Индуцированный мутагенез - Институт общей генетики

Индуцированный мутагенез
(количественные аспекты)
А.В. Рубанович
Учреждение Российской академии наук
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
rubanovich@vigg.ru
История
XIX век – Август Вейсман:
безуспешные попытки изменить наследственность
используя температуру, влажность и механические
воздействия.
1925 – Г. А. Надсон (и его сотрудник Г. С. Филиппов) Ленинградский Институт рентгенологии и радиологии:
после
воздействия- рентгеновых
лучей вырастали
Расстрелян
1939
колонии дрожжей, отличавшиеся величиной, формой и
окраской.
1927 - Герман Джозеф Меллер - V Международный
генетический конгресс в Берлине: первые удачные
Нобелевская
премия - 1946
опыты по искусственному
вызыванию рецессивных
мутаций с помощью рентгеновых лучей у дрозофилы.
1927 - Л. Стадлер: искусственные мутации у ячменя и
кукурузы после воздействия рентгеновых лучей.
Биологическое действии радиации осознали
значительно раньше!
1901 - Первый описанный случай радиационного
ожога кожи
1906 - Первый летальный исход (США)
1911 - Первый описанный случай радиационноиндуцированной лейкемии
1946 – Первое описание «клинического синдрома
обусловленного атомной бомбардировкой»
1936 - Обелиск в Гамбурге: имена 115 исследователей,
погибших в результате действия радиации
Радиобиологический парадокс:
ничтожная энергия вызывает драматический
биологический эффект!
Полулетальная доза для человека = 4 Гр = 270 Дж = 67 кал
По энергетическим затратам:
1 чайная ложка
горячего кофе
гибель в 50% случаев
=
2 секунды на пляже
=
1920 - Фридрих Дессауер – «теория точечной теплоты»:
радиация отдает энергию порциями, вызывая нагревание отдельных
точек до очень высокой температуры. Далее локальное свертывание
белков, что к ведет биологическому поражению.
Теория мишеней и принцип попадания (1946-1947)
Карл Циммером (Гемания)
Николай Владимирович Тимофеев-Ресовский (Россия)
Дуглас Ли (Великобритания)
Откуда взялись эти положения?
В основном из характера дозовых зависимостей…
 Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде
 Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и
подчиняются пуассоновскому распределению
 Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую
чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз
Зависимость «доза-эффект» в радиобиологии
Токсические воздействия:
Радиация:
Выживаемость, %
Выживаемость, %
100
100
50
50
Экспонента порога нет!
Доза облучения
Время воздействия,
концентрация
Порог
Плотности распределений
Частота, %
100
S(D)=e-D
Частота, %
100 распределения дозы
Кривая выживания – это функция
(времени воздействия), вызывающей гибель
50
50
Среднее
время
гибели
Время
гибели
Средняя
убивающая
доза
Доза,
вызывающая
гибель
Забудем на время о дозах – будем говорить о
распределениях продолжительности жизни
Человек
Некоторые насекомые
Выживаемость, %
Выживаемость, %
100
100
50
50
75
Возраст
4000
Возраст
Вероятность умереть в следующем
Вероятность умереть в следующем
году увеличивается с возрастом
году не зависит от возраста
Распределение продолжительности
жизни
для бессмертных! Единственная
причина смерти – попадание под
колеса автомобиля.
Экспоненциальная продолжительность
жизни Средняя продолжительность
это распределение «без
о прошлом»
жизнипамяти
 4000 лет
Вернемся к зависимостям «доза-эффект»
Не только дозовые зависимости!
Многое проясняет физика
Экспоненциальная зависимость:
взаимодействия
излучений
вероятность наступления
эффекта при
следующей
порции облучения не
с веществом
зависит от предыдущей дозы
Выживаемость, %
100
50
Доза облучения
Положения теории попаданий в мишени
 Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде
 Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и
подчиняются пуассоновскому распределению
 Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую
чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз
Виды ионизирующих излучений
т.е. способных производить ионизации атомов (выбивать электроны с орбит )
-частиы
Ядро атома
X-лучи
(рентгеновское
излучение)
- -частицы
Рентгеновское излучение
не связано с радиоактивностью
-лучи
Вильгельм Конрад Рентген
и рука его жены (1895)
Природа ионизирующих излучений
Эрнест Резерфорд (1899)
Pb
-частицы:
е-
-
+
-лучи:
-частицы:
-
Фотон
+
+
4Не
2
Число нейтронов
Источник – радиоактиный изотоп, у
Источник
– радиоактиный изотоп, у
Излучение,
которого
ядра
атомов
нестабильны
за Защита
Масса
Заряд
тип радиации
которого
ядра атомов
нестабильны
за
счет избытка
счет
избытка
нейтронов
 (или
Ядрадефицита)
гелия
4 нейтронов
+2
Бумага, одежда


n
Электрон
ЭМ-волны
Частица
1/1836
0
1
Пластик, стекло
Свинец, бетон
Вода, парафин
-1
0
0
УФ
X-лучи -лучи
Частота, Гц
Длина
волны, м
Число протонов
Ионизирующая способность
Ионизации и линейная передача энергии (ЛПЭ)
Ионизирующее
излучение
-
Ионизированный атом
-
-
-
-
ЛПЭ = потери энергии ионизирующей частицы
на единицу пути в веществе (E/s)
Высокая ЛПЭ > 20 кэв/мкм
(- частицы, протоны, нейтроны)
Низкая ЛПЭ < 7 кэв/мкм
(-лучи, X-лучи, -частицы)
 
  

      
Прохождение излучений через вещество
Источники опасны
только при
поступлении в
организм
Бумага
-частицы
-частицы
-лучи
Пробег в ткани
0.1 – 3 мкм
Бетон
Единицы измерения доз
Относительная биологическая
ОБЭ
 Поглощенная доза – энергия,
выделенная
в 1 кг(ОБЭ)
вещества:
эффективность
излучения
Рентген, грей, бэр, рад, зиверт, рем…?
4 (Гр) =1 Дж/1 кг
1 Грей
3
 Экспозиционная доза – мера
ионизации
(только для - и X-лучей) 2
 - p+ 
заряд (одного знака), образующийся
в 1 см3 воздуха
1
0.1
1
10
100
1000
-1 ткани
1 РентгенЛПЭ,
(Р) =кэвмкм
0,0088
Гр
 Эффективная или эквивалентная доза – доза с учетом ОБЭ и
радиочувствительности пораженного органа
1 зиверт (Зв) = 100 бэр
Единицы измерения радоактивности
Только
для личного
Дозиметры
меряют
не дозу, апользования!
мощность дозы, т.е.
 Cкорость
(Бк)времени
=бэр
1 распад/сек
1 Грраспада
= 100атамов:
рад
 1100
Р  100
 1 Зв
поглощенную
дозу
вбеккерль
единицу
(Гр/c)
1 Кюри (Кю) = 3,71010 Бк
Положения теории попаданий в мишени
 Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде
 Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и
подчиняются пуассоновскому распределению
 Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую
чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз
Что является «мишенью»?
Идентификация мишени: ядро, хромосомы, ДНК


Микропучки -частиц с пробегом 40 мкм (210Ро):
избирательное облучение ядра
Микроразрезы: перенос необлученного ядра в облученную цитоплазму
Ядро в 100 раз более чувствительно, чем цитоплазма

Уридин (РНК, цитоплазма) и тимин (ДНК, ядро), помеченные тритием 3Н
(-излучатель, пробег 1-2 мкм)
 Сенсибилизация клеток 5-бромдезоксиуридином
(BUdR подобен, но не идентичен тимину)
 Радиочувствительность  содержание ДНК в клетках:
растения, насекомые, амфибии (объем интерфазных хромосом)
Облучение хромосом в 200-300 эффективней, чем облучение цитоплазмы
Свободный радикал OH
электрическиПрямое
нейтрален, и
нонепрямое
имеет
неспаренный электрон на внешней орбите радиации
высокая реакционная способность
(время
-10
жизни 10 с)
 2 мкм
действие
 Непрямое действие - радиолиз воды и
возникновение свободных радикалов при
прохождении излучения через цитоплазму:
- наиболее активен радикал OH
(75% повреждений ДНК)
- преобладает при низких ЛПЭ (- и X-лучи)
В любом случае речь идет
о попадании в ДНК-мишень
 Прямое действие - непосредственная ионизация
атомов ДНК
- преобладает при высоких ЛПЭ (-частицы, нейтроны)
Действие ионизирующих излучений
На клетку:
 «Интерфазная гибель» - мгновенное прекращение метаболизма и
разрушение клетки: большие дозы (> 20 Гр)
 «Репродуктивная гибель» - потеря способности к неограниченному
делению: низкие дозы (< 10 Гр):
На хромосомы:
 Однонитевые разрывы ДНК (низкое ЛПЭ)
 Двунитевые разрывы ДНК (высокое ЛПЭ)
 Повреждение оснований (особенно пиримидиновых).
Дальнейшие события:
 Репарация
 Хромосомные аберрации, мутации генов в половых и
соматических клетках (рак)
«редкихПуассона
событий»:
Попадания в мишени: Распределение
распределение
- число рыбок, пойманных за «время» D
- число изюминок в кексе «объема» D
- число голосов за Жириновского в
- среднее
попаданий при дозе D
квартале
с Dчисло
жителями
  объем мишени
Вероятность отсутствия поражений,
т.е. выживаемость при «одноударном»
механизме гибели
…………
Модель гибели «одна одноударная мишень»
Выживаемость, %
100
S(D)=e-D
50
Доза облучения
По оси ординат масштаб:
Удобен «полулогарифмический»
ln S(D)=-D
Выживаемость, %
D37
1
0.37
0.1
Первые правильные оценки
размера генов в хромосомах.
Задолго до «двойной спирали»!
Доза облучения

-
0.01
доза, вызывающая
63% гибели:
1-2 Гр для клеток млекопитающих
500 Гр - вирусы
Модель гибели «несколько одноударных мишеней»
Пусть для инактивации клетки
небходимо попадание в m
мишеней, например при m=2 :
Жива
Жива
Погибла
S(D)=1 – (1-e-D)m
Вероятность попасть в одну
мишень (хотя бы раз!)
Оценка «числа мишеней»!
m
Выживаемость, %
«Плечо»
1
Доза облучения
0.1
0.01

Численные оценки радиочувствительности
Выживаемость, %
 D50 - в токсикологии
100
 D37 - в радиобиологии

50
37
_
D - в теории вероятностей
_
D50 D37
D = Площадь под кривой
выживания в линейном масштабе
D
Выживаемость, %
Выживаемость, %
100
100
50
50
_
D
D
D
_
D - средняя доза,
вызывающая
гибель
=
Процедура нахождения площади более устойчива к разбросу точек,
по сравнению с алгоритмами вычисления D50 или D37
Одноударные и многоударные эффекты
…………
и т.д. – распределение Пуассона
Одноударный
эффект
Двухударный
эффект
Эффект (мутации, аберрации)
2 удара
1 удар
Доза облучения
Радиационно-специфические аберрации хромосом
 Центрические кольца + фрагменты
(2 разрыва в одной хромосоме)
 Дицентрики + фрагменты
(2 разрыва в разных хромосомах)
Одноударные и многоударные эффекты
2 разрыва
за 2 удара
 D2

1.5
n

X
Частота
дицентриков
Число дицентриков
на клетку

При увеличении
ЛПЭ кривая
становится
одноударной
1.6
1.2
0.8
0.4
0

0
2
4
Доза, Гр
6
2 разрыва
за 1 удар
 D
Выход
дицентриков
 D+ D2
Доза, Гр
5
Биодозиметрия
 Обнаружение хромосомных аберраций в лимфоцитах крови
– доказательство недавнего облучения организма
 Возможны более точные оценки индивидуальной дозы по данным,
полученным при облучении лимфоцитов in vitro
Калибровочная регрессия зависимости частоты дицентриков и центрических
колец на дозу -облучения (облучение лимфоцитов in vitro)
y = 0,001 + 0,015 D + 0,063 D2
Частота дицентриков и
цетрических колец на клетку
0,7
Частота
аберраций у
пациента
0,6
Минимальная доза, которую можно выявить
при анализе лимфоцитов составляет 0.1 – 0.2 Гр
0,5
0,4
0,3
0,2
Доза, полученная
пациентом
0,1
0
0
В.А. Шевченко, 2002
0,5
1
1,5
Доза, Гр
2
2,5
3
Репарация
Повреждения ДНК
Частота на Гр
Доля летальных
Изменение оснований
500/Гр
0.01
Однонитевые разрывыАцентрические
1000/Грфрагменты
0.01
исключенные из
Сшивки ДНК-белок хромосом150/Гр
ядер в момент
Двунитевые разрывы клеточных
50/Гр
деления клеток
?
0.95
Частота микроядер/100 клеток
Влияние мощности дозы на частоту микроядер
5
de Toledo et al. 2006
4
3
2
При уменьшении
мощности дозы
1
0
Контроль
10 cГр
(острое)
10 cГр/2 ч
10 cГр/24 ч
10 cГр /48 ч
Репарация – зависимость выживаемости от
мощности дозы
Репарации обнаруживается по изменению наклона кривых «доза-эффект»:
 при изменении мощности дозы
 при фракционированном облучении
1
10-1
X-лучи: 0,01
Гр/мин
10-2
При увеличении-3
мощности дозы и 10
ЛПЭ
излучения
X-лучи:
1 Гр/мин
10-4
0
2
Нейтроны:
1 Гр/мин
4
6
8
Доза,
Гр
Нейтроны:
0.01 Гр/мин
10
Репарация – зависимость выхода дицентриков от
мощности дозы
Частота дицентриков на клетку
Нейтроны, энергия
0.714.7 Мэв
При увеличении
мощности
2.0 дозы и ЛПЭ
излучения
X-лучи:
1Гр/мин
X-лучи:
0,003 Гр/мин
1.5
1.0
Принцип «беспороговости» и «кумулятивности»
мутационного процесса
0.5
D.C. Lloyd (1981)
0
1
2
3
4
5
Доза, Гр
Выход Х-сцепленных рецессивных леталей у
дрозофилы не зависит от мощности дозы в
диапазоне 0.03 - 100 Гр/час
Проект «MegaMouse» супругов
L. B. Russell & W. L. Russell (1955-1965)
7 морфологических мутаций
7 миллионов мышей!
Индукция морфологических мутаций в потомстве облученных родителей
Пять главных выводов
 Выход различных мутаций на 1 Гр различается в 30 раз.
1 Гр
 Эффект мощности дозы существенен. Хроническое облучение вызывает
меньше мутаций, чем острое (в отличии от Drosophila)
The frequency
of radiation-induced
mutations is not,
 Самцы
более радиочувствительны,
чем самки.
as the classical view holds, independent of dose rate.
 Генетические
эффекты
уменьшаются,
W. L. Russell,
L. B.существенно
Russell. Science,
19, 1958
если увеличивается время между облучением и спариванием.
 Удваивающая доза для частоты мутаций равна 1 Gy.
Всем спасибо, и еще раз напомню:
 Биологические эффекты ионизирующих излучений в основном связаны с
воздействием на ядерное ДНК
 Экспоненциальная зависимость выживаемости от дозы означает гибель от
случайных и независимых актов поражения
 Квадратичная зависимость от дозы указывает на двухударный механизм
формирования эффекта
 Зависимость кривой «доза-эффект» от мощности дозы указывает на
присутствие репарации
 Для млекопитающих доза, удваивающая частоту мутаций в потомстве  1 Гр
 1 Гр  100 рентген, хотя это разные вещи
Копию презентации можно скачать на сайте ИОГен: www.vigg.ru