Водородные связи Что стабилизирует двойную спираль ДНК?

Стабилизация
двойной спирали ДНК
Что стабилизирует двойную спираль ДНК?
1) Водородные
связи
A•T - 2 водородные связи
G•C - 3 водородные связи
Что стабилизирует двойную спираль ДНК?
1) Водородные связи
G•C - 3 водородные связи
A•T - 2 водородные связи
Важны для специфичности и стабилизации
2) Стэкинг-взаимодействия
Стэкинг ароматических колец азотистых оснований стабилизруется
гидрофобными взаимодействиями и дипольными взаимодействиями.
Различные последовательности имеют различные стэкингвзаимодействия, т.е. ароматические кольца могут
иметь различный стэкинг
(«лучше» или «хуже).
Термодинамические
параметры могут быть
расcчитаны для
различных
динуклеотидных
шагов.
Стэкинг-взаимодействия
B
Hydrogen
Bonds
Charge
repulsion
Charge repulsion
Stacking
interactions
3). Ионные взаимодействия
Основания гидрофобны; PО-2 – гидрофильны, но электростатическое
отталкивание дестабилизирует двойную спираль. Для стабилизации
необходимы противоионы – одновалентные катионы металлов.
4). Гидратация.
Упорядоченная
гидратная (связанная) вода
(хребет гидратации
в малом желобке).
Денатурация ДНК
Double-stranded DNA
Strand separation
and formation of
single-stranded
random coils
Extremes in pH or A-T rich regions
high temperature denature first
Cooperative unwinding
of the DNA strands
При нагревании две комплементарные нити
ДНК расходятся – ДНК плавится
q
pure DNA
70
80
90
0
100 T, C
Энергетические характеристики
структурного перехода спираль – клубок:
изменение энтальпии Н,
изменение энтропии S,
изменение свободной энергии G.
G = Н + Т S
Н = СрdT
S = (Ср/Т)dT
Поглощение в
УФ диапазоне
path length, usually 1 cm
A=εcl
absorbance
concentration
сoefficient extinction
ГИПОХРОМИЗМ
Absorbance
Absorbance maximum
for single-stranded DNA
Absorbance
maximum for
double-stranded DNA
220
260
300
The absorbance at 260 nm of a DNA solution increases
when the double helix is melted into single strands.
Денатурация
ДНК
Hyperchromic effect:
• stacking of nucleotide bases decreases ε.
• bases in ss absorb more than bases in ds.
• absorbance increases as DNA denatures.
Кривая плавления
 = (A - Aсп)/(Aкл – Aсп),
через Aсп и Aкл обозначено
поглощение ДНК в полностью
спиральном и полностью
клубкообразном состоянии,
соответственно. Этот метод
позволяет регистрировать  с
точностью, превышающей
0,1%.
 Тпл
Tпл – температура середины перехода
(Т) = Q(T)/ Q0
кривая плавления по
данным калориметрии
Тпл – температурный интервал перехода
где Q(T) = (Ср/Т)dT,
(интегрирование по всему
температурному интервалу)
Q0 = (Ср/Т)dT
(интегрирование по
температурному интервалу
перехода  Тпл)
Проанализируем еще раз силы, стабилизирующие конформацию
двойной спирали ДНК.
Пусть двойная спираль является при заданных условиях равновесной
конформацией и свободная энергия Гиббса G имеет минимальную величину.
Для получения такого эффекта необходимо, чтобы уменьшение энтальпии Н
при образовании упорядоченной структуры не только компенсировало, но и
заметно превосходило бы противоположное по знаку изменение энтропийного
члена -TS, вызванное уменьшением энтропии при образовании
упорядоченной конформаци.
Т.е. чтобы скомпенсировать эффект увеличения порядка, атомы
полимерных цепей должны взаимодействовать сильнее, чем это происходит в
неупорядоченной системе.
Об
энергии
внутримолекулярных
взаимодействий можно судить, измеряя изменение
энтальпии,
которое
происходит
при
конформационном
переходе
типа
порядокбеспорядок.
Вид кривых плавления, полученный из
экспериментов показывает, что кооперативные
связи в макромолекуле частично разрушаются при
повышении температуры, но до какого-то момента
двойная спираль сохраняется.
Переход ДНК из упорядоченной структуры в неупорядоченную
протекает с образованием промежуточных состояний.
При плавлении двойной спирали ДНК промежуточные
состояния – это петлеобразные частично расплетенные структуры.
Термодинамически конформационный переход спиральклубок протекает как переход между двумя состояниями.
Это похоже на плавление белков с возникновением состояний
типа "расплавленная глобула", но это состояние в ДНК не оказывает
влияния на ход кооперативного перехода в целом, который протекает
по законам перехода между двумя макроскопическими состояниями.
Процесс увеличения расплавленной области на одно звено
Кооперативность переходов обусловлена тем, что образование границ
между формами связано с увеличением свободной энергии всей
молекулы.
Теория кооперативных переходов, основанная на феноменологическом
описании переходов с помощью статистической термодинамики,
разработана достаточно полно для различных типов полинуклеотидов.
При рассмотрении переходов используют различные варианты
модели Изинга в варианте, разработанном Зиммом.
Согласно этой модели причиной кооперативности плавления
ДНК являются межплоскостные взаимодействия пар оснований.
Пусть F - изменение свободной энергии при межплоскостной
ассоциации двух изолированных и связанных водородными связями
пар оснований.
Тогда кооперативность перехода можно характеризовать с
помощью фактора кооперативности
 = exp(-F/kT)
В случае гомополинуклеотидов ширина интервала перехода
связана с фактором кооперативности соотношением:
Т=(12,4RT2m/H) 2/3
т.е. интервал перехода пропорционален 2/3
Таким образом, переход спираль-клубок у ДНК характеризуется
энтальпией перехода Н, температурой плавления Тm, интервалом
плавления Тm.
Для ДНК со случайной последовательностью оснований и
примерно одинаковым содержанием ГЦ и АТ-пар
(например, ДНК из тимуса теленка,)
температура перехода Тm = 860
энтальпия перехода Н = 8.8 ккал/моль нуклеотидов,
при рН 6 и концентрации соли 0.15 М Na+.
Переход типа порядок-беспорядок в НК, так же как у
белков, сходен по внешнему виду с фазовым переходом первого
рода, но фактически является не фазовым, а кооперативным
переходом с конечным, но не нулевым, интервалом перехода.
Кооперативность связей в молекуле ДНК обеспечивается
наличием
водородных
связей
между
комплементарными
основаниями двух одиночных спиралей, стэкингом оснований
вдоль
спиралей
и
электростатическим
отталкиванием
отрицательно заряженных фосфатных групп.
Денатурация ДНК
Percent hyperchromicity
Tm is dependent on
the G-C content of the
DNA
50
E. coli DNA is
50% G-C
60
70
Temperature oC
80
Average base
composition
(G-C content) can be
determined from the
melting temperature of
DNA
Кривая плавления ДНК зависимость  от T, обладает
тонкой структурой, если длина
ДНК не превышает нескольких
десятков тысяч пар оснований.
Эта
тонкая
структура
проявляется на дифференциальной
кривой плавления, зависимости
d()/dT от T.
Конкретный
профиль
плавления, который отражают
такие
кривые,
определяется
последовательностью оснований в
исследуемой ДНК. Пики на
дифференциальных
кривых
плавления связаны с выплавлением
в интервале в несколько десятых
градуса
отдельных
участков
молекулы с размером в несколько
сотен пар оснований.
Дифференциальные кривые плавления
для фрагмента ДНК фага fd.
Ренатурация ДНК
Double-stranded DNA
Denatured,
single-stranded
DNA
k2
Slower, rate-limiting,
second-order process of
finding complementary
sequences to nucleate
base-pairing
Faster,
zippering
reaction to
form long
molecules
of doublestranded
DNA
Связывание лигандов
с ДНК
R1
H
N
8
O
O
N
9
7
H
N
6
11
5
12
NH2
1
10
2
4
3
O
CH3
R2
O
CH3
Связывание лигандов
с ДНК

DNA
DNA - 6-AZC
1,0
0,8
0,6
Tm

0,4
0,2
0,0
40
45
50
55
60
65
70
T,oC
Связывание лигандов
с ДНК
в малом желобке
(нетропсин)
по типу интеркаляции
(актиномицин D)
Параметры связывания лигандов с ДНК
(в условиях мультимодальности)
Спектрофотометрия
457 нм
449 нм
Система
n1
K1
n2
K2
Pf – ДНК, I=0,02М
2,0±0,1
(1,1±0,5)·104 М-1
7,0±0,5
(5,2±0,5)·105 М-1
Pf – ДНК, I=0,1М
2,0±0,1
(0,8±0,5)·104 М-1
7,0±0,5
(5,2±0,5)·105 М-1
Act II-ДНК
3,0±0,1
(1,2±0,5)·105 М-1
12,0±0,2
(1,5±0,5)·106 М-1
Act III-ДНК
3,0±0,1
(1,9±0,5)·105 М-1
12,0±0,2
(1,4±0,5)·106 М-1