Рекомбинантные белки, современные способы получения и свойства каф. мол. биологии, МГУ 16.10.08 Общий метод получения рекомбинантного белка 1. Молекулярное клонирование гена или его фрагмента 2. Трансформация клеток, отбор клонов 3. Выращивание культуры или организма 4. Выделение и очистка белка Молекулярное клонирование Электропорация 25 мкФ = 2500 В при 200 Ω за 5 мс Отбор клонов protein Использование рекомбинантных белков •Научные исследования – внесение мутаций, гомогенные ферменты, структурные исследования, слитые белки, антигены и т.д. •Все остальное – биотехнологическое применение Экологические Биотехнологии - технологиии, использующие живые организмы или продукты их жизнедеятельности в производстве и переработке различных продуктов Промышленные (стиральные порошки) Аграрные (силос, ГМ растения) Медицинские Диагностические (ИФА, ПЦР) Лечебные Вакцины Белки Терапия ДНК Белки ДНК Медицинские Лечебные Терапия Вакцины ДНК генотерапия, антисенстехнология, siRNA. аптамеры, рибозимы Белки Белки ДНК-вакцины Из прирдных источников Синтетические Рекомбинантные Культивируемые клетки Трансгенные животные Рекомбинантные белки для лечения заболеваний: особые требования • Высокая степень очистки • Точная копия природного белка или научные доказательства безопасности мутаций для пациентов • Проверенный, стабильный и безопасный продуцент • Как можно более полное удаление ВСЕХ биополимеров и пирогенов продуцента (ДНК <10 пг/мг) • Раствор или порошок, в котором белок полностью сохраняет свои свойства не менее 1 года • Полная демонстрация стабильности, качества и обоснованности процесса получения – GMP (Good Manufacturing Process) Используемые системы экспресии • Бактерии Esherichia coli и Bacillus subtilis • Дрожжи Saccharomyces cerevisae и Pichia pastoris • Линии клеток млекопитающих CHO, BHK, A293 • Трансгенные животные Экспрессионный вектор • Точка инициации репликации - ORI • Селекционные маркеры • Промотор целевого гена • Терминатор транскрипции • Полилинкер - MCS Бактерия Esherichia coli Преимущества • Быстрый рост (6-12 часов от посева до окончания индукции) • Относительно высокий выход целевого белка (1002000 мг/л) • Низкая цена ростовой среды (натуральные простые компоненты) • Низкая стоимость ферментации • Возможность получать микрокристаллы целевого белка (тельца включения) Недостатки • Затруднен биосинтез крупных полипептидов (>50 кДа) • Нет системы гликозилирования • Ограниченные возможности секреции белков • Многие гетерологичные белки токсичны для клеток • Затруднено образование дисульфидных связей • Многие гетерологичные белки образуют только тельца включения E.coli – пример системы экспресии • Внехромосомная репликация вектора • Индуцибельный промотор • Специальный штамм • Дополнительный остаток Met[-1] или лидерный пептид • Блок стоп-кодонов E.сoli – варианты систем экспрессии Системы экспрессии в E.coli Цитоплазматическая экспрессия Нерастворимый белок (тельца включения Растворимый белок Секреция в периплазму Растворимый белок E.coli – примеры использования Белки • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Bactericidal/permeability-increasing Protein, rDNA Carboxypeptidase, rDNA G-CSF, rDNA/Amgen GM-CSF, rDNA/Schering-Plough Hyaluronidase, rDNA Insulin-like Growth Factor-1, rDNA/Tercica Interferon alfa-2a, rDNA Interferon alfa-2b, rDNA Interferon alfacon-1, rDNA Interferon betaser, rDNA/Berlex Interferon gamma, rDNA Interleukin-1ra, rDNA Interleukin-11, rDNA Interleukin-2, rDNA/Chiron Keratinocyte growth factor, rDNA Somatropin, rDNA/ Somatropin antagonist, rDNA, PEGT4 Endonuclease, rDNA, Liposomal TNF, rDNA tPA, rDNA/PDL Urokinase Plasminogen Activator, rDNA Слитые белки • • Interleukin-13–Pseudomonas toxin, rDNA Interleukin-2/diphtheria toxin, rDNA Вакцины • • • • • Cholera Vaccine (rDNA)/SBL Staphylococcus vaccine (rDNA) Anthrax Vaccine, rDNA/VaxGen Lyme Vaccine, rDNA/Aventis Pertussis Toxoid, rDNA Пептиды • • • • • • • Calcitonin, rDNA Glucagon, rDNA/Lilly Insulin, rDNA/Lilly Insulin glargine, rDNA Natriuretic peptide, rDNA Parathyroid hormone (1-34), rDNA Parathyroid hormone (1-84), rDNA Антитела и фрагменты антител • • • • Complement C5 Mab, rDNA Heat shock protein Mab Mab, rDNA TNF Mab Fab', rDNA, PEGVEGF Mab Fab, rDNA Дрожжи Pichia pastoris Преимущества • • • • • • • Относительно быстрый рост (3-5 • дней от посева до окончания индукции) • Высокий выход целевого белка (до 40 г/л) • Очень низкая цена ростовой среды (глицерин, метанол, аммиак) Умеренная стоимость ферментации Возможна экспрессия крупных полипептидов (>50 кДа) Возможно гликозилирование Секреция белка в ростовую среду, низкий уровень секреции протеаз Недостатки N-гликозилирование дает иммуногенные олигосахариды Не все белки эффективно секретируются Патентные ограничения на промышленное использование P.pastoris – получение продуцента P.pastoris – схема ферментации P.pastoris – примеры использования • Alfimeprase - Accfib; 3203-fibrolase (3-serine) (Agkistrodon contortrix recombinant) • DX-88; ecallantide; kallikrein inhibitor protein, recombinant Линия клеток CHO Преимущества • Пригодна для белков любого размера • Любые пост-трансляционные модификации • Не содержит трансмиссивных вирусов • Существует сублиния DG44, дефектная по гену DHFR (легкая амплификация кассет) Недостатки • Большое время создания продуцента (до 1 года) • Медленный рост ( промышленное культивирование до 200 дней) • Требует соблюдения полной стерильности и защиты от заражения вирусами • Некоторые ферментные системы пост-трансляционных модификаций имеют ограниченные возможности и требуют оверэкспрессии генов • Ограниченный пролиферативный потенциал (до 25 пассажей) • Дорогая культуральная среда CHO – вариант системы экспресии • Внехромосомная репликация вектора • Индуцибельный промотор • Специальный штамм • Дополнительный остаток Met[-1] или лидерный пептид • Блок стоп-кодонов Methotrexate (MTX) Selection Gene of interest DHFR Transfect dfhr- cells Grow in Nucleoside Free medium Culture a Colony of cells Grow in 0.05 uM Mtx Culture a Colony of cells Methotrexate (MTX) Selection Grow in 0.25 uM Mtx Culture a Colony of cells Grow in 5.0 uM Mtx Culture a Colony of cells Foreign gene expressed in high level in CHO cells CHO – примеры использования Гормоны и цитокины Антитела •Bone Morphogenic Protein-2, rDNA •Bone Morphogenic Protein-7, rDNA •EPO, rDNA/Amgen •EPO, darb-, rDNA •Corifollitropin alfa, rDNA •FSH rDNA/Schering-Plough •G-CSF, rDNA/Sanofi •Luteinizing hormone, rDNA •Interferon beta-1a, rDNA/Biogen •Insulin-like Growth Factor-1/IGFBP-3, rDNA •Thyroid stimulating hormone, rDNA •hCG, rDNA •CD11a Mab, rDNA •CD20 Mab, rDNA •CD20 Mab, rDNA conc. •CD20 Mab, rDNA/Y-90 & In-111 radioconj. •CD52 Mab, rDNA •EGF receptor Mab, human, rDNA/Amgen •HER2 receptor Mab, rDNA •Immunoglobulin E Mab, rDNA •RANKL Mab, rDNA •TNF Receptor-IgG Fc, rDNA •VEGF Mab, rDNA •CTLA4-Ig, rDNA •LFA-3/IgG1, rDNA Ферменты Система свертываемости крови •Arylsulfatase B, rDNA •DNase, rDNA •Galactosidase, beta rDNA •Glucocerebrosidase, rDNA •Glucosidase, rDNA •Iduronidase, rDNA •Factor IX, rDNA/Wyeth •Factor VIII, rDNA/Baxter •Factor VIII BDD, rDNA, PFM •tPA, rDNA/Genentech •tPA, TNK-, rDNA •Thrombin, rDNA Иван И. Воробьев, лаборатория медицинской биотехнологии Гематологического научного центра РАМН, лаборатория биокатализа Института биоорганической химии РАН, ptichman@gmail.com Слайды можно скачать: lmbt.ru/lectures/kmb08.ppt