Использование двухфотонной флуоресцентной микроскопии для исследования липофусциновых гранул и детектирования клеточных

Использование двухфотонной флуоресцентной микроскопии для
исследования липофусциновых гранул и детектирования клеточных
органелл in situ
Золотавин П. Н.
к.ф.-м.н. Петрухин А. Н.
Цели работы
• Реализация методики двухфотонной микроскопии с
одновременным измерением различных параметров
флуоресценции. Исследование липофусциновых гранул.
• Исследование параметров флуоресценции ДМХ in situ в
клетках HeLa.
• Проверка возможности детектирования клеточных
органелл по изменению параметров флуоресценции ДМХ.
Двухфотонная флуоресцентная микроскопия
Преимущества:
•Высокая контрастность
•Объемное сканирование
Лучи 4 и 5 попадают в
детектор. Полезный
сигнал увеличивается
Схема экспериментальной установки
Экспериментально достигнутое
разрешение
Флуоресцентный микроскоп
Обычный оптический микроскоп
FWHM боковое  0.37
FWHM акс. 
8х8 мкм
n 

NA
0.64  
n2  NA2

Объектив: Olympus 100x NA=1,25
Достигнутое
разрешение
Горизонтальное и вертикальное сечения шарика
Теоретиче
ское
Экспери
мент.
Вертикальное
0,7 мкм
1,3 мкм
Горизонтальное
300 нм
400 нм
Изображения липофусциновых гранул
Скопление гранул, двухфотонная
микроскопия, 32х32 мкм.
А2Е
Изо-А2Е
Отдельная гранула,
изображение получено с
помощью АСМ, 4х4 мкм.
Сканирование клетки HeLa in situ с
помощью флуоресцентного зонда ДМХ
(спектр флуоресценции)
Изображение культуры
клеток HeLa,
оптический микроскоп.
4-Диметиламинохалкон
(ДМХ)
Распределение интенсивности флуоресценции ДМХ в клетке HeLa на разной высоте.
Z = 0 мкм
Z = 4 мкм
Z = 8 мкм
Сканирование клетки HeLa in situ с
помощью флуоресцентного зонда ДМХ
(время затухания флуоресценции)
Z = 0 мкм
Z = 2 мкм
Распределения времени
затухания флуоресценции
в клетке (от 0,2 до 2,1 нс)
Z = 0 мкм
Z = 2 мкм
Соответствующие
распределения интенсивности
флуоресценции
Изменение параметров флуоресценции
ДМХ в ядерной мембране
4
3
a
2
1
A
A
Клетка на поперечном срезе:
1- плазматическая мембрана, 2 - цитоплазма, 3 - митохондрия, 4 - ядро,
АА – линия, вдоль которой сканируются параметры флуоресценции.
x
F(x)
b → Интенсивность флуоресценции F(x) вдоль линии АА (отн. ед.).
0
max
540
c → Положение центра массы спектра флуоресценции (нм).
500

80
d → Ширина спектра флуоресценции (нм).
40

1.5
e → Время затухания флуоресценции (нс).
1.0
0.5
0
5
10 мкм
Выводы
•В
работе реализована методика двухфотонной
микроскопии.
• Проследили изменение параметров флуоресценции
зонда ДМХ в клетках HeLa.
• Показано, что по изменениям параметров
флуоресценции ДМХ можно различать клеточные
органеллы in situ.
Благодарим С.К. Гуларяна, В.Ю. Светличного,
А.А. Астафьева за сотрудничество и ценные замечания