Оптическая микроскопия - Компьютерные голографические
реклама
Микроскопия Создание новой техники, наукоемких технологий и новых материалов, сдерживается недостаточным уровнем измерительной техники. Микроскопия (лат. μΙκροσ — мелкий, маленький и др.-греч. μΙκροσ σκοποσ — вижу) — способ изучения малых объектов с помощью микроскопа. Большинство средств измерений длины в нанометровом диапазоне, обеспечивающих достижение предельных возможностей измерений, основано на следующих физических принципах: Оптические: • оптическая микроскопия, • низкокогерентные системы измерения, • сканирующая микроскопия ближнего поля, • лазерная интерферометрия. Измерения на других физических принципах: • растровая электронная микроскопия, • сканирующая зондовая микроскопия. • Основным инструментом для наблюдения и измерений (качественной и количественной оценки) сверхмалых объектов являются микроскопы, использующие различные физические принципы и средства воздействия на объект: световые потоки, электронные и ионные пучки, акустоэлектронные взаимодействия, рентгеновские лучи, туннельные потоки носителей заряда, силовые поля на сверхмалых расстояниях и т.п. Микроскопия прошла сложный путь развития, и каждое ее достижение сопровождалось прежде всего увеличением разрешающей способности, а также существенным ослаблением воздействия на объект в процессе измерений • Оптическая микроскопия. Человеческий глаз представляет собой оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, т.е. наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они ещё могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т.н. расстояние наилучшего видения (D = 250мм), среднестатистическое нормальное разрешения составляет 0,076 мм. • Размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т.п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены микроскопы различных типов. С помощью микроскопов определяют форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов. • Оптический, или световой микроскоп использует видимый свет, проходящий через прозрачные объекты, или отражённый от непрозрачных. Оптическая система из нескольких линз позволяет получить увеличенное изображение образца. Полученное изображение можно наблюдать глазом (или обеими глазами, в бинокуляре), либо фотографировать или передавать на видеокамеру для оцифровки. В состав современного микроскопа обычно входит система подсветки, столик для перемещения объекта (препарата), наборы специальных объективов и окуляров. • До 1950-х годов работали преимущественно в диапазоне видимого спектра света. Глаз работает в оптическом диапазоне длин волн. Оптические микроскопы не могли давать разрешающей способности менее полупериода волны опорного излучения (для видимого диапазона длина волн 0,2—0,7 мкм, или 200—700 нм). Предельное увеличение оптического микроскопа — до 1000 раз. • Если мы захотим увидеть более тонкие детали, необходимо уменьшить длину волны, которая освещает объект исследования. Для этого можно использовать не видимый свет, а, например, электроны, длина волны которых намного меньше. • Электронные и ренгеновские микроскопы — результат воплощения этой идеи. • Электронная микроскопия - совокупность электронно-зондовых методов исследования микроструктуры твердых тел, их локального состава и микрополей (электрических, магнитных и др.) с помощью электронных микроскопов - приборов, в которых для получения увеличения изображений используют электронный пучок. Электронная микроскопия включает также методики подготовки изучаемых объектов, обработки и анализа результирующей информации. Различают два главных направления электронной микроскопии: просвечивающую и растровую (сканирующую), основанных на использовании соответствующих типов. • Рентгеновская микроскопия — совокупность методов исследования микроскопического строения вещества с помощью рентгеновского излучения. • Разрешающая способность достигает 100 нм, что в 2 раза выше, чем у оптических микроскопов (200 нм). Теоретически рентгеновская микроскопия позволяет достичь на 2 порядка лучшего разрешения, чем оптическая (поскольку длина волны рентгеновского излучения меньше на 2 порядка). • Таким образом, существуют различные виды микроскопии с разной разрешающей способностью. Вид Пространственное разрешение (x,y) Разрешение по zкоординате Размер поля Увеличение Оптическая микроскопия 200 нм - 0,4 -0,2 мм 1.5-1000х Конфокальный микроскоп 200 нм 1 нм Интерферометрия в белом свете 200 нм 0,1 нм 0.05 до 8.24 1.5-100x Голографическая микроскопия 200 нм 0,1 нм 0.05 до 8.24 1.5-100x Просвечивающий электронный микроскоп 0,2 нм - Растровый электронный микроскоп (РЭМ) 0,4 нм 0,1 нм 0,1-500 мкм по z - ~1-10 мм Сканирующие зондовые микроскопы 0,1 нм 0,05 нм ~150 х 150 мкм по z - < 25 мкм до 1 000 000 до 10 000 000х Оптическая микроскопия Основным инструментом для наблюдения и измерений (качественной и количественной оценки) сверхмалых объектов являются оптические микроскопы. История создания оптических микроскопов • Невозможно точно определить, кто изобрёл микроскоп. Простые увеличительные линзы уже производились с 1500-х годов, а увеличительные свойства наполненных водой стеклянных сосудов упоминались ещё древними римлянами (Сенека) • Самые ранние сведения о микроскопе относят к 1590 году и городу Мидделбург (Голландия), и связывают с именами Иоанна Липперсгея (который также разработал первый простой телескоп) и Ганса Янсена, которые занимались изготовлением очков • Другим претендентом на звание изобретателя микроскопа был Галилео Галилей. Он разработал «occhiolino» («оккиолино» - маленький глаз, итал.), или составной микроскоп с выпуклой и вогнутой линзами в 1624 г. Годом спустя его друг по Академии Джованни Фабер предложил для нового изобретения термин "микроскоп". Изображение трёх пчел Франческо Стеллути было частью печати Папы Урбана VIII и считается первым опубликованным микроскопическим символом. • Десятью годами позже Галилея Корнелиус Дреббель изобретает новый тип микроскопа, с двумя выпуклыми линзами. Кристиан Гюйгенс, другой голландец, изобрел простую двулинзовую систему окуляров в конце 1600-х, которая ахроматически регулировалась и, следовательно, стала огромным шагом вперед в истории развития микроскопов. Окуляры Гюйгенса производятся и по сей день, но им не хватает широты поля обзора, а расположение окуляров неудобно для глаз по сравнению с современными широкообзорными окулярами. • В 1665 году англичанин Роберт Гук сконструировал собственный микроскоп. В результате его исследований появилось название «клетки». • • • • Антон Ван Левенгук (1632—1723) считается первым, кто сумел привлечь к микроскопу внимание биологов. Изготовленные вручную, микроскопы Ван Левенгука представляли собой очень небольшие изделия с одной очень сильной линзой. Они были неудобны в использовании, однако позволяли очень детально рассматривать изображения лишь из-за того, что не перенимали недостатков составного микроскопа (несколько линз такого микроскопа удваивали дефекты изображения). Понадобилось около 150 лет развития оптики, чтобы составной микроскоп смог давать такое же качество изображения, как простые микроскопы Левенгука. Так что, хотя Антон Ван Левенгук был великим мастером микроскопа, он не был его изобретателем вопреки широко распространённому мнению. • Оптическая система микроскопа состоит из двух основных элементов — объектива и окуляра. Они закреплены в подвижном тубусе, расположенном на металлическом основании, на котором имеется предметный столик. • В современном микроскопе практически всегда есть осветительная система (в частности, конденсор), макро- и микро- винты для настройки резкости, система управления положением конденсора. Устройство микроскопа: оптического A — окуляр; B — объектив; C — объект; D — конденсор; E — предметный столик; F — зеркало. Оптические микроскопы. Слева — микроскоп фирмы Carl Zeiss 1906 года, справа — современный исследовательский микроскоп той же фирмы с двумя видеокамерами на основе ПЗС-матриц сверху. • Когда говорят о разрешающей способности того или иного оптического прибора, оперируют двумя понятиями. Одно из них — угловое разрешение, а второе — линейное разрешение. Эти понятия взаимосвязаны. К примеру, для человеческого глаза угловое разрешение составляет приблизительно 1 угловую минуту. При этом глаз может различить два точечных объекта, удаленных от него на 25–30 см, только тогда, когда расстояние между этими объектами больше чем 0,075 мм. Это вполне сравнимо с разрешением обычного компьютерного сканера. В самом деле, разрешение 600 точек на дюйм означает, что сканер может различить точки, расположенные на расстоянии 0,042 мм друг от друга. • Для того чтобы можно было различать объекты, расположенные на еще меньших расстояниях друг от друга, используется оптический микроскоп. Оптический микроскоп позволил отодвинуть предел разрешения до долей микрона. Уже 100 лет назад оптическая микроскопия сделала возможным изучать объекты микронных размеров. Однако тогда же стало ясно, что простым увеличением количества линз и улучшением их качества добиться дальнейшего увеличения разрешающей способности невозможно. Разрешение оптического микроскопа оказалось ограничено свойствами самого света, а именно его волновой природой. • Разрешение микроскопа определяется минимальным расстоянием между двумя точками, которые могут быть наблюдаться отдельно. • Разрешающая способность оптического микроскопа определяется оптическими свойствами объектива, однако Э. Аббе показал, что благодаря дифракции существует теоретический предел разрешающей способности (дифракционный предел), определяющийся длиной волны используемого света и составляющий /2 • В оптическом микроскопе пространственное разрешение R по осям x,y определяется тремя параметрами: λ - длиной волны освещающего света, числовой апертурой (NA) объектива (NAobj) а также конденсора (NAcond): R=1.22 λ / (NAobj+NAcond). • Когда апертура упрощается конденсора скорректирована с апертурой объектива выражение R=0.61 λ / NAobj. Числовая апертура для микрообъективов вычисляется по следующей формуле: NA = n * (sin μ ) , n - индекс преломления среды между передней линзой объектива и стекла покрывающего образец. (n = 1 для воздуха и 1.51 для масла). μ - половина угловой апертуры • • Для линзы этот угол определяется диаметром D и фокальным расстоянием F: sin μ = D/2F Чем больше μ тем больше числовая апертура. • В выражение для числовой апертуры NA = n * (sin μ ) , входит показатель преломления n среды, находящейся между объектом и объективом. Показатель преломления вакуума равен единице. У воздуха этот показатель очень близок к единице, у воды он составляет 1,33303, а у специальных жидкостей, используемых в микроскопии для получения максимального разрешения, n доходит до 1,78. • Каким бы ни был угол μ, величина sin μ не может быть больше единицы. Поэтому при работе в воздухе теоретически максимальное значение числовой апертуры NA = 1 ( μ = 90o). На практике NA не превышает 0.95. • Для достижения более высоких значений NA должна использоваться иммерсионная среда между передней линзой и образцом. Для этой цели используется масло или вода. Объектив должен быть специально разработан для этой цели и это упоминается при маркировке (например, UPlanFLN 60x/1.25 Oil Iris). Применяются следующие иммерсионные жидкости: • Кедровое или минеральное масло (показатель преломления 1,515) • Водный раствор глицерина (1,434) • Физиологический раствор (1,3346) • Вода (1,3329) • Монобромнафталин (1,656) • Вазелиновое масло (1,503) • Йодистый метилен (1,741) • 60x - увеличение • 1.42 числовая апертура • oil - необходима иммерсионная жидкость • ∞ - оптика скорректирована на бесконечность • 0.17 - коррекция поверхностного скольжения (необходимая толщина слоя 0.17мм) • FN 26.5 - коэффициент, определяющий размер поля (26.5/60 = 0.44 мм - диаметр поля зрения в мм) • На практике при длине волны порядка 400 нм и числовой апертуре 1.4 разрешение по x, y координате 200 нм по z-координате 500 нм. • Размер поля зрения определяется числом (field number - FM), которое определяет размер диагонали поля зрения (через окуляр и трубу). Например, FN=22, увеличение 10x, тогда размер диагонали поля зрения 22/10 = 2.2 mm. Чем меньше увеличение, тем больше поле зрения, но при это разрешение падает. • Для достижения хорошего разрешения иногда используют компьютерные системы для сшивки изображений. Изображения с большим увеличением снимают по частям с хорошим разрешением, а затем программа распознает края изображений и пытается скомпоновать одно целое изображение. Пространственное разрешение (по x, y – координате) оптического микроскопа не превышает долей длины волны света. Разрешение составляет половину длины волны (для видимого диапазона длина волн 0,2—0,7 мкм, или 200—700 нм). Предельное увеличение оптического микроскопа — до 1000 раз. • Для достижения высокого разрешения объекта контроля в оптических микроскопах используются объективы с высокой числовой апертурой. • Однако при этом глубина резкости уменьшается обратно пропорционально квадрату значения апертуры, что формально приводит к “планаризации” контролируемого объекта с малыми размерами, ширина которого реально сравнима с его толщиной. • Чем лучше пространственное разрешение, тем меньше глубина резкости. • Сегодня стандартные световые микроскопы позволяют рассматривать объекты с увеличением 1000х. Глубина резкости при этом составляет 1 мкм. Небольшая глубина резкости приводит к необходимости автоматизированного перемещения объектива или объекта для наблюдения серии изображений. Полное четкое изображение собирается из 25 кадров, в которых резкость имеется только в небольших слоях. Флуоресцентная микроскопия • Флуоресцентная (люминесцентная) микроскопия основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т. е. светиться при освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом. Цвет люминесценции смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом (правило Стокса) При возбуждении люминесценции синим светом цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается ультрафиолетовым излучением, то свечение может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение. Устройство флуоресцентного микроскопа и правила работы с ним отличаются от обычного светового микроскопа в основном следующим: 1. 2. Наличие мощного источника света в осветителе, излучающего преимущественно в коротковолновой (ультрафиолетовой, синей) части спектра (ртутнокварцевая лампа или галогенная кварцевая лампа). Наличие системы светофильтров: возбуждающие светофильтры пропускают только ту часть спектра, которая возбуждает люминесценцию; теплозащитный светофильтр защищает от перегрева другие светофильтры, препарат и оптику флуоресцентного микроскопа; "запирающие" светофильтры расположены между окуляром. Эти светофильтры поглощают возбуждающее излучение и пропускают свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя. Оптика объективов флуоресцентного микроскопа изготавливается из нелюминесцирующих сортов оптического стекла и склеивается специальным нелюминесцирующим клеем. При работе с объективами масляной иммерсии используется нелюминесцирующее иммерсионное масло • Поскольку большинство микроорганизмов не обладают собственной люминесценцией существует несколько способов их обработки для наблюдения в флуоресцентном микроскопе. Прежде всего, это флуорохромирование - окрашивание сильно разведенными (до нескольких микрограмм/мл) растворами флуоресцирующих красителей (флуорохромов). • Флуоресцентная микроскопия по сравнению с обычной позволяет: ▫ сочетать цветное изображение и контрастность объектов; ▫ изучать морфологию живых и мертвых клеток микроорганизмов в питательных средах и тканях животных и растений; ▫ исследовать клеточные микроструктуры, избирательно поглощающие различные флуорохромы, являющиеся при этом специфическими цитохимическими индикаторами; ▫ определять функционально-морфологические изменения клеток; ▫ использовать флуорохромы при иммунологических реакциях и подсчете бактерий в образцах с невысоким их содержанием. Конфокальный микроскоп • Впервые концепция построения конфокального микроскопа была разработана в середине 1950-х гг. аспирантом Гарвардского университета Марвином Мински (Marvin Minsky). В 1961 г. Минский получил на эту схему патент. • Широкий интерес к этой области проявился лишь в 1980-х гг., благодаря бурному развитию компьютерной и лазерной технологий. • Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (Confocal Laser Scanning Microscopy CLSM) – разновидность оптической микроскопии, в которой сфокусированный лазерный луч сканирует изучаемую область по осям Х и У, формируя таким образом растр изображения. Отраженный свет улавливается фотоэлектрическим умножителем (ФЭУ) и демонстрируется на экране монитора в виде растра. Свет, излучаемый участками вне фокальной плоскости блокируется апертурой микродиафрагмы, расположенной конфокально с образцом. Эта методика позволяет выполнять тонкие оптические сечения образца вдоль оси Z Конфокальная микроскопия отличается от обычной микроскопии, в первую очередь, улучшенным разрешением вдоль оптической оси объектива (ось Z), которое достигается за счет использования принципа конфокальной фильтрации отраженных от образца лучей Функция рассеяния точки • Термин “конфокальный” означает “софокусный” – в плоскости, оптически сопряженной с фокальной плоскостью объектива, находится конфокальная диафрагма. • В отличие от классического оптического микроскопа, создающего плоское изображение чаще всего трехмерного образца, конфокальный микроскоп в каждый определенный момент времени регистрирует изображение только одного горизонтального сечения объекта. Выстраивание полноценного изображения достигается путем последовательного сканирования (движения образца или оптической системы) по всему объему образца. • Возможность регистрирования света только из одной плоскости получена с помощью диафрагмы с малым отверстием, расположенным в плоскости, сопряженной фокальной плоскости объектива. Таким образом, свет, исходящий из регистрируемого сечения, проходит через диафрагму, а свет от остальных точек образца будет отсечен диафрагмой. • В конфокальных микроскопах объект также сканируется в плоскости XY освещающим лучом. При этом в каждый момент времени освещена будет либо конкретная исследуемая точка, либо линия, но не все поле зрения целиком. • Только свет, отраженный от образца в фокусной плоскости линзы объектива может пройти обратно сквозь линзу и отверстие, и влиять на построение изображения поверхности Ход лучей в обычном оптическом микроскопе, когда в фотоприемное устройство попадает свет из различных точек образца. Применение диафрагмы позволяет существенно снизить фоновую подсветку от точек образца вне анализируемой области. Дополнительное повышение контраста достигается применением подсветки, фокусирующей свет в анализируемую точку. Схема со светоделительной пластинкой упрощает конструкцию микроскопа и процесс юстировки за счет двойного использования объектива (для подсветки и сбора отраженного сигнала). В качестве специального фильтра в конфокальных микроскопах фирмы Nanafocus AG используется вращающийся диск с тысячами отверстий. Его прототипом стало датируемое ещё 1884 годом изобретение германского учёного Paul Nipkow, обеспечивающее передачу изображений на расстояние. Диск Нипкова имеет множество отверстий, которые формируют множество точек света для создания конфокального изображения. Диск вращается и получается конфокальное изображение поверхности над полем зрения. • Конфокальный микроскоп имеет разрешение такое же как и обычный микроскоп и ограничено оно дифракционным пределом. • В видимом диапазоне разрешение по x, y составляет ~ 250 нм (NA=1,45, n=1,51). Однако в последние годы успешно развиваются схемы микроскопов, которые используют нелинейные свойства флуоресценции образцов. В этом случае достигается разрешение значительно меньшее дифракционного предела и составляет ~ 3—10 нм. • Конфокальный микроскоп создаёт чёткое изображение образца, которое при использовании обычного микроскопа представляется размытым. Это достигается путем отрезания апертурой фонового света идущего из глубины образца, то есть того света, который не попадает на фокальную плоскость объектива микроскопа. В результате изображение получается с контрастом лучшим, чем в обычном оптическом микроскопе. Конфокальные системы чувствительны к NA (numerical aperture - цифровая апертура), но имеют то преимущество, что могут использовать высокочисловые апертуры и таким образом способны профилировать резкие изменения наклона. Для NA больше чем 0.8, разрешающая способность по Z лучше чем 2 нм, сопоставима с низкокогерентной интерферометрией (white light Interferometry). Показатель преломления биологических объектов почти такой же как у стекла, поэтому наблюдение этих объектов, находящийся на поверхности предметного стекла, в обычном микроскопе весьма затруднено. Конфокальный микроскоп, имеющий высокий контраст, даёт две неоценимые возможности: он позволяет исследовать ткани на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности, а также оценивать результаты исследования (то есть клеточной активности) в четырёх измерениях — высота, ширина, глубина и время Конфокальная микроскопия позволяет увеличивать оптическое разрешение как в аксиальном (z; вдоль оптической оси) так и в латеральном (x и y; в плоскости препарата) направлении и исключать "внефокусный" свет из результирующего изображения. Даже несмотря на то, что разрешение в конфокальном микроскопе больше, чем в обычном широкопольном, оно все еще несравнимо меньше электронного микроскопа. Именно поэтому конфокальная микроскопия может считаться промежуточным звеном между этими двумя методами в микроскопии. Сканирующий ближнепольный оптический микроскоп (NSOM - Near-Field Scanning Optical Microscopy) • Микроскопия ближнего поля – ближнепольное изображение получается при размещении оптического зонда (световода) субмикронного размера на чрезвычайно близком расстоянии от изучаемого объекта, а свет пропускается через небольшую диафрагму на конце зонда. • Обеспечивает разрешение лучше, чем у обычного оптического микроскопа. В случае, если зонд (детектор) микроскопа ближнего поля снабжен устройством пространственного сканирования, то такой прибор называют сканирующим оптическим микроскопом ближнего поля. Такой микроскоп позволяет получать растровые изображения поверхностей и объектов с разрешением ниже дифракционного предела • Под ближним полем понимается зона над поверхностью изучаемого объекта размером меньше длины волны падающего света. • Основное достоинство сканирующей микроскопии ближнего поля – высокая разрешающая способность. Наименьший размер элемента, полученного с помощью этого метода, составляет 20 нм при длине волны света 0,486 нм. В изображении контролируемого элемента отсутствуют дифракционные или интерференционные эффекты, затрудняющие определение его границ. Отсутствуют затруднения и в контроле относительно толстых элементов – они преодолеваются чисто техническим методом – послойным сканированием образца. • Как видно, по принципу действия сканирующий микроскоп ближнего поля подобен туннельному или атомно-силовому микроскопу. • Сканирование объекта оптическим зондом осуществляется на расстоянии меньше длины волны от объекта (в ближнем поле). • Роль светового зонда выполняют светоизлучающие острия с выходными отверстиями, радиус которых в 1020 раз меньше длины волны света Подобная идея была предложена еще в 1928 году Сингхом (Ирландия) (E.H. Syngh), она намного опередила технические возможности своего времени и осталась практически не замеченной. Ее первое подтверждение было получено Эшем (E.A. Ash) в опытах с микроволнами в 1972 году. В начале 80-х годов группа исследователей из Цюрихской лаборатории фирмы IBM во главе с Дитером Полем (сотрудник лаборатории IBM в Цюрихе) (D.W.Pohl) продемонстрировала разрешение λ/20 на приборе, работающем в видимом оптическом диапазоне и получившем название ближнепольного сканирующего оптического микроскопа (NSOM). • При прохождении света через субволновое отверстие наблюдается ряд особенностей. Непосредственно за отверстием на расстояниях Z < 100 ангстрем располагается так называемая ближняя зона, в которой электромагнитное поле существует, в основном, в виде эванесцентных (не распространяющихся) мод, локализованных вблизи поверхности диафрагмы. В области расстояний Z > 100 a располагается дальняя зона, в которой наблюдаются лишь излучательные моды. • Оценки показывают, что для излучения с длиной волны порядка λ = 500 нм и диафрагмы с отверстием ~ 5 нм мощность излучения в дальней зоне составляет по порядку величин 10-10 от мощности падающего излучения • Однако, если поместить исследуемый объект непосредственно за отверстием в ближней зоне, то вследствие взаимодействия эванесцентных мод с образцом часть энергии электромагнитного поля переходит в излучательные моды, интенсивность которых может быть зарегистрирована оптическим фотоприемником Для работы необходимо удерживать зонд над поверхностью на расстояниях порядка 10 нм и менее. Существуют различные решения данной проблемы, однако наиболее широкое распространение получили БОМ с методом контроля расстояния между зондом и образцом. Чаще всего применяются схемы контроля с использованием пьезодатчика на основе кварцевого резонатора камертонного типа. Измерение силы взаимодействия зонда с поверхностью производится посредством регистрации изменения амплитуды и фазы изгибных колебаний кварцевого резонатора на частоте возбуждения • Оценки показывают, что для излучения с длиной волны порядка λ = 500 нм и диафрагмы с отверстием ~ 5 нм мощность излучения в дальней зоне составляет по порядку величин 10-10 от мощности падающего излучения • Однако, если поместить исследуемый объект непосредственно за отверстием в ближней зоне, то вследствие взаимодействия эванесцентных мод с образцом часть энергии электромагнитного поля переходит в излучательные моды, интенсивность которых может быть зарегистрирована оптическим фотоприемником Для работы необходимо удерживать зонд над поверхностью на расстояниях порядка 10 нм и менее. Существуют различные решения данной проблемы, однако наиболее широкое распространение получили БОМ с методом контроля расстояния между зондом и образцом. Чаще всего применяются схемы контроля с использованием пьезодатчика на основе кварцевого резонатора камертонного типа. Измерение силы взаимодействия зонда с поверхностью производится посредством регистрации изменения амплитуды и фазы изгибных колебаний кварцевого резонатора на частоте возбуждения Принцип работы NSOM микроскопа • Основной характеристикой NSOM является пространственное разрешение, которое в сильной степени зависит от условий освещения или в более общем случае - от наблюдения образца, структуры его поверхности и микрогеометрии зонда. Ближнепольный оптический микроскоп Уникальность ближнепольной оптической микроскопии по сравнению с другими сканирующими методами состоит в том, что изображение строится непосредственно в оптическом диапазоне, однако разрешение многократно превышает разрешение традиционных оптических систем Отсутствие физических ограничений размера вершины зонда в безапертурных NSOM позволяет реализовать в них разрешение лучше 1 нм. Клетки крови (АСМ, 50х50 мкм) ДНК (АСМ, 310х310 нм) эритроцит и лейкоцит • До 1950-х годов работали преимущественно в диапазоне видимого спектра света. • Если мы захотим увидеть более тонкие детали, необходимо уменьшить длину волны, которая освещает объект исследования. Для этого можно использовать не видимый свет, а, например, электроны, длина волны которых намного меньше. • Электронные и ренгеновские микроскопы — результат воплощения этой идеи. • Электронная микроскопия - совокупность электронно-зондовых методов исследования микроструктуры твердых тел, их локального состава и микрополей (электрических, магнитных и др.) с помощью электронных микроскопов - приборов, в которых для получения увеличения изображений используют электронный пучок. Электронная микроскопия включает также методики подготовки изучаемых объектов, обработки и анализа результирующей информации. Различают два главных направления электронной микроскопии: просвечивающую и растровую (сканирующую), основанных на использовании соответствующих типов.
