Методические рекомендации об определении свободного формальдегида в биосредах методом тонкослойной хроматографии МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ГЛАВНОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ УТВЕРЖДАЮ Заместитель Главного санитарного врача МЗ СССР В.Е.Ковшило 20.10.1976 № 1514-76 http://mozdocs.kiev.ua/view.php?id=4718 ВВЕДЕНИЕ Формальдегид H*COH, молекулярный вес 30,03. Бесцветный газ с резким запахом. Порог восприятия запаха 0,2 мг/куб.м. Температура плавления 92 град.С, температура кипения - 21 град.С. Хорошо растворим в воде; 35-40% водный раствор формальдегида называется формалином. Он легко полимеризуется с образованием параформальдегида, легко конденсируется с аммиаком, аминами и фенолами. Формальдегид находит большое применение при производстве полимерных материалов на основе мочевино-формальдегидной, феноло-формальдегидной и др. смол. Для определения формальдегида в биосредах в литературе описан метод, основанный на способности формальдегида восстанавливать окраску бесцветного раствора фуксинсернистой чувствительным при кислоты определении [1]. H*COH Однако в он органах оказался недостаточно подопытных животных, подвергавшихся длительной затравке формальдегидом на уровнях, соответствующих его выделению из полимерных материалов. По этой же причине оказался неудовлетворительным метод, описанный в работе [2]. Настоящий метод предназначен для определения формальдегида в печени, почках, легких, мозге подопытных животных. Извлечение формальдегида из органов животных делалось так, как описано в работе [1], синтез формдимедона по прописи, представленной в руководстве [3], условия хроматографирования и количественного определения формдимедона разработаны авторами. Принцип метода 1. Метод взаимодействии основан с на димедоном извлечении формальдегида из (5,5-диметилдигидрорезорцином) органов, с его последующим выделением продукта взаимодействия (формдимедона) в тонком слое сорбента. В качестве алюента применяется хлороформ. Проявление пластины осуществляется хлороформенным раствором йода. 2. Открываемый минимум - 0,2 мкг в пробе. 3. Веществ, мешающих определению, не установлено. Реактивы, растворы 1. Соляная кислота (d=1,19), "хч", ГОСТ 3118-67; Ін; 0,1н р-ры. 2. Димедон, "ч", ГОСТ 6622-53, перекристаллизованный; 5% спиртовый р-р, свежеприготовленный. 3. Гидроокись натрия, "хч", ГОСТ 4328-66; 0,1н; 0,05н и 20% р-ры. 4. Спирт этиловый, ректификат, ГОСТ 5962-67; перегнанный. 5. Вода, бидистиллат. 6. Бромфеноловый синий, "чда", ГОСТ ТУ 6-03-311-70. 7. Ацетат натрия, "ч", ТУ 6-09-246-70. 8. Нитрат серебра, "хч", ГОСТ 1277-63; 0,1н р-р. 9. Хлороформ, "хч", ГОСТ 3160-51. 10. Трихлоруксусная кислота, "ч", МРТУ 6-09-2299-65; 5% р-р. 11. Йод, "чда", ГОСТ 4159-64. 12. Крахмал растворимый, для йодометрии, ГОСТ 10163-62. 13. Формалин медицинский, ГФ-10. 14. Буферный р-р: смешивают 2 объема Iн р-ра ацетата натрия с 1 объемом Iн р-ра HCl, pH=4,0. 15. Бромфеноловый синий: 0,1 г индикатора растворяют в 3 мл 0,05н p-pa NaOH в мерной колбе емкостью 250 мл, добавляют горячей бидистиллированной воды, остывший р-р взбалтывают в мерной колбе, затем доводят до метки водой и хорошо перемешивают. 16. Проявляющий р-р: 0,5% р-р йода в хлороформе и 1% р-р крахмала. 17. Синтез формальдегида, формдимедона: в прибавляют 0,5 мл подкисляют несколькими каплями стакан 5% 0,1н вносят спиртового р-ра HCl 5 мл р-ра в 4% р-ра димедона, присутствии бромфенолового синего. Затем прибавляют несколько капель 0,1н р-ра NaOH до р-ра. изменения окраски в красно-фиолетовую и 5 мл буферного Содержимое стакана оставляют стоять на 12 часов, после чего фильтруют через стеклянный фильтр с пористой пластинкой № 4. Осадок промывают бидистиллированной водой до отрицательной реакции на ион хлора (проба с р-ром AgNO ) и сушат до постоянной массы в 3 течение 4,5 часов при температуре 100 град.С. 18. Стандартный р-р формдимедона концентрацией 50 мкг/мл готовится обычным способом. Приборы и посуда 1. Центрифуга. 2. Форвакуумный или водоструйный насос. 3. Стеклянная ловушка. 4. Стеклянные пластинки размером 9х12 см. 5. Поглотитель Полежаева на шлифе с оттянутым концом. 3. Мерные колбы для приготовления стандартного р-ра, микропипетки. 7. Батарейные стаканы. 8. Пульверизатор. 9. Реактивные склянки. 10. Фарфоровые чашки. Приготовление пластин для хроматографии Тщательно вымытые хромовой смесью пластины промывают водой, затем дистиллированной водой, сушат в сушильном шкафу, а потом на них наносят слой сорбента. Для приготовления сорбционной массы использовался силикагель марки КСК и медицинский отверстиями с гипс, частотой которые ячеек предварительно 100 меш. просеивались Адсорбционная через масса сито с готовилась следующим образом: 14 г силикагеля + 1 г гипса + 50 мл дистиллированной воды смешивают и интенсивно встряхивают в плоскодонной колбе в течение 20 минут. Однородную массу наносят на 10 пластинок и встряхиванием добиваются равномерного распределения слоя на поверхности каждой пластины. Стеклянные пластинки после нанесения слоя сорбента сушат на воздухе в течение суток. В дальнейшем пластинки хранят в эксикаторе. Описание определения 0,5 г органа подопытного животного (печени, почек, легких, мозга) тщательно растирают в ступке, желательно с кварцевым песком. Затем прибавляют 3 мл 5% трихлоруксусной кислоты, перемешивают и переносят в пробирку. Чашку дважды ополаскивают 2 мл бидистиллированной воды и смывы также переносят в пробирку. Содержимое пробирки центрифугируют, жидкость над осадком осторожно сливают в пробирку с притертой пробкой и к фильтрату по каплям прибавляют 20% раствор NaOH до нейтральной реакции (проба с лакмусовой бумажкой). Далее прибавляют 0,2 мл раствора димедона и проводят синтез формдимедона так, как описано выше. После того как проба была выдержана 12 часов при комнатной температуре, ее переносят в испаритель и упаривают под вакуумом досуха. В качестве испарителя можно использовать поглотитель Полежаева. Чтобы ускорить процесс упаривания, целесообразно между насосом и испарителем поместить ловушку со льдом. Остаток растворяют в 0,1 мл этилового спирта. В период обработки органа, проведения синтеза формдимедона, упаривания растворов возможно попадание формальдегида в воздуха. Поэтому расчете. Результаты анализа Проба и контроль расстоянии 1 см от учитываются наносятся нижнего которое не подвергалось края. на при окончательном середину Во пластинки избежание точки, куда были на потерь стенки испарителей аккуратно споласкивают спиртом и смывы переносят в же из для контроля в той же постановке опыта проводят анализ соответствующего органа животного, затравке. пробу нанесены проба и контроль. те Слева и справа наносят пятна стандартного раствора формдимедона в количестве 0,2; 0,4; 0,6 мкг, что соответствует стандартного раствора. пластине ее камере с насыщением, притертой 0,012 мл Для ускорения процесса высыхания пятен на подогревают крышкой, ацетоном (ацетон хлороформа). феном. 0,004; Разделение вещества производят в представляющей собой на дно 0,008; сосуд любой формы с которого наливают смесь хлороформа с добавляется в количестве 1/10 от объема После подъема растворителя на высоту 10 см пластинку вынимают, сушат на воздухе и опрыскивают хлороформенным раствором йода. пластинке На пластинки и обработки синий цвет. появляются желтые пятна. ее раствором Непрореагированный формдимедон - с R крахмала После подсушивания пятна приобретают димедон дает пятно около старта; = 0,4-0,5. f Расчеты Количество вещества в пробе определяется путем сравнения площади пятна пробы с площадью пятен стандартных растворов. Количество определяемого формальдегида в пробе (в том или ином органе) рассчитывается в мкг/г по формуле: C1 - C2 g = ------- мкг/г, где 0,5 C1 - количество формальдегида в органе подопытного животного, мкг; C2 - количество формальдегида в органе контрольного животного, мкг; 0,5 - навеска взятого для анализа органа, г. ЛИТЕРАТУРА 1. Перегуд Е.А. Санитарная химия полимеров, Изд-во "Химия", Л., 1967, стр. 60. 2. Розенберг П.Я., Беялко Н.К. Химические методы исследования биологических субстратов в профпатологии. М., Изд-во "Медицина", 1969, стр. 171-173. 3. Nash T., The colorimetric estamation of formaldehyde by means of the Hantrsch Reaction, Biochem. J. 1953.55.3.416.