Биостатистика Кошмар Бонферрони Лекция 8-ая, и последняя Рубанович А.В. Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Опыты по выявлению людей с паранормальными способностями: Joseph Rhine (1950) 1000 человек угадывали последовательность Вывод Д. Райна: из 10 карт: красная или черная? «нельзя сообщать подопытным людям об их паранормальных способностях» 12 человек угадали 9 из 10 карт, двое все 10 карт Все выявленные «экстрасенсы» в последующих опытах не подтвердили свои способности Что произошло? 1- Р(100 раз не найти) Шансы найти «экстрасенса» среди 100 человек = Шансы найти «экстрасенса» среди 1000 человек = Точный тест Фишера с помощью монеты Контроль: 1 дицентрик на 1000 клеток против Облучение: 9 дицентриков на 1000 клеток Эти различия значимы (в единичном тесте ), Control: 1 мутация на 100 здоровых против Case: 9 мутаций на 100 больных Значимость различий Если объемы выборок равны, значимость различий 9 против 1 зависит равна от числа событий …и не зависиттолько от самих объемов выборок!!! вероятности выпадения (числа мутаций в выборках) 9 или 10 «орлов» в 10 бросаниях монеты но при проведении 100 тестов вероятность появления фальшивых отличий равна Почему в середине 90-ых заговорили о проблеме «multiple comparisons» ? В ассоциативных исследованиях полиморфизма ДНК, как правило, фигурируют 3-5 (или 5-20) полиморфных локусов (это число еще нужно умножить на число заболеваний или сравниваемых признаков) Проведение большого количества тестов Genome-wide association: изучение экспрессии генов (множественных сравнений) при помощи микрочипов – 500 000 SNP. При уровнес значимости 0.01 фальшивых можно ожидать 5000 связано опасностью открытий ложных ассоциаций Мета-исследования (исследования исследований): как объединять и сравнивать данные, полученные разными авторами Как это распределенные бывает? Генерируем две одинаково выборки Odd Ratioгенотипами – отношение шансов, по 100 особей с 20-локусными Наблюдаем появление фальшивых ассоциаций популярная мера сопряженности. При отсутствии связи OR=1 Частоты минорых аллелей (в среднем 0.1) Ген 111 222 333 444 555 666 777 888 999 10 10 10 11 11 11 12 12 12 13 13 13 14 14 14 15 15 15 16 16 16 17 17 17 18 18 18 19 19 19 20 20 20 Больные 1 Выборка gen case case gen gen case 6 14 710 12 12 10 12 8 15 17 12 9 8 13 10 9 5 12 11 9 9 713 10 7 12 10 8 10 12 14 8 12 13 14 7 10 914 12 12 17 13 14 998 15 812 10 10 7 815 7 6 11 14 912 9 17 10 10 11 11 11 8 10 13 10 15 16 7 11 11 12 Должно быть OR=1 Здоровые2 Выборка gen control control gen gen control 7 897 9 5 210 7 14 513 9 12 16 9 8 11 13 11 10 13 6 410 12 12 9811 9 9 812 14 12 11 9 12 910 9 510 14 7 910 13 9 8910 6 96 12 11 10 716 9 14 7 13 9 7 810 10 10 13 10 6 865 23 41 OR OR real real OR OR real 0.85 2.2 0.87 1.1 1.4 2.6 5.4 1.2 1.2 1.1 3.9 0.91 1.0 0.64 1.1 0.58 1.0 0.61 1.1 0.83 0.80 0.89 1.0 0.68 1.0 1.2 3.3 0.81 0.70 0.81 1.6 1.6 0.88 1.4 1.1 1.9 0.46 0.81 1.3 0.73 1.4 1.0 1.8 1.5 0.78 1.6 1.9 0.61 1.2 2.3 0.88 0.74 1.0 0.76 1.8 1.0 1.2 1.0 1.2 1.2 1.1 0.52 0.89 2.7 1.1 0.68 1.6 0.83 1.2 1.1 1.2 1.3 1.3 1.0 1.2 1.7 1.4 1.9 1.9 1.6 p ppp 0.782 0.127 0.796 0.819 0.513 0.0896 0.0209 0.670 0.796 0.853 0.0105 0.841 1.00 0.371 0.841 0.239 1.00 0.405 0.835 0.683 0.655 0.819 1.00 0.467 1.00 0.782 0.0455 0.670 0.491 0.670 0.371 0.297 0.808 0.513 0.841 0.201 0.127 0.670 0.549 0.513 0.513 1.00 0.178 0.394 0.637 0.297 0.285 0.670 0.0881 0.808 0.532 1.00 0.617 0.221 1.00 0.782 1.00 0.655 0.695 0.835 0.162 0.819 0.0412 0.819 0.414 0.346 0.683 0.655 0.827 0.796 0.637 0.532 1.00 0.705 0.239 0.564 0.225 0.225 0.371 Значимо! Сразу 3 локуса «ассоциированы» с заболеваемостью! Как же избежать фальшивых открытий? Чудес не бывает – надо снижать критический уровень «маловероятности» (5%) При проведении m независимых статистических тестов на уровне значимости , вероятность хотя бы одного фальшивого результата должна быть 1-(1-)m < 0.05 Правило Карло Бонферрони (1935): При проведение m независимых статистических тестов значимы только те результаты, для которых Правило Бонферрони ликвидирует значимость вполне определенных результатов: Две мутации, ассоциированные с заболеванием Контроль (100) Больные (100) OR p Мутация 1 1 7 7,45 0,0349 Мутация 2 5 15 3,6 0,0253 Однако правило Бонферрони требует: p < 0,05/2=0,025 1 против 7 при равных по объему выборках: Правило Бонферрони ликвидирует значимость вполне определенных результатов: Одна мутация + любой, не относящийся к делу признак Контроль (100) Больные (100) OR p Мутация 1 1 7 7,45 0,0349 Фамилия начинается с гласной буквы 36 40 1,19 0,646 Правило Бонферрони требует: p < 0,05/2=0,025 Увы, это не шутка!!! Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population F. Marcona, C. Andreoli, et al. Mut. Res., 541 (2003) Незначимо! Поправка Бонферрони требует: Генотипы High-Throughput Detection of GST Polymorphic Alleles in a Pediatric Cancer Population P. Barnette, R. Scholl, et al. Cancer Epidemiology, Biomarkers & PreventionVol. 13, 304–313, 2004 Контроль 13 генотипов OR=6,4 P=0,007 8 видов заболеваний Гомозиготность по делециям GST защищает от рака! OR=2,3 P=0,018 Незначимо! Поправка Бонферрони требует: Implication of Xenobiotic Metabolizing Enzyme gene (CYP2E1, CYP2C19, CYP2D6, mEH and NAT2) Polymorphisms in Breast Carcinoma A. Khedhaier, E. Hassen, et. al. BMC Cancer, 2008 Все стройно, но Бонферрони требует: При этом среднее время выживания microsomal Epoxide Hydrolase: гомозигот СС выше, чем у больных с другими генотипами Минорный аллель (С) обуславливает пониженную(повышенная эффективность химиотерапии?) У больных 12% активность фермента гомозигот СС против 6% в контроле Bonferroni method creates more problems than it solves Аргументы Томаса Пернежера (Thomas Perneger, 1998): Интерпретация данных зависит от числа тестов. Это противно нашей интуиции. Данные не могут терять значимость от того, что их кто-то подтвердил! При большом количестве тестов гипотеза о том, что все наблюдаемые различия неслучайны, никому не нужна При коррекции Бонферрони вероятность упустить существенные различия столь велика, что …лучше просто перечислить какие тесты дали значимые результаты и, главное, почему “Bonferroni adjustments are, at best, unnecessary and, at worst, deleterious to sound statistical inference…” Из разговоров на форуме molbiol.ru: …мы не будем гробить свои результаты из-за какого-то там Бонферрони …спрашивать диссертанта о Бонферрони – это дурной тон …«бонферронофобия» набирает обороты …разработчики программ не желают вводить кнопочку «Bonferroni» …хуже Бонферрони ничего нет, не считая отсутствия всякой коррекции Чуть-чуть об ошибках статистических тестов биологпредположение ориентирован наобконтроль Нулевая Традиционно гипотеза – обычно отсутствии I рода значимости), различий =ошибки 2 выборки из(через однойуровень генеральной совокупности т.е. на гарантии отсутствия ложных открытий, Ошибка I рода () Вероятность отвергнуть правильную нулевую гипотезу = Вероятность обнаружить различия их нет = «Сначала я говорил, о чемтам, будугде говорить, Вероятность совершить затем говорю, фальшивое открытие потом буду говорить, о чем сказал» Ошибка II рода () Правило английского проповедника Вероятность принять неправильную нулевую гипотезу = Вероятность не обнаружить существующие различия = Вероятность упустить открытие Мощность 1- Ошибка II рода о= возможности … теста и при =этом мало заботится Вероятность правильно нулевуюIIгипотезу упустить отвергнуть открытие (ошибка рода) Вероятность не упустить открытие Мощность статистических тестов Мощность 80% считается приемлемой (мощность обычных тестов в реальных ситуациях) Консервативный тест - это тест с низкой мощностью (напр., критерий Колмогорова-Смирнова) Метод Бонферрони – архиконсервативен (особенно при сравнении частот) Во многих случаях коррекция Бонферрони делает выявление значимых результатов попросту невозможным От чего зависят ошибки статистических тестов? От размаха реально существующих отличий и разброса данных От объемов выборок С увеличением объема выборки мощность теста Ошибка I рода (вероятность фальшивого открытия) (вероятность неотупустить открытие) слабо объемов выборок, Ошибки I и IIзависит рода однозначно не связаны. В целом всегда возрастает они сравнимы по величине ошибкаесли II рода растет при уменьшении ошибки I рода (главная причина маломощности метода Бонферрони ) Зависимость ошибки II рода от числа тестов при использовании поправки Бонферрони При 100 сравнениях ради того, чтобы гарантировать Вероятность пропустить с OR=2.7 отсутствие хотя быгенодного на выборках 100 (case) и 100 (control) ложного результата, мы упускаем 88% открытий! Ошибка II рода 0,8 При m=100 ошибка равна 0.88 0,6 При 5тесте сравнениях упускаем 50% В отдельном вероятность упустить открытиеоткрытий равна 0.2 0,4 0,2 0 0 1 5 10 15 Число тестов 20 Новый принцип проверки статистических гипотез: FDR-контроль False Discovery Rate control: Benjamini, Hochberg (1995) Вероятность фальшивого открытия < Уровня значимости Ошибка I рода < 0.05 Традиционный принцип заменяется на 105 статей в базе Средняя доля фальшивых открытий < Выбранный уровень Алгоритм контроля FDR (Benjamini, Hochberg, 1995) Упорядочиваем тесты по уровню p-величин: p1 p2 … pm. Для контроля FDR на уровне α Величина p для j-ого находимтеста (гена) Порядковый номер гена (например 0.05), Желательный уровень значимости j j* max j : p j m Общее число тестов при j =(генов) 1, …, j*. Считаем различия значимыми При j > j* различия считаются незначимыми Пример: множественные сравнения по 10 тестам Располагаем тесты в Коррекция Коррекция по порядке увелечения p Bonferroni FDR Значимые различия после коррекции по 0,005 0,005 FDR 0,005 0,010 Тест pi 1 0,001 2 0,0055 3 0,005 0,01 В первой клетке 0,005 0,015 как у Бонферрони, во второй клетке 0,005 0,02 вдвое втрое больше, больше 0,04и т.д ….0,005 0,005 0,3 4 5 6 7 8 9 10 0,015 Поправка Бонферрони 0,020 оставляет значимым лишь первое сравнение 0,025 0,030 0,035 И это все!!! 0,005 0,040 0,5 Значимые различия без Для 6-ого теста p больше на 0,005 поправок0,045 0,6этого значения множественность 0,005 0,050 0,8 То же самое в общем случае: m – число сравнений, =0.05 (например) Bonferroni (1939) FDR (1995) p1 < /m /m p2 Бонферрони /m 2/m торжествует! Контроль FDR приносит ощутимые p3 /m 3/mрезультаты, если хотя бы … … /mодин тест удовлетворяет правилу p < /m pi /m i/m … … /m pm /m Пример: экспрессия 3051 генов при острой лейкемии Golub T.R. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. // Science. 2001, v.286. Число генов с данным уровнем t-статистики t-статистика при сравнении экспрессии гена у больных и здоровых t-тест: 1045 генов, для которых p<0.05 Коррекция Бонферрони : 98 генов для p’<0.000016 FDR: 681 генов, для которых FDR< 0.05 Что делать, если FDR не помогает? Permutation tests: случайные перестановки пометок «case-control» в компьютерных симуляциях по алгоритму: В исходной базе данных делаем случайную перестановку лейблов case-control Тем самым мыp-уровни отказываемся от попыток Вычисляем заново для каждого гена (pperm) Точный тест Фишера – это тоже permutation test, вычислить значимость различий. только реализованный аналитически (р вычисляется Повторяем N раз (минимум 10000), фиксируя Вместо этогопроцедуру мы ее «измеряем» экспериментально, по случаи, формулам комбинаторной теориизначения вероятностей) когда p меньше исходного разыгрывая perm ситуацию на компьютереp Вычисляем откорректированное p как p' Число случаев p perm p N Permutation test применительно к данным об ассоциации заболеваемости с 10 SNP Переставляем отметки «case-control» 10000 раз. В результате получаем коррекцию p SNP Частота минорного аллеля Case (100) Control (100) 1 62 26 2 19 3 31 4 20 5 OR Но так p бывает неp`всегда Indulgentia 4,6 0,0001 0,000 3,7 0,009 0,010 2,8 0,011 0,007 2,9 0,023 0,025 3,0 0,071 0,109 2,0 0,096 0,098 7 11 Значимо по4без FDR Значимо коррекции 23 множественность 13 на 44 30 1,8 0,103 0,058 8 54 39 1,8 0,120 0,067 9 59 53 1,3 0,571 0,476 10 40 41 1,0 0,911 1,000 6 6 Значимо по Бонферрони 14 8 Почему Permutation test так либерален? Поправки Бонферрони и FDR предполагают, что все тесты независимы Перестановка лейблов «case-control» сохраняет корреляционные связи между данными (в случае полиморфных генов можно сказать: «учитывает неравновесие по сцеплению») Учитывает совместные распределения тестовых статистик В результате Permutation test значительно менее консервативен, чем Bonferroni и FDR Как реализовать permutation tests? Не предусмотрен в стандартных статпакетах. На сегодняшний день доступно: free 30-day demo version https://www.dynacom.co.jp/e/products/package/snpalyze И все же всегда проще simNum sumDif 10000; Table 0, tot genCase1 ; Take l, volSample ; one.ill; genControl1 xiSq ; RandomPermutation 2 volSample ; health Length frCase FREE!!! tot Join ill, health ; http://statgen.ncsu.edu/powermarker/index.html ill tot Take l, volSample Do l самому! one.health; genCase1 genControl1 2 genCase1 genControl1 1 CDF ChiSquareDistribution 1 , xiSq ; Free software environmentp1 for statistical computing: sumDif sumDif UnitStep p p1 , simNum ; встроенные функции +simp HaploStats, SNPassoc и многое др. sumDif simNum N; http://www.r-project.org/index.html N; Борьба с кошмаром Бонферрони продолжается! Нейронные сети, случайные деревья, генетические алгоритмы, гибсовские поля и еще Бог знает что Переход от генотипов к гаплотипам: Типичная ситуация для 3 локусов: реальное уменьшение числа сравнений. 27 возможных генотипов, но лишь Информация о межлокусных сохраняется! 5-7 гаплотипов встречаются корреляциях с частотой >1% Если число локусов ≥3, то обычно число наблюдаемых гаплотипов << числа генотипов Soft для работы с гаплотипами http://www.bios.unc.edu/~lin/hapstat/ X. Sole, E. Guino, J. Valls, R. Iniesta1, V. Moreno (2006) http://bioinfo.iconcologia.net/index.php?module=Snpstats SNPStats Однолокусный анализ Allele and genotype frequencies Test for Hardy-Weinberg equilibrium Analysis of association with a response variable based on linear or logistic regression Multiple inheritance models: co-dominant, dominant, recessive, over-dominant and additive Analysis of interactions (gene-gene or gene-environment) Многолокусный анализ Linkage disequilibrium statistics Haplotype frequency estimation Analysis of association of haplotypes with the response Analysis of interactions (haplotypes-covariate) SNPstats в действии: ассоциации миом с 3 SNP Haplotype association with response (n=164, crude analysis) COMT GSTP1 MTHFR Freq OR (95% CI) P-value 1 L A C 0.2719 1 --- 2 H A C 0.1996 2.69 (1.02 - 7.12) 0.048 3 4 По локусы не обнаруживают H отдельности G C 0.1155 0.10 (0.01 - 1.26) значимых ассоциаций! L G C 0.1059 3.22 (0.95 - 10.93) 0.076 0.062 5 H A T 0.099 2.08 (0.77 - 5.60) 0.15 6 L G T 0.0906 1.50 (0.49 - 4.62) 0.48 7 L A T 0.0773 3.24 (0.67 - 15.68) 0.15 8 H G T 0.0402 13.88 (1.21 - 158.65) 0.036 Global haplotype association p-value: 0.033 И это все, о чем хотел рассказать Напоследок хочу напомнить, почему не следует пренебрегать коррекцией на множественность сравнений? Чтобы не уподобиться старому Джозефу Чтобы преодолеть соблазн раздувать отчет о проделанной работе Чтобы предупредить выпады недоброжелателей Это просто и делается вручную. Если хотя бы одно сравнение проходит через сито Бонферрони, то с Вас хватит FDR. В противном случае Вам не обойтись без перестановочного компьютерного теста. Спасибо Биофаку КазГУ и Всем присутствующим !!! С удовольствием предоставлю копию презентаций курса заинтересованными коллегам. Всегда Ваш rubanovich@vigg.ru