Поиск диагностических морфологических признаков и генетических маркеров у ели европейской (Picea abies) и ели сибирской (P. obovata) и определение видовой принадлежности елей Северной Карелии Борисова П. Научныe руководители: Волкова П.А. Ильинский В.В. Введение P. obovata Зона гибридизации P. abies P. abies P. obovata Зона гибридизации ледник Цель поиск видоспецифичных морфологических диагностических признаков и генетических маркеров у P. abies и P. obovata и определение видовой принадлежности елей Северной Карелии. Материалы и методы 141 дерево (149 шишек), 10 популяций Северная Карелия (4) Ненецкий АО (1) Красноярский край (2) Германия (3) Наша работа P. abies Морфология 10-16 см Длина шишек: P. obovata 4-6 (8) см коэффициент сужения: DSL/HS*100 коэффициент вытянутости: (LS-DS)/HS*100 значение разности коэффициентов сужения и вытянутости: P. abies P. obovata –5 5 Геометрическая морфометрия – описание формы без размеров объекта Классическая морфометрия Длина шишки, наибольшая ее ширина и расстояние до нее от основания шишки; для чешуи – аналогично Вторичные показатели: отношение длины к ширине и отношение положения наибольшей ширины к длине для чешуи и шишки коэффициенты сужения и вытянутости и их разность Геометрическая морфометрия Распределение исследованных образцов в пространстве двух первых главных компонент (классификация по совокупности морфологических промеров) ь Длина шишек для популяций С. Карелия P. obovata P. abies Отношение длины шишки к ее ширине С. Карелия P. obovata P. abies Разность коэффициентов сужения и вытянутости С. Карелия P. obovata P. abies Распределение исследованных растений в пространстве двух первых главных компонент для результатов геометрической морфометрии Усредненные контуры чешуй Молекулярно-генетическая часть P. abies Постепенный переход P. obovata изменение частот аллелей некоторых генов с запада на восток Маркеры в хлоропластной и митохондриальной ДНК Разграничивают виды, но важны частоты маркеров в популяции => нужны большие выборки полиморфизм одиночных нуклеотидных замен (Single nucleotide polymorphism, SNP) Возможно использовать для различения видов Материалы и методы Поиск нужных участков ДНК Выделение ДНК (по базе данных) Подбор праймеров Получение копий этих участков (ПЦР) Электрофорез определение последовательности нуклеотидов Результаты и обсуждение Выбранные последовательности ДНК (в скобках – условные названия) 4 участка ДНК – два ядерных (220 и 467), один митохондриальный (МТ) один хлоропластный (TRN) Подбор параметров ПЦР 58°, 60°, 10 сек 10 сек 62°,10 сек 61°, 10 сек 64°, 5 сек 60°, 5 сек 65°, 5 сек 67°, 5 сек Полученные последовательности SNP в 427 позиции для участка для хлоропластного участка. GB – последовательности GenBank вид P. abies (GB) P. obovata (GB) P. abies P. obovata Карельские ели нуклеотид С A C A A SNP для ядерного участка (220) GB – последовательности GenBank Выводы Найден участок хлоропластной ДНК, который можно рекомендовать для дальнейшей разработки маркера для разграничения P. abies и P. obovata. Разработаны праймеры и подобраны оптимальные параметры ПЦР для анализа SNP на этом участке. P. abies, P. obovata различаются длинной шишек и формой чешуи, описанной как классической, так и геометрической морфометрией. Карельские ели, согласно данным геометрической морфометрии, относятся к P. × fennica, согласно классической морфометрии – к P. obovata . Благодарности Часть материала для настоящей работы собрана в ходе Беломорской экспедиции Московской гимназии на Юго-Западе (№1543). Автор благодарит научных руководителей Волкову Полину Андреевну и Ильинского Валерия Владимировича; Л. Абрамову, П. Волкову, П. Петрова, А. Еськову, Е.Трушину, К. Трушина за помощь в сборе материала. Д.В. Ребрикова за ценные указания и помощь в написании работы, а так же коллектив ЦКП «Генный полиморфизм» за предоставленную возможность проведения работы. Также автор признателен рецензенту Д. Кнорре за ценные замечания о данной работе и С. М. Глаголеву за организацию практики. Спасибо за внимание Геометрическая морфометрия Метод тонких пластин 20 равноудаленных точек по всему контуру Координаты меток – экранный дигитайзера tpsDig Координаты эталонной конфигурации, значения главных, относительных и частных трансформаций – программа tpsRelw Усредненные контуры чешуй – программа tpsSuper Редактирование и конвертирование файлов данных – вспомогательная программа tpsUtil Расположение карельских популяций Чупа биостанция губа Чупа Кандалакшского залива Белого моря Анализ главных компонент Однофакторный дисперсионный анализ с последущим попарным сравнением выборок тестом Вилкоксона с поправкой Бонферрони. Использовали статистическую среду R Вид № попул я ц и и LC LC/HC DC/LC LS/HS DS/LS CP CN CN – CP b 62±11 1.92±0.30 0.39±0.10 1.40±0.18 0.69±0.05 43±7 53±11 10±14 c 58±10 1.94±0.25 0.39±0.09 1.31±0.15 0.65±0.06 45±11 56±14 10±17 d 65±12 2.20±0.22 0.39±0.12 1.35±0.13 0.68±0.05 43±9 58±15 15±21 e 57±9 2.01±.28 0.33±0.1 1.36±0.16 0.67±0.05 45±8 59±13 15±15 f 57±9 2.04±0.31 0.34±0.08 1.32±0.19 0.63±0.06 50±13 71±8 21±19 g 61±8 2.17±0.23 0.41±0.0 1.30±0.11 0.71±0.08 37±11 73±8 35±12 h 68±4 1.99±0.48 0.40±0.1 1.42±0.08 0.68±0.08 46±12 62±6 16±14 i 118±13 2.78±0.23 0.40±0.08 1.37±0.13 0.63±0.05 54±20 37±8 -14±13 j 110±18 2.50±0.15 0.40±0.07 1.48±0.13 0.64±0.06 53±10 43±3 -10±11 k 105±10 3.09±0.77 0.34±0.03 1.37±0.13 0.62±0.02 52±3 40±9 -12±6 Карелия P. obovata P. abies значения коэффициента вытянутости (CP) коэффициент сужения (CN ) Отношение положения наибольшей ширины чешуи к ее длине (DC/LC) Геометрическая морфометрия Выделение ДНК ДНК выделяли из высушенной хвои используя метод СТАВ. К 10-20 хвоинкам добавляли 500 мкл лизирующего буфера (0,2 М Tris-HCl pH 8,0, 0,05М EDTA, 2М NaCl, 2% СТАВ), образец вместе с буфером гомогенизировали в фарфоровой ступке. После проводили очистку ДНК с помощью стандартной методики фенол-хлороформной экстракции (Chomczynski, Sacchi, 1987): Добавляли 400 мкл фенола pH=7,2, хорошо перемешивали. Добавляли 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1), хорошо перемешивали. Центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин (16000 g). Переносили водную фазу в новую пробирку 1,5мл и добавляли в нее 800 мкл 100% изопропанола, хорошо перемешивали. Центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин. Полностью удаляли надосадочную жидкость. Добавляли 400 мкл 70% этанола, хорошо перемешивали. Центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин Полностью удаляли надосадочную жидкость и высушивали осадок при комнатной температуре (не более 10 мин). Растворяли осадок в 50 мкл TE (Tris EDTA) буфера путем инкубирования при 65° С с периодическим перемешиванием. В дальнейшем образцы хранили при температуре – 20° С. Общий объем смеси для ПЦР на одну пробирку составлял 25 мкл 17,5 мкл воды 2,5 мкл 10-ти кратного ПЦР-буфера 0,5 мкл раствора dNTP's (25мМ каждого) – дезоксинуклеотидтрифосфатов 0,15 мкл каждого праймера 1 мкл ДНК 0,5 мкл HS Taq-полимеразы (ЗАО «Евроген») Результаты и обсуждения Выбранные видоспецефичные последовательности ДНК Название участка Участок Номера в GenBank 1 – P. abies 2 – P. obovata Праймеры/название праймера 467 conserved ortholog PgTRX_WS00935.B21_B17 1. EU309976.1 2.EU309990.1 220 conserved ortholog set (COS) PgTRX_20992 1. EU309947.1 2.EU309961.1 GCTTGCTAAGAGTGGAACCTGTTC (220-D) ACGACTTGTTATGCACTGGGCTTG (220-R) TRN isolate ABI2b tRNA-Thr (trnT) gene, partial sequence; tRNA-Leu (trnL) gene, complete sequence; and tRNA-Phe (trnF) gene 1. EU364798.1 2.EF440555.1 TGAATGTAGATTGTAGATTCCTTCAAG (TRN-D) GTCCGTAGCGTCTACCGATTTCG (TRN-R) MT NADH dehydrogenase subunit 1 (nad1) gene, intron 2 and partial cds 1. EF440449.1 2. EF440476.1 TCTATAGATAGAGAGATAGTAGCGAG (MT-D) CTCAAAGGGCTAGCTAGAAGGTAAG (MT-R) set (COS) GTCAAGCAGGCCACGTGGGTC (467-D) AGTTGGAGGACCTAGGGAGGAG (467-R)