РОССИЙСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ КАФЕДРА КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Группа гематологии и проточной цитометрии Концепция Hematoflow высокие технологии в рутинную практику!?! Наумова Елена Владимировна к.м.н. , доцент кафедры КЛД РМАПО, Москва Барнаул 2015 Общий анализ крови Гематологический анализатор НОРМА или ПАТОЛОГИЯ? Выдача результата ПАТОЛОГИЯ Общий анализ крови Гематологический анализатор Параметры общеклинического анализа крови – Сell blood count (CBC) • WBC Количество (абсолютная концентрация) лейкоцитов • UWBC Нескорректированное количество лейкоцитов • RBC Абсолютная концентрация эритроцитов • HGB Концентрация гемоглобина • HСT Гематокрит • MCV Средний объем эритроцита • MCH Среднее содержание гемоглобина в эритроците • MCHC Средняя концентрация гемоглобина в эритроците • RDW Ширина распределения эритроцитов по объему • RDW-SD Стандартное отклонение ширины распределения эритроцитов • Plt Абсолютная концентрация тромбоцитов • MPV Средний объем тромбоцитов • @PDW Ширина распределения тромбоцитов по объему • @PCT Тромбокрит Общий анализ крови Гематологический анализатор Параметры общеклинического анализа крови – Сell blood count (CBC) • WBC Количество (абсолютная концентрация) лейкоцитов • UWBC Нескорректированное количество лейкоцитов • RBC Абсолютная концентрация эритроцитов • HGB Концентрация гемоглобина • HСT Гематокрит • MCV Средний объем эритроцита • MCH Среднее содержание гемоглобина в эритроците • MCHC Средняя концентрация гемоглобина в эритроците • RDW Ширина распределения эритроцитов по объему • RDW-SD Стандартное отклонение ширины распределения эритроцитов • Plt Абсолютная концентрация тромбоцитов • MPV Средний объем тромбоцитов • @PDW Ширина распределения тромбоцитов по объему • @PCT Тромбокрит WBC - Количество лейкоцитов Лейкоцитарная гистограмма Лимф Моно оциты циты 50 – 90 90 fL 160 fL R1 R2 R3 Гранулоциты 160 - 450 fL R4 R1 – дальний левый регион: агрегаты тромбоцитов, гигантские тромбоциты, эритробласты R2 – регион лимфо-моно: варианты лимфоцитов, бласты, плазматические клетки, базо-, эозинофилия R3 – регион моно – грануло: незрелые гранулоциты, анормальные клетки R4 – дальний правый регион: высокое абсолютное количество гранулоцитов Технология VCS V - Volume C - Conductivity S - Scatter Метод многопараметрической проточной цитометрии – оценка объема, электропроводимости, светорассеивания. Многопараметрическая проточная цитометрия – технология VCSn Лазерная и оптическая система • диодный лазер • новая лазерная оптика • новая (запатентованная) конструкция проточной ячейки, обеспечивающая высокое разрешение • 7 различных сигналов, 5 из которых – параметры светорассеяния. 1. Верхний и нижний электрод для определения объема (DC) 2. Верхний и нижний электрод для определения проводимости (RF) 3. Ослабление светового потока в прямом направлении (ALL) 0˚ 4. Светорассеяние под малыми углами (LALS) 5.1˚ 5. Светорассеяние под углами меньше среднего (LMALS) 10˚ – 20˚ 6. Светорассеяние под углами больше среднего (UMALS) 20˚ - 42˚ 7. Пятый канал светорассеяния представляет собой сумму LMALS и UMALS. Точное измерение размера Технология VCS - Volume Объем (размер) клетки измеряется с использованием принципа Культера на основе измерения сопротивления при постоянном токе. Информация о размере клетки используется для уточнения данных, получаемых при анализе проводимости и рассеяния. Анализ внутреннего состава клеток Технология VCS - Сonductivity Измерение проводимости в переменном токе высокой частоты характеризует непрозрачность (структурную электропроводимость) клетки. Позволяет оценить объем, плотность клеточного ядра и внутренний состав клетки. Анализ гранулярности Технология VCS – Rotated Light Scatter Рассеяние лазерного света под разными углами позволяет получить информацию о структуре клеточной поверхности, гранулярности цитоплазмы и лобулярности ядра. Cell Population Data (CPD) Семь позиционных параметров для каждого типа лейкоцитов – Дополнительная информация для характеристики клеточной популяции – CPD могут быть использованы в правилах принятия решений – Дополняют данные флагов, дают предварительную морфологическую информацию и облегчают идентификацию патологических популяций 56 дополнительных исследовательских параметров Параметры лейкоцитов. Новые параметры лейкоцитов актуальные для диагностики мегалобластных анемий (В12- и фолиеводефицитной): - средний объем нейтрофила MVNe (РЗ: 132-144 ед.) - средний объем моноцита MVMo (РЗ: 157-167 ед.) (Simon-Lopez R., Sukhacheva E., Tsvetaeva N., Egorova M. et al., 2008.) Параметры лейкоцитов Параметры лейкоцитов Параметры лейкоцитов LS Параметры лейкоцитов Параметры лейкоцитов. @EGC# - early granulocyte count – незрелые формы гранулоцитов – абсолютное количество незрелых гранулоцитов, @EGC # = (@ EGC х WBC)/100, N x 103 кл/мл @EGC% выражается в процентах от общего числа WBC, показатель из DIFF канала VCSn. Зачем нужно микроскопическое исследование? Достоинства и недостатки «традиционного» подхода + Дешевый метод, оценка - морфологической структуры клетки (особенности ядра, включения, зернистость), морфология эритроцитов, тромбоцитов Высокая занятость специалистов, выполняющих морфологические исследования - Сложность подсчета при лейкопении – подсчет 50 клеток - Неравномерное распределение лейкоцитов в мазке крови -В сложных случаях требуется опытный морфолог - По морфологии невозможно выделение субпопуляций лимфоцитов и моноцитов • HematoFlow™ : комплексное решение Beckman Coulter объединяющее возможности гематологических анализаторов и проточной цитофлуориметрии. Цитофлуориметр FC500 микроскопия DxH800 Beckman Coulter • CytoDiff™ : реагент проточной цитометрии, используемый для контроля флагов гематологического анализатора (IVD) CytoDiff Autogating Algorithm Overview B CD19+ Baso & Xt FS High Leucocytes CD45+ EO & IG CD2/CRTH2+ 3 septembre 2013 Neutrophil CD16+ Mono CD36+ LyB & Xb CD45+ Mono & Xm CD 45+ EO + IG CD 16-/SS High Mono & ProI CD 16+/- 4 новых определяемых популяций клеток T + NK CD45+ Baso + Xt CD2/CRTH2 - LyTC+NK & LyTnC CD16+Tc+NK/-TNc 14 CytoDiff™ : набор меченных моноклональных антител для проточной цитометрии, используемый для контроля флагов гематологического анализатора (IVD) CytoDiff Панель 5 –цветный коктейль из 6 антител, который позволяет идентифицировать 16 клеточных популяций Маркер Экспрессия клетками CD36-FITC Моноциты, Эритроциты, Тромбоциты CD2-PE T-Лимфоциты, NK клетки, T-бласты CD294-PE Эозинофилы, Базофилы, Активированные T клетки CD19-ECD B лимфоциты, B-бласты CD16-PC5 Нейтрофилы, провоспалительные моноциты, цитотоксическиеT/NK клетки Незрелые гранулоциты CD45-PC7 Все лейкоциты + Бласты Продукт, одобренный в настоящее время Советом Европы (CE) Донор 44 г WBC 8,56х109/л Neu%-37,8 Lym%-56,3 Mon%-4,5 Eos%-1,2 Bas%-0,2 Navios - Beckman Coulter CD5/CD19 CD20/CD23 CD19λ Сравнение гистограмм пациента с В-клеточным хроническим лимфолейкозом и Донора. донор В-ХЛЛ В-ХЛЛ (n=51) Субпопу ляции клеток B лифоциты Доно ры (n=331) % Больны е ВХЛЛ(n=51) % 1.61-8.53 12.1-94.6 T- лимфоциты 12.64-45.06 0.96-28.98 T+ лимфоциты 1.71-17.34 0.13-8.41 T&NK 17.70-57.16 1.81-36.47 Все лимфоциты 21.73-61.34 48.64-98.69 M- 4.52-10.81 0.02-5.43 M+ 0.18-1.54 0.01-1.65 Все моноциты 4.73-11.58 0.02-6.69 Незрелые 0.01-0.53 0.01-0.45 0.77-8.32 0.04-2.82 29.04-67.52 0.66-45.2 29.34-67.64 1.51-6.03 лимфоциты Гранулоциты Эозинофилы Зрелые Нейтрофилы Все Нейтрофилы В-ХЛЛ (n=51) Субпопуля Доноры ции клеток (n=331) *109/l Больные ВХЛЛ(n=51) *109/l B лифоциты 0.09-0.70 T- лимфоциты 0.84-3.2 2.34-8.47 T+ лимфоциты 0.11-1.25 0.39-1.58 T&NK лимфоциты 1.13-3.69 2.73-9.05 Все лимфоциты 1.35-4.31 3.65-183.36 M- 0.27-0.9 0.04-1.23 M+ 0.01-0.10 0.01-0.38 Все моноциты 0.29-0.97 Незрелые 0.00-0.05 0.00-0.38 Эозинофилы 0.04-0.70 0.05-0.54 Зрелые Нейтрофилы 1.49-6.02 1.07-6.76 Все Нейтрофилы 1.51-6.03 1.09-6.77 0.92-169.72 0.04-1.46 Гранулоциты Сравнение гистограмм пациента с диагнозом волосатоклеточный лейкоз и Донора. ВКЛ донор Преимущества и недостатки метода CytoDiff • Анализ большого массива клеток (не менее 20000 клеток до 0.5%) • Объективная иммунологическая классификация различных типов лейкоцитов с использованием МКА • Возможность оценить субпопуляции лимфоцитов и моноцитов • Снижение числа микроскопических исследований мазков крови • Снижение трудоемкости и ошибок, связанных с человеческим фактором • Недостаток – высокая стоимость оборудования Сравнение гистограмм пациента с пароксизмальной ночной гемоглобинурией и донора донор ПНГ Проточная цитометрия дело творческое! :) e_naum@mail.ru