в геномах энтеробактерий: Находятся консервативные последовательности Разрабатываются праймеры для ПЦР Проводится ПЦР-скрининг Амплифицированные фрагменты встраиваются в плазмиду pUC19. _____________________ Почему энтеробактерии? В разных группах энтеробактерий есть высококонсервативные последовательности, гомологичные MteI? MteI – сайт-специфическая ДНК- эндонуклеаза, расщепляющая только С5метилированную ДНК и не расщепляющая метилированную. Была собрана коллекция энтеробактерий – 97 штаммов из природных источников Высев на чашку со средой Эндо Поиск эрвиний в опухолях растений Создан нетрудоёмкий метод быстрого минипрепаративного выделения геномной ДНК из энтеробактерий. Для выделения достаточно 1/10-1/2 спичечной головки биомассы, которую можно взять с отдельного клона на чашке Петри. На выделение тратится менее 2 часов. Проведение биоиформационных исследований и разработка праймеров для проведения ПЦР-скрининга Enterobact1 (1) --------------MSAREAYRQYREAVTACKDIFARGGNVTGDYGEHLVKQLYG Enterobact2 (1) --------------MSAREAYRQYREAVTACKGIFARGGNVTGDYGEHLVKQLYG Enterobact3 (1) --------------MSAREAYRQYREAVTACKGIFARGGNVTGDYGEHLVKQLYG Enterobact4 (1) ---------------MHVKHIGSIEKRWLLAKAFFARGGNVTGDYGEHLVKQLYG MteI (1) MTEPSLPFDPTALTVRQLLAAHVAILDELTRRGLIRTRNSPLGDLAETLAVRAYG Enterobact1 (42) GELLPNSHKSADVRLDDGTLLQVKTRVNKTQLG------GIRSWDFDYLIGIQLN Enterobact2 (42) GELLPNSHKSADVRLGDGTLLQVKTRVNKTQLG------GIRSWDFDYLIGIQLN Enterobact3 (42) GELLPNSHKSADVRLGDGTLLQVKTRVNKTQLG------GIRSWDFDYLIGIQLN Enterobact4 (41) GELLPNSHKSADVRLSDGTLLQVKTRVNKTQLG------GIRSWDFDYLIGIQLN MteI (56) GTLAPNSEKSFDLTAADGRRIQVKARLVDPGDKRSQTFSAFRSFDFDAAVFVLFD Enterobact1 (91) DDAEVMLAVRVPVDVCRQIAG-YASHDNKFVIHLNGVLLKTPGVENVTEEFQSV Enterobact2 (91) DDAEVMLAVRVPVDVCRQIAG-YASHDNKFVIHLNGVLLKTPGVENVTEEFQSV Enterobact3 (91) DDAEVMLAVRVPVDVCRQIAG-YASHDNKFVIHLNSVLLKTPGVENVTEEFQSV Enterobact4 (90) EDAEVVMAVRVPVGICRQIAG-YASHDNKFVIHLNGVLLKTPGVENVTEEFRQCN MteI (111) TRSYDLLWARELTSDDVAVLGRRTEHVRATAITVRAVRAAGADVTEQLRRAYDQV Enterobact1 (144) ---Enterobact2 (144) ---Enterobact3 (144) ---Enterobact4 (144) P--MteI (166) DEPR Выравнивание аминокислотных последовательностей Enterobact1 (1) ATGAGTGCACGTGAAGCATATCGGCAGTATCGAGAAGCGGTGACTGCTTGCAAAG Enterobact2 (1) ATGAGTGCACGTGAAGCATATCGGCAGTATCGAGAAGCGGTGACTGCTTGCAAGG Enterobact3 (1) ATGAGTGCACGTGAAGCATATCGGCAGTATCGAGAAGCGGTGACTGCTTGCAAGG Enterobact4 (1) ----GTGCACGTGAAGCATATCGGCAGTATCGAGAAGCGGTGGCTGCTTGCAAAG Consensus (1) ATGAGTGCACGTGAAGCATATCGGCAGTATCGAGAAGCGGTGACTGCTTGCAAGG Enterobact1 (56) ACATTTTT-GCCCGAGGTGGTAATGTCACTGGTGATTACGGTGAACATCTCGTAA Enterobact2 (56) GCATTTTT-GCCCGAGGTGGTAATGTCACTGGTGATTATGGTGAACATCTCGTAA Enterobact3 (56) GCATTTTT-GCCCGAGGTGGTAATGTCACTGGTGATTATGGTGAACATCTCGTAA Enterobact4 (52) GCATTTTTTGCCCGAGGTGGTAATGTCACTGGTGATTATGGTGAACATCTCGTAA Consensus (56) GCATTTTT GCCCGAGGTGGTAATGTCACTGGTGATTATGGTGAACATCTCGTAA Enterobact1 (110) AGCAACTTTATGGTGGTGAATTATTGCCAAACTCCCATAAAAGCGCCGATGTCAG Enterobact2 (110) AGCAACTTTATGGCGGTGAATTATTGCCAAACTCCCATAAAAGCGCCGATGTAAG Enterobact3 (110) AGCAACTTTATGGCGGTGAATTATTGCCAAACTCCCATAAAAGCGCCGATGTAAG Enterobact4 (107) AGCAACTTTATGGGGGTGAATTATTGCCAAACTCCCATAAAAGCGCCGATGTAAG Consensus (111) AGCAACTTTATGGCGGTGAATTATTGCCAAACTCCCATAAAAGCGCCGATGTAAG Выравнивание высококонсервативных нуклеотидных последовательностей последовательнсотей Enterobact1 (165) ATTAGACGATGGCACGCTGTTGCAGGTCAAAACCAGAGTCAATAAAACCCAGTTA Enterobact2 (165) ATTAGGCGATGGCACGCTATTGCAGGTCAAAACCAGAGTCAATAAAACCCAGTTA Enterobact3 (165) ATTAGGCGATGGCACGCTATTGCAGGTCAAAACCAGAGTCAATAAAACCCAGTTG Enterobact4 (162) ATTAAGCGATGGGACGCTGTTGCAGGTCAAAACCAGAGTCAATAAAACCCAGTTA Consensus (166) ATTAGGCGATGGCACGCTGTTGCAGGTCAAAACCAGAGTCAATAAAACCCAGTTA Enterobact1 (220) GGCGGAATTCGCTCCTGGGATTTCGATTACCTGATCGGTATTCAGCTTAATGACG Enterobact2 (220) GGCGGAATTCGCTCCTGGGATTTCGATTACCTGATCGGTATTCAGCTTAATGACG Enterobact3 (220) GGCGGAATTCGCTCCTGGGATTTCGATTACCTGATCGGTATTCAGCTTAATGACG Enterobact4 (217) GGCGGAATTCGCTCCTGGGATTTCGATTACCTGATCGGCATTCAGCTTAATGAAG Consensus (221) GGCGGAATTCGCTCCTGGGATTTCGATTACCTGATCGGTATTCAGCTTAATGACG Enterobact1 (275) ATGCCGAAGTCATGTTGGCAGTTCGTGTCCCTGTAGATGTTTGTCGCCAAATTGC Enterobact2 (275) ATGCCGAAGTCATGTTGGCAGTTCGTGTCCCTGTAGATGTTTGTCGCCAAATTGC Enterobact3 (275) ATGCCGAAGTCATGTTGGCAGTTCGTGTCCCTGTAGATGTTTGTCGCCAAATTGC Enterobact4 (272) ATGCCGAAGTAGTGATGGCAGTTCGTGTCCCTGTGGGTATTTGTCGCCAAATTGC Consensus (276) ATGCCGAAGTCATGTTGGCAGTTCGTGTCCCTGTAGATGTTTGTCGCCAAATTGC Enterobact1 (330) CGGATATGCCAGCCATGATAACAAATTTGTGATCCATCTTAATGGCGTGCTTCTT Enterobact2 (330) CGGATATGCCAGCCATGATAACAAATTTGTGATCCATCTTAATGGCGTGCTTCTT Enterobact3 (330) CGGATATGCCAGCCATGATAACAAATTTGTGATCCATCTTAATAGCGTGCTTCTT Enterobact4 (327) CGGATATGCCAGCCACGATAACAAATTTGTGATTCATCTCAATGGCGTGCTTCTT Consensus (331) CGGATATGCCAGCCATGATAACAAATTTGTGATCCATCTTAATGGCGTGCTTCTT Enterobact1 (385) AAAACGCCTGGCGTAGAAAACGTCACTGAAGAGTTTCAGTCAGTGTAATCCCTAA Enterobact2 (385) AAAACGCCTGGCGTAGAAAACGTCACCGAAGAGTTTCAGTCAGTGTAA------Enterobact3 (385) AAAACGCCTGGCGTAGAAAACGTCACTGAAGAGTTTCAGTCAGTGTAA------Enterobact4 (382) AAAACGCCTGGCGTAGAAAACGTCACTGAAGAGTTTC-GTCAATGTAATCCTTAA Consensus (386) AAAACGCCTGGCGTAGAAAACGTCACTGAAGAGTTTCAGTCAGTGTAATCC TAA Высококонсервативные гомологи обнаружены в родах Escherichia, Klebsiella, Cronobacter , Erwinia. По итогам описанных биоинформационных исследований был проведён дизайн трёх праймеров (один прямой и два обратных): Entero direct Entero reverse 1 Entero reverse 2 5' - ATGAGTGCACGTGAAGCATATC-3' 5'-TTAGGGATTACACTGACTGAAACTCTTC- 3' 5’- TTACACTGACTGAAACTCTTC -3’. ПЦР-скрининг Фрагмент №17 был встроен в полилинкер pUC19 по сайту SmaI Полученная плазмида получила временное обозначение pEsp17 Тестирование сайт-специфической MDнуклеазной активности в клоне № 17 М- маркёр 1 kb; 1 – 3 мкл лизата; 2 – 1 мкл лизата; 3 – 1/3 мкл лизата. Анализ экспериментального образца – препарата рекомбинантной плазмиды Esp17 согласно ПМ Клоны E.coli штамма XLGold, выросшие после трансформации 0,1 мкл препаратом плазмиды - Тестирование активности целевого фермента в 5 трансформантах (последовательные разведения лизата – 3, 1 и 1/3 мкл) Анализ экспериментального образца – биомассы штамма-продуцента согласно ПМ 1-6 – последовательные 2кратные разведения лизата в реакционной смести, содержащей pHspAI10/(DriI+M.Fsp4H) в SEбуфере «W»; 7 – исходная ДНКpHspAI10/(DriI+M.Fsp4H); 8 – ДНК фага λ; 9 – ДНК фага λ в SE-буфере «Y», обработанная 1 мкл лизата. Анализ экспериментального образца – препарата MD-эндонуклеазы согласно ПМ 1-10 – последовательные разведения препарата Esp17 в 2 раза в SE-буфере «W» c ДНК pHspAI10/(DriI+M.Fsp4H), начиная от аликовоты 1 мкл на 20 мкл реакционной смеси; 11 ДНК pHspAI10/(DriI+M.Fsp4H); 12 – ДНК фага λ; 13 - ДНК фага λ, обработанная 1 мкл Esp17; М – маркёр 1 kb. Анализ сайт-специфичности Esp17 на различных С5-метилированных ДНК 1 – pMHpaII/DriI; 2 – pMHpaII/DriI + Esp17; 3 – pMHaeIII /DriI; 4 – pMHaeIII I/DriI + Esp17; 5 – pHspAI2; 6 – pHspAI2/DriI + Esp17; 7 – pHspAI10/DriI; Выводы: - полученный гомолог MteI отличается от него способностью расщеплять последовательность 5’GCNGC-3’ в плазмиде pFsp4HI3 (дорожка 12) - Наряду с 5’-GCNGC-3’ расщепляет по-видимому и другие последовательности в pHspAI10/(M.Fsp4HI+DriI)+ Esp17 8 – pHspAI10/DriI + Esp17; 9 – pHspAI10/(M.Fsp4HI+DriI); 10 – pHspAI10/(M.Fsp4HI+DriI)+ Esp17; 11 – pFsp4HI3/DriI; 12 – pFsp4HI3/DriI + Esp17; 13 – pBstMW2/DriI; 14 – pBstMW2/DriI + Esp17; M – маркёр 1 kb. Предварительные выводы: Новая рекомбинантная эндонуклеаза Esp17 отличается от его гомолога MteI, узнающего 8-нуклеотидную последовательность 5’-GCGCNGCGC-3’ и узнаёт и расщепляет С5-метилированную последовательность 5’GCNGC-3’ и отличается от его гомолога MteI. Требуются дальнейшие экспериментальные исследования по уточнению сайт-специфичности данного фермента. Активность фермента в рекомбинантном штамме достаточна для его промышленного производства. Полученные новые данные о структуре MDэндонуклеазы могут быть использованы для усовершенствования методов поиска и клонирвоания новых ферментов.