Генетический контроль радиочувствительности

Генетический контроль
радиочувствительности у человека
А.В. Рубанович
Учреждение российской академии наук
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
rubanovich@vigg.ru
Почему нужно изучать
«генетику радиочувствительности»?
Прикладные
Полет на Марс:
суммарно за 3
аспекты:
года не менее
1,2 Зв
Профессиональный отбор на основе
индивидуального генотипирования
Индивидуализация радиотерапии
Диспансеризация лиц, облученных в результате
профессиональной деятельности или проживающих
в радиационно-загрязненных районах
Почему нужно изучать
«генетику радиочувствительности»?
Общебиологические аспекты:
Генетика количественных признаков
Наследование и изменчивость неспецифической
устойчивости
Причины распространения и поддержания в
популяциях потенциально опасных генотипов
Как проявляется изменчивость
индивидуальной радиочувствительности?
Обычно имеют в виду следующее:
Облучение
in vitro: 1 Гр
Донор 1
6 аберраций на 100 клеток
Донор 2
20 аберраций на 100 клеток
Донор 1
более устойчив?
Различия высоко значимы по точному критерию Фишера: р=0,0054
Различия по частоте аберраций – это стохастика «попадания»
или результат дифференциальной радиочувстительности?
Распределение частот спонтанных аберраций
хромосом
в лимфоцитах
крови большой
группы
Но это лишь
косвенное доказательство
существования
доноров (реальные
данные,
250 доноров)
изменчивости
индивидуальной
радиочувствительности!
Частота
50
Частота, %
Различия
значимы
ответ
могут высоко
дать только
сравнения
аберраций
ГруппаОднозначный
людей с
по
точному
критерию
Пуассоновское
низким
уровнем
дозовых
зависимостей
выхода
хромосомных
аберраций
40
распределение
спонтанных
Фишера!
отдельных
доноров
аберраций
А в этой группе
вероятно есть
устойчивые к
соматическому
мутированию
30
Группа людей с
высоким
уровнем
Совсем не
обязательно!
спонтанных
Необходимоаберраций
сравнить с
пуассоновским распределением
(с таким же средним)
20
10
0
0-1
1-2
2-3
3-4
4-5
5-6
Группа людей с
предрасположенностью
то в этой группе
есть
к соматическому
люди с повышенной
мутированию???
частотой аберраций
Частота
аберраций на 100 клеток
Еслиспонтанных
различия значимы,
>6
Что свидетельствует о генетическом
характере изменчивости
индивидуальной радиочувствительности?
Единственное неоспоримое
доказательство
Прямые доказательства:
регулярный источник
 Единственный
Высокая радиочувствительность
клеток при некоторых
данныхгенетических
о радиационном
поражении
in Дауна, атаксиятяжелых
заболеваниях
(синдром
vivo на уровне организма
телеангиэктазия)
Основная тема нашего
разговора
 Изменчивость
реакций тканей при радиотерапии
 Различная радиочувствительность хромосом у носителей
различных широко распространенных генотипов
Сравнительная радиочувствительность
структурных и
Для каждогохромосом
донора при генных,
Относительная
Кариотип донорачисловыхпостроена
Диагноз
кривая
мутациях
(Е.К. выхода
Хандогина,
2009)
радиочувствительность
хромосом
46,XY
аберраций при облучении
Атаксия
телеангиэктазия
(АТ)
в диапазоне
0,25-3
Гр
Выход
индуцированных
46,XX
хромосомных
аберраций
Гетерозиготное носительство генов АТ
46,XY
(практически здоровы)
у больных
атаксией
и
46,XY
Отношение
площадей
подПрогерия
кривой выхода
синдромом
Дауна
46,XX
повышен
вв1,5-2
раза обследуемого донора и
аберраций
клетках
46,XY
соответствующей
контрольной
кривой при
46,XY
Синдром Паркинсона
облучении
в диапазоне
0,25-3 Гр
46,XX
Частота
гетерозигот
по гену АТМ
46,XX, rcp(5;13)
здорова
доходит
до 3%. Выход Практически
аберраций
45,XX, -14,-21,+rob(14;21)
Практически здорова
повышен на 30%
46,XX, 5 p46,XX – 40%
45,XX, -13, -18,+der(18) rcp
(13;18) -60%
47,XY,+21
47,XY,+21
47,XY,+21
47,XY,+21
47,XY,+21
47,XY,+21
46,XX – 33%
47,XX,+21 – 67%
45,X0
Синдром кошачьего крика
Синдром «18q-»
Синдром Дауна
Синдром Шерешевского-Тернера
1,910,17*
1,31  0,05*
1,30  0,06*
1,14  0,09
1,56  0,06*
0,98  0,06
0,94  0,08
1,23  0,05*
0,92  0,04
1,16  0,06*
0,92  0,04
1,10  0,08
1,12  0,08
1,72  0,06*
1,50  0,05*
1,16  0,07
1,24  0,07
1,24  0,09*
1,45  0,04*
~1,2*
~1,8*
1,57  0,10*
Кариотип донора
Диагноз
Относительная
радиочувствительность хромосом
46,XY
Атаксия телеангиэктазия (АТ)
1,910,17*
46,XX
46,XY
46,XY
46,XX
46,XY
46,XY
46,XX
46,XX, rcp(5;13)
45,XX, -14,-21,+rob(14;21)
46,XX, 5 p46,XX – 40%
45,XX, -13, -18,+der(18) rcp
(13;18) -60%
47,XY,+21
47,XY,+21
47,XY,+21
47,XY,+21
47,XY,+21
47,XY,+21
46,XX – 33%
47,XX,+21 – 67%
45,X0
Гетерозиготное носительство генов АТ
(практически здоровы)
Отношение площадей подПрогерия
кривой выхода
аберраций в клетках обследуемого донора и
соответствующей контрольной
кривой при
Синдром Паркинсона
облучении в диапазоне 0,25-3 Гр
Практически здорова
Практически здорова
Синдром кошачьего крика
Синдром «18q-»
Синдром Дауна
Синдром Шерешевского-Тернера
1,31  0,05*
1,30  0,06*
1,14  0,09
1,56  0,06*
0,98  0,06
0,94  0,08
1,23  0,05*
0,92  0,04
1,16  0,06*
0,92  0,04
1,10  0,08
1,12  0,08
1,72  0,06*
1,50  0,05*
1,16  0,07
1,24  0,07
1,24  0,09*
1,45  0,04*
~1,2*
~1,8*
1,57  0,10*
Почему использовано отношение площадей под
кривыми доза-эффект?
Частота
аберраций
Радиобиологи
вместо понятия
y=kD
_
S/S0 =k/k0
«средняя продолжительность
жизни» ( D)
y=k0D
В нелинейном случае отношение
S
любят
использовать
площадей – это отношение средних
S0
показателй
выхода
аберраций
«возраст, в котором умирает
каждый
второй»
D
на единицу дозы (LD50)
Кстати для выживаемости: площадь под кривой выживания
(в линейном масштабе) равна средней «убивающей» дозе
Выживаемость, %
100
50
_
D - средняя доза,
вызывающая
гибель
LD50
=
D
Процедура нахождения площади
более устойчива к разбросу
точек, по сравнению с
алгоритмом вычисления LD50
Что свидетельствует о генетическом
характере изменчивости
индивидуальной радиочувствительности?
Прямые доказательства:
 Высокая радиочувствительность клеток при некоторых
тяжелых генетических заболеваниях (синдром Дауна, атаксиятелеангиэктазия)
 Изменчивость реакций тканей при радиотерапии
 Различная радиочувствительность хромосом у носителей
различных широко распространенных генотипов
Результаты радиотерапии больных раком молочной железы
Частота случаев прекращение курса радиотерапии
из-за тяжелого поражения кожного покрова
 O. Popanda, Xiang-Lin Tan, et al. Genetic Polymorphisms in
the DNA Double-Strand Break Repair Genes XRCC3, XRCC2, and
NBS1 Are Not Associated with Acute Side Effects of Radiotherapy in
Breast Cancer Patients. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2006
 C. Ambrosone, C. Tian, et al. Genetic predictors of acute
toxicities related to radiation therapy following lumpectomy for
breast cancer: a case-series study. Breast Cancer Research, 2006.
47 из 446 (11%)
77 из 427 (18%)
Доля случаев тяжелого
поражения кожи, %
Полиморфизмом гена GSTP1 можно объяснить
182% - реакции
средняя частота
40 изменчивости
35%
на радиотерапию
случаев тяжелого поражения
кожного покрова
…но лучше этого
30
не делать!
В выборке из
427 больных
20
10
0
41%
49%
9%
A/A
A/G
G/G
Генотип по локусу GSTP1
Что свидетельствует о генетическом
характере
изменчивости
Обусловлена редкими
мутациями.
Тестируя
кандидатов в космонавты,
индивидуальной
радиочувствительности?
вы их не найдете!
Прямые доказательства:
 Высокая радиочувствительность клеток при некоторых
тяжелых генетических заболеваниях (синдром Дауна, атаксия
телеангиэктазия)
 Изменчивость реакций тканей при радиотерапии
 Различная радиочувствительность хромосом у носителей
различных широко распространенных генотипов
Частично обусловлены генетической
изменчивостью, т.е. полиморфизмом генов
Вспомним терминологию:
Генетическая изменчивость или полиморфизм генов –
одновременная встречаемость в популяции различных
вариантов генов (аллелей)
 Полиморфизм – ген представлен в популяции двумя и более
аллельными вариантами. При этом частота более редкого
(минорного) аллеля > 5%
 Мутации – редкие (< 1%) и обычно вредные аллели
Виды генетического полиморфизма
 SNP – Single Nucleotide Polymorphism - однонуклеотидные
замены оснований в ДНК
 STR, VNTR – изменчивость числа коротких повторов
(микро- и минисателлиты). Нейтральная изменчивость в
некодирующей части ДНК.
 Делеционный полиморфизм – в локусе может быть вырезана
длинная последовательность нуклеотидов. Тогда в популяции
встречаются 2 вида аллелей: функциональный и делетированный.
Гомозигота по делеции не синтезирует соответствующий белок.
Делеции
детоксикации
ксенобиотиков:
 Дупликации
– в генов
популяции
встречаются
хромосомы с
несколькими копиями одного гена
GSTM1
15 Кб - каждый второй
 CNV – copy number variations
GSTT1
54,2 Кб … и каждый пятый из нас!
SNP - однонуклеотидные замены оснований в ДНК первопричина генетической изменчивости (2005)
CGGGAGC CGATTT
GCCCTC GGCTAAA
Нормальная последовательность
(в гене MTHFR)
Реальный
пример: SNP в экзоне
гена MTHFR. с заменой
Последовательность
TCGATTT
CGGGAG
C
Фермент
тетрагидрофолатредуктаза,
С  Т (или G  A )
GCCCTC5,10-метилен
G
AGCTAAA
ответственный за метилирование ДНК и синтез тиминов.
Аллель Т часто
сопряжен с предрасположенностью
к
Полиморфизм
– одновременная
встречаемость в популяции
онкозаболеваниям
обоих вариантов
(с частотой > 5%):
CGGGAGCCGATTT - аллельный вариант С (мажорный, предковый)
CGGGAGТCGATTT - аллельный вариант Т (минорный, мутантный)
Генотипы:
Фенотипы:
Обозначение:
С/C - 40%
нормальная
активность
MTHFR С677T
C/T - 50%
T/T - 10%
обычно пониженная
активность фермента
(677-положение нуклеотида)
www.hapmap.org
База данных гаплотипов
3 800 000 SNP для 4 популяций
( по 100 человек)
Геном – это флешка
на 3 Гб
18961_c1
A
A
T
A
T
G
C
C
T
T
A
G
A
G
T
G
G
G
T
G
T
A
G
C
A
C
G
T
A
T
C
G
C
A
G
C
A
C
G
18963_c2
A
A
T
A
T
G
C
C
T
T
A
G
C
G
T
G
G
G
T
G
T
A
G
C
A
C
G
T
A
T
C
G
C
A
G
C
A
C
G
18976_c1
A
A
T
A
T
G
C
C
T
T
A
G
C
G
T
G
G
G
T
G
T
A
G
C
A
C
G
T
A
T
C
G
C
A
G
C
A
C
G
19056_c2
A
A
T
A
T
G
C
C
T
T
A
G
A
A
T
G
G
G
T
G
T
A
G
C
A
C
G
T
A
T
C
G
C
A
G
C
A
C
G
19059_c1
A
A
T
G
C
G
C
C
C
C
A
T
C
A
T
A
G
G
T
G
T
G
A
T
G
C
G
C
C
T
C
A
C
G
G
C
G
T
G
18977_c1
A
A
T
G
C
G
C
C
C
C
A
T
C
A
T
A
G
G
T
G
C
G
A
C
G
C
G
C
C
T
C
A
C
G
G
C
G
T
G
19065_c2
A
A
T
G
C
G
C
C
C
C
A
T
C
A
T
A
G
G
T
G
C
G
A
C
G
C
G
C
C
T
C
A
C
G
G
C
G
T
G
 Полиморфен каждый десятый ген с частотой
встречаемости аллелей до 50%
Это не сиквенс, а гаплотипы, т.е.
нуклеотиды
в соседствующих
 Мы
отличаемся друг от другаMinor
в среднем
Alleleкаждым
Frequency
сайтах
SNPнуклеотидом (2009 - двумя на 1000)
тысячным
 Описаны 7 000 000 SNP (MAF>5%)
и 4 000 000 SNP (1%<MAF<5%)
(0,3% всего генома) – апрель 2009
Как выявить сопряженность (корреляцию,
ассоциацию) частот аберраций и генотипов?
Оценки радиочувствительности:
 частоты аберраций хромосом
 экспресс-цитогенетика: микроядра, СХО
 уровень
TCR-мутантных
лимфоцитов
XRCC1,
XRCC3, APE,
XPD,
XPG, XPC, RAD51, OGG1
 длины хвостов комет
CYP1A1, CYP2D, GSTM1, GSTT1,
GSTP1, SOD2, MDR1, NAT2
MTHFR, p53, CCND1
Кандидатные полиморфизмы:

 гены репарации ДНК
 гены детоксикации ксенобиотиков и
оксидативной защиты
 гены клеточного цикла и апоптоза
Далее потребуется статистический анализ
?
Статистический анализ сопряженности частот
аберраций и генотипов
Частота аберраций хромосом
 Самое простое и необходимое: вычисление средних
частот аберраций для носителей различных генотипов.
Далее сравнение по непараметрическому тесту
(не по Стьюденту!)
Обычно стараются рассмотреть две группы
0.04
0.03
0.002
0.01
0.00
A/A
Гомозигота поРецессивная
мажорному аллелюмодель
+
A/G
+
G/G
ДоминантнаяГомозигота по
модельминорному аллелю
Статистический анализ сопряженности частот
аберраций и генотипов
 Далее
Самое
простое и необходимое:
вычисление
средних
вычисляются
относительные
риски (OR)
частот аберраций для носителей различных генотипов.
и значимость
по непараметрическому
точному критерию Фишера.
Далее
сравнение по
тесту
В данном
примере риск возникновения аберраций
(не
по Стьюденту!)
у носителей минорного аллеля G равен OR=2,1 и р=0,015
 Сравнение частот генотипов для групп с низким
(или высоким) уровнем аберраций
40
30
20
40
G/G
A/G
30
A/G
20
A/A
10
0
G/G
50
Частота, %
, %
Частота,
60
Группа людей с
нулевым уровнем
аберраций
50
A/A
10
0-1
1-2
2-3
3-4
4-5
5-6
Частота аберраций на 100 клеток
>6
0
0
1
Частота аберраций на 100 клеток
OR – количественная мера предрасположенности (Odd Ratio)
OR – непременный атрибут «case-control association study»
(выявление «генов предрасположенности» к заболеванию
путем сопоставлений частот генотипов у больных и здоровых)
OR показывает во сколько раз повышена вероятность
заболеть для носителя «плохого» генотипа
Группа больных
Рбольные
OR =
Контроль (здоровые)
>>
Р
- генотип,
указывающий на
предрасположенность
к заболевания
Рконтроль
(1- Р
)
больные
контроль
______________________
Рконтроль (1- Рбольные)
OR>1 – генотип связан с болезнью
OR=1 – нет связи между генотипом и болезнью
OR<1 – протективный генотип
Статистический анализ сопряженности частот
аберраций и генотипов
 Самое простое и необходимое: вычисление средних
частот аберраций для носителей различных генотипов.
Далее сравнение по непараметрическому тесту
(не по Стьюденту!)
Зависимая
переменная
– частота
 Сравнение
частот
генотипов
для(р),
групп с низким
независимыми
переменные
– генотипы (xi).
(или высоким)
уровнем
аберраций
Нелинейные
Например
так:многомерные
A/A - 0, A/T -регрессии,
1, T/T - 2
реализованные в пакетах Statistica и SPSS
 Логистическая и пуассоновская регрессии
p
1
1  e a1x1 ...  an xn
р – частота аберраций
xi – генотип i-го локуса
аi – коэф. регрессии
Для логиcтической
регрессии ai =ln(ORi)
p  e a0  a1x1 ...  an xn
Что свидетельствует о генетическом
характере изменчивости
индивидуальной радиочувствительности?
Прямые доказательства:
 Высокая радиочувствительность клеток при некоторых
тяжелых
генетических
заболеваниях
«Сначала
я говорил,
о чем буду(синдром
говорить,Дауна, атаксиятелеангиэктазия)
затем говорю,
потом буду говорить, о чем сказал»
 Изменчивость реакций
припроповедника
радиотерапии
Правилотканей
английского
 Различная радиочувствительность хромосом у носителей
различных широко распространенных генотипов
Chromosomal aberrations under basal conditions and after treatment
with X-ray in human lymphocytes as related to the GSTM1 genotype
B. Karahalil, S. Sardas, et al. Mut. Res., 515 (2002)
GSTM1- «положительный»
генотип: +/+ либо +/0
Аберрации, индуцированные 1 Гр:
GSTM1 0/0 > GSTM1 +
GSTM1- «нулевой»
генотип: 0/0
Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and
DNA repair efficiency in a healthy population
F. Marcona, C. Andreoli, et al. Mut. Res., 541 (2003)
Противоречия с предыдущей работой
вероятно связаны с «плохой» статистикой:
в обеих работах анализировали
50-100 метафаз для 15-30 доноров
Генотипы
Аберрации, индуцированные 2 Гр:
GSTM1 0/0 < GSTM1 +
Частоты спонтанных и индуцированных хромосомных
аберраций у здоровых добровольцев, в зависимости от
генотипов по кандидататным генам
Лаборатория экологической генетики
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
116 здоровых добровольцев до 25 лет - курсанты
Военно-технического университета (г. Балашиха)
Цитогенетический анализ
(не менее 500 метафаз на
человека)
Выделение ДНК,
ПЦР-генотипирование
-облучение 1 Гр in vitro
Генотипировано по 7 локусам, предположительно влияющим
на естественную изменчивость радиочувствительности:
Локус
CYP1A1
Полиморфизм
A4889G
(8%)
Белок
Функция
Цитохромы
P-450
1-ая фаза детоксикации
ксенобиотиков
G1934A
CYP2D6
(14%)
Делеция
GSTM1
(70%)
Делеция
Глутатион-S
GSTT1
трансферазы
(40%)
2-ая фаза детоксикации
A313G
ксенобиотиков
GSTP1
(25%)
G590A
N-ацетилNAT2 Созданный банк ДНК позволяет в дальнейшем
трансферазавнимание
2
При
основное
будет уделяться
(28%)этомПланируются:
продолжить
поиск
генов,
5,10-метилен
Превращение
гомоцистеина в
SOD2,
MDR1,
высокополиморфным
XRCC1,
CCND1,
COMT
локусам
C677T
с радиочувствительностью
MTHFRассоциированных
тетрагидрофолат
метионин (метилирование
(30%)
редуктаза
ДНК, синтез тиминов)
Детоксикация, репарация
ДНК, регуляция
…
> 10%
оксидативного ответа и
клеточного цикла
Частоты спонтанных и индуцированных хромосомных
аберраций у здоровых добровольцев, в зависимости от
генотипов по кандидататным генам
Лаборатория экологической генетики
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
 Спонтанные аберрации в лимфоцитах периферической
крови в зависимости от генотипов по 7 локусам (1000 метафаз
для каждого из 92 доноров)
 Индуцированные аберрации (1 Гр in vitro) в лимфоцитах
периферической крови в зависимости от генотипов по 7 локусам
(500 метафаз для каждого из 92 доноров)
Частота спонтанных аберраций
Спонтанный уровень аберраций хромосом в
По суммарному количеству спонтанных
зависимости
от «однолокусных»
генотипов:
аберраций
генотипы не различалсь
предварительные итоги
Средний уровень 0,009 
95% доверительный
интервал
0.01
0.005
0
0/0
+
GSTM1
0/0
+
GSTT1
A/A A/G G/G A/A A/G G/G G/A G/G A/A G/A G/G C/C C/T T/T
GSTP1
CYP1A
CYP2D
NAT2
MTHFR
Обнаружены различия по аберрациям
хромосомного типа между генотипами GSTM1
Распределение
частот
спонтанных
аберраций
хромосомного
При этом Доноры,
различие
среднихот аберраций
«свободные»
хромосомного
типа:
57% «нулевых»
против 27% по
«положительных»
типа
зависимости
от генотипа
локусу GSTM1
на вграни
значимости:
(OR = 3,4; p = 0,0081 по точному критерию Фишера).
р=0,039 по Манну-Уитни
GSTM1
Относительная частота, %
60
0, 00200,0005
0, 00270,0004
50
40
0/0 (35)
+ (57)
Спонтанные аберрации:
GSTM1 0/0 < GSTM1 +
30
20
10
0
< 0,001
0,001-0,003 0,003-0,005 0,005-0,007
>0,007
Частота аберрации хромосомного типа
Средние частоты спонтанных аберраций хромосомного и
хроматидного
типа
в зависимости
от генотипов
пои кольцевые
локусам
Дицентрические
Генотипы
по GSTM1
отличались
хромосомы, ацентрики,
частоте аберраций GSTM1-GSTT1
хромосомного
0.003
0.002
0.001
0.000
Частота спонтанных аберраций
Спонтанные аберации
хромосомного типа
атипичные моноцентрики
типа лишь на 30% (р = 0,04).
0.004
Хромосомные
0.010
Различия по частоте
хроматидных аберраций
не 0.008
значимы
0/0
GSTM1
Хроматидные
Обмены, одиночные и
изохроматидные
фрагменты
+
0.006
0.004
0.002
GSTM1 +
GSTT1 0
0.000
00
У двойных гомозигот по (11)
делециям частота аберраций
Генотипы
хромосомного типа в 4,5 раза
ниже, чем у остальных
генотипов (р = 0,016).
GSTM1 0
GSTT1 +
+0
0+
++
(19)
(24)
(38)
по локусам GSTM1-GSTT1
Частоты спонтанных и индуцированных хромосомных
аберраций у здоровых добровольцев, в зависимости от
генотипов по кандидататным генам
Лаборатория экологической генетики
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
 Спонтанные аберрации в лимфоцитах периферической
крови в зависимости от генотипов по 7 локусам (1000 метафаз
для каждого из 92 доноров)
 Индуцированные аберрации (1 Гр in vitro) в лимфоцитах
периферической крови в зависимости от генотипов по 7 локусам
(500 метафаз для каждого из 92 доноров)
Индуцированные аберрации (-облучение 1Гр in vitro) в
зависимости от «однолокусных» генотипов
Частота аберраций при 1 Гр
Средний уровень 0,123 
95% доверительный
интервал
0.15
0.1
0.05
0
0/0
+
GSTM1
0/0
+
GSTT1
A/A A/G G/G A/A A/G A/A G/A G/G A/A G/A G/G C/C C/T T/T
GSTP1
CYP1A
CYP2D
NAT2
MTHFR
Не обнаружено различий между «однолокусными» генотипами
по уровню индуцированных аберраций после облучения 1 Гр in vitro
Распределения частот аберраций, индуцированных дозой 1 Гр in
vitro, для различных генотипов по локусам GSTP1, MTHFR и NAT2
Частота аберраций, индуцированных дозой 1 Гр
0.22
r=0,25; p=0,0065
0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
Все локусы
Двалокусов
локусаВсе
из локусы
Хотя бы один из
(GSTP1, MTHFR и GSTP1,
NAT2)
0.1 и
MTHFR
NAT2 и NAT2)
(GSTP1,
GSTP1, MTHFR
NAT2 иMTHFR
гомозиготны
по
несут минорные
аллели аллели
несут минорные
несеталлелю
минорный
аллель
мажорному
0.08
0.06
0
1
2
3
Число локусов (из набора
и NAT2)
несущих минорные аллели
ЧислоGSTP1,
локусов MTHFR
с минорными
аллелями
Частота спонтанных аберраций
Средние частоты спонтанных аберраций хромосомного и
хроматидного типа для различных генотипов по локусам
GSTP1, MTHFR и NAT2
0.014
Хромосомные
0.012
Хроматидные
0.010
Для спонтанных
аберраций
тенденция0.008
роста
незначима
0.006
0.004
0.002
0.000
0
(14)
1
(29)
2
(40)
3
(9)
Генетика радиочувствительности человека:
сопряженность соматической мутабильности
с полиморфизмом ДНК
 Уровень спонтанных и индуцированных хромосомных
аберраций в зависимости от генотипов по кандидататным генам
 Спонтанный уровень спонтанных TCR-мутантных лимфоцитов
в зависимости от генотипов по кандидататным генам
Частоты спонтанных TCR-мутантных лимфоцитов, в
зависимости от генотипов по кандидататным генам
ГУ Медицинский радиологический научный центр РАМН
Лаборатория экологической генетики
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
TCR-мутантные лимфоциты
Мутации аутосомных генов, приводящие к
нарушению свойств Т-клеточного рецептора на
поверхности Т-лимфоцитов
(не образуется комплекс с CD3-антигеном)
Регистрация на проточном цитофлюориметре
Распределение частот TCR-мутантных клеток (10-4)
для носителей различных генотипов по локусу CYP1A1
Высокую частоту TCR-мутаций имеют
носители минорного аллеля G в локусе CYP1A1
OR=20,6 ; P=0,0002
по точному критерию Фишера
CYP1A1
80
70
50
40
30
20
100
10
A/A
0
1
2
3
4
5
6
7
Частота генотипов, %
Частота, %
60
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Уровень TCR-мутаций
80
17
18
19
20
21
22
23
24
25 >25
A/G+G/G
60
40
20
0
<3
3-9
>9
Частота TCR-мутаций (10-4)
CYP1A1
HFE147
COMT
HFE845
CYP2D6
GSTM1
GSTT1
GSTP1
NAT2
MTHFR
Распределение частоты TCR-мутантных клеток (10-4)
при различных генотипах для усеченного распределения
-4)
Распределение
частоты
TCR-мутантных
клеток
(10
Повышенная частота TCR-мутантных клеток
без аномально
высокихпо
значений
(более
3)
характерна
для гомозигот
минорным
аллелям
локусов HFE187, GSTM1 и MTHFR
(пониженная активность соответствующих ферментов)
80
80
7
6
5
TCR-мутации
70
70
%
Частота, %
Частота,
60
60
50
50
4
3
2
1
40
40
0
30
30
C/C C/G G/G
+
0/0
C/C C/T T/T
MTHFR
A/A A/G
HFE187
GSTM1
CYP1A1
44
Различия достоверны только
для
GSTM1
10 11
11 12
12 13
13 14
14 15
15 16
16 17
17 18
18 19
19 20
20 21
21 22
22 23
23
10
20
20
10
10
00
11
22
33
55
66
77
88
99
Уровень TCR-мутаций
TCR-мутаций
Уровень
24 25
25 >25
>25
24
Генетика радиочувствительности человека: сопряженность
соматической мутабильности с полиморфизмом ДНК
Некоторые удивительные итоги
 Удивительно, но частоты спонтанных (in vivo) и
индуцированных (in vitro) аберраций хромосом ассоциированы
с различными группами генов
 Удивительно, но крупные делеции генов детоксикации чаще
сопряжены не с повышенным, а с пониженным уровнем
цитогенетических нарушений
 Удивительно, но большинство SNP, в том числе связанные с
репарацией ДНК, слабо коррелируют с радиочувствительностью
хромосом
Корреляция частот аберраций до и после облучения
(1 Гр in vitro, 97 доноров)
Ранговая корреляция
r=0,27; p=0,004
-5
Частота индуцированных аберраций
(1 Гр in vitro)
0,25
r=0,41; p=3 .10
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
0,01
0,02
0,03
0,04
Частота спонтанных аберраций
0,05
Эксперессия изученных полиморфных генов в тканях
и лимфоцитах крови
Локус
Полиморфизм
Экспрессия
Экспрессия в
лимфоцитах
GSTM1
Делеция
14 kb
(70%)
Печень > тестикулы > мозг > надпочечник
+
Делеция
54 kb
(40%)
Эритроциты > легкие > почки > мозг > сердце
-
A313G
Ile105Val
(25%)
Легкие > плацента > мочевой пузырь >
молочная железа
+
C677T
Val114Ala
(30%)
Везде?
+
11p13.3
GSTT1
22q11.2
GSTP1
11q13
exon 5
MTHFR
1p36.3
exon 4
Генетика радиочувствительности человека: сопряженность
соматической мутабильности с полиморфизмом ДНК
Некоторые удивительные итоги
 Удивительно, но частоты спонтанных (in vivo) и
индуцированных (in vitro) аберраций хромосом ассоциированы
с различными группами генов
 Удивительно, но крупные делеции генов детоксикации чаще
сопряжены не с повышенным, а с пониженным уровнем
цитогенетических нарушений
 Удивительно, но большинство SNP, в том числе связанные с
репарацией ДНК, слабо коррелируют с радиочувствительностью
хромосом
Частота аберраций у «нулевых» генотипов по отношению к частоте
аберраций у носителей функционального аллеля локусов GSTM1 и GSTT1
по данным различных
Спонтанныеисточников
и индуцированные
Тест
Воздействие
0
ХА
Отношение частот
аберрации хромосом:
Число случаи когда
Число
аберраций (0 к +)
клеток
на
Источник
GSTM1 0/0
< GSTM1
+
людей
человека
GSTM1
GSTT1
Спонтанные и индуцированные
0,63
Частота
аберраций
для GST
0/0 когда
аберрации
хромосом:
случаи
18 GSTT1
1000/0 <для
2002
Частота
аберраций
GSTKarahalil,
++
GSTT1
Тип воздействия.
ХА
1 Гр
1,28
Повышенная
устойчивость
гомозигот по делециям GST
0
–
спонтанный
уровень
ХА – хромосомные аберрации
скорее
является
правилом,
чем исключением
0СХО
1,17
0,45
*
– сестринские
хроматидые
обмены
31
100
Marcon, 2003
СХО
ХА
ХА
34
67
78
30
100
100
Статистически
Tuimala, 2004.
обусловленные
исследования
24
100
Kocabas, 2005.
644
56
91
279
92
92
1000
1000
100
100
1000
500
Kirsch-Volders, 2006.
Iarmarcovai, 2006
Catalan, 2009.
Rossi, 2009
2 Гр
0,79*
МЯ - микроядра
Некурящие
0,97
Некурящие
1,42
Курящие
0,87
ХА
0
0,79
МЯ
МЯ
ХА
ХА
0
0
0
0
0
1 Гр
0,94
0,67*
0,89
0,97
0,85**
1,00
ХА
0,80*
1,06
0,46
1,95
0,55 *
0,68*
0,95
0,82
1,15
1,03
Наши данные, 2009
Почему этот вывод выглядит крамолой?
GST 0/0 – генотип, с которым традиционно связывают:


Повышенную чувствительность ко всем химическим
токсикантам, особенно наЭто
фоне
курения
бесспорно!
Глутатион-S-трансферазы
– это все-таки детотоксиканты
Предрасположенность ко многим распространенным
системным заболеваниям (рак, астма, бесплодие,
гипертония, болезнь
Альцгеймера)
В основном
данные противоречивы.
При этом прослеживается желание приписать «нулям»
предрасположенность к любым недугам
~ 6000 работ о делециях GST c 1975 г.
(из них 5000 об ассоциациях с раком )
High-Throughput Detection of GST Polymorphic Alleles in a Pediatric Cancer Population
P. Barnette, R. Scholl, et al. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention (2004)
Контроль
13 генотипов
OR=6,4
P=0,007
8 видов
«детских»
раков
OR=2,3
P=0,018
OR<1
OR>1
Гомозиготность по делециям генов
GST защищает детей от рака?
Association of
homozygous
wild-type glutathione
Методы
генотипирования,
S-transferase M1 genotype with increased breast cancer risk
позволяющие
различать
генотипы
+/+ иRes.
+/0 (2004)
Roodi N.,
Dupont W.D.,
Moore J.H.
et al. Cancer
(ПЦР в реальном времени, продленный режим амплификации)
Частоты генотипов, %
Выявляя
гомозиготы
+/+,
Обычная
методика
позволяет
видим
РМЖ с
увидеть
лишьассоциацию
такую картинку:
функциональным
аллеллем
80
эффектов
нет
(OR=2,83; p=0,002)
Здоровые
РМЖ
60
40
20
+/+ и +/0
0
0/0
+/0
+/+
Генотипы по GSTM1
+
Что может обеспечивать повышенную устойчивость
гомозигот по делециям локусов GST ?
И все же должен
существовать
более
универсальный механизм
Некоторые
цитаты
и спекуляции:
поддержания делетированного аллеля GSTM1*0 в популяции:
 Показатели антиоксидантной защиты (активность глутатион
пероксидазы, церулоплазмина и др.) выше при наличии в пуле GST
 Популяционная
GSTM1*0менее
превышает
70%вариантов
!
одного
или несколькихчастота
функционально
активных
В результате
каждый второй
из нас (0,72как
=0,49)
Повышенная
репарационная
способность
компенсаторный
не дефицита
продуцирует
фермент, ответственный за обезвреживание
эффекта
GSTM1
очень широкого класса генотоксикантов
 При избытке активного GST нарушается нормальный ход
апоптоза
 Уменьшение активности пищевых антиоксидантов в
присутствии GST (изотиацианаты являются субстратом для GSTM1)
Мета-анализ:
частота гомозигот по делеции GSTM1 в контрольных выборках
Частота «нулевых»
генотипов
GSTM1
в контрольных
в зависимости
от года
публикации
данных выборках:
слабая, но достоверная
к возрастанию
(206 работ затенденция
период 1986-2008
гг.). за 20 лет
70
R=0,23; P=0,0006
65
Частота GSTM1 0/0
60
???
55
50
45
40
35
30
1985
1990
1995
2000
Год публикации
2005
2010
Генетика радиочувствительности человека: сопряженность
соматической мутабильности с полиморфизмом ДНК
Некоторые удивительные итоги
 Удивительно, но частоты спонтанных (in vivo) и
индуцированных (in vitro) аберраций хромосом ассоциированы
с различными группами генов
 Удивительно, но крупные делеции генов детоксикации чаще
сопряжены не с повышенным, а с пониженным уровнем
цитогенетических нарушений
 Удивительно, но большинство SNP, в том числе связанные с
репарацией ДНК, слабо коррелируют с радиочувствительностью
хромосом
0.15
0.1
0.05
Может быть мы изучаем не те полиморфизмы?
0
0/0 +
GSTM1
0/0 +
GSTT1
A/A A/G G/G A/A A/G A/A G/A G/G A/A G/A G/G C/C C/T T/T
GSTP1
CYP1A
CYP2D
NAT2
MTHFR
0.22
Аберрации, индуцированные 1 Гр:
GSTM1 0/0 = GSTM1 +
(с точностью до 3-го знака)
Лишь слабая корреляция с общим
числом минорных аллелей в локусах
GSTP1, MTHFR и NAT2
Частота индуцированных аберраций
Частота аберраций при 1 Гр
Частоты индуцированных аберраций хромосом для
Разительных
или хотя бы достоверных
обнаружено!
«однолокусных»
генотиповотличий
(1 Гр inне
vitro)
0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0
1
2
3
Число локусов с минорными аллелями
Высокополиморфные
локусы репарации,
влияющие на
Все приведенные эффекты
на грани значимости
изменчивость
у человека
(с поправкойрадиочувствительности
Бонферрони вовсе незначимы)
Частота
…и еще
больше
работ
Локус
Кодон
минорного
аллеля
Радиочувствительность
с отсутствием
достоверных эффектов
Источник
генотипа
XPD
312
0.29
 20% ХА после УФ
Au, 2003
XPD
751
0.31
 22% ХА после УФ
 разрывы ДНК
Au, 2003
Naccarati, 2005
XRCC1
194
0.17
 15% ХА после УФ
спонтанных МЯ
Au, 2003
Aka, 2004
XRCC1
280
0.25
 разрывы ДНК в 3 раза
Jiang, 2006
XRCC2
399
0.37
 20% ХА после 1 Гр
Au, 2003
XRCC3
APE1
0.36
Похоже,
это –общее
20% ХА правило:
после 1 Гр
Au, 2003
241
(избыток
 18% МЯ после малых
доз
Angelini, 2004
сильныегетерозигот)
эффекты в ассоциативных
исследованиях
полиморфизма
ДНК никогда не воспроизводятся
0.24
148
(избыток
гетерозигот)
 15% ХА после 1 Гр
Au, 2003
Итоги
10 лет
GWA-исследований
Human genetic
variation
and
its contribution to complex traits
K. Frazer, S. Murray et al. Nature (April 2009)
 Из нескольких тысяч обычно удается выявить 5-10 SNP, слабо
ассоциированных с данным заболеванием (OR=1,11,2)
 Выявленные SNP ассоциированы сразу с несколькими
совершенно различными заболеваниями (признаками)
GWA (Genome-Wide Association):
ассоциативные исследования с использованием микрочипов.
Генотипирование по > 100 000 SNP
Human genetic variation and its contribution to complex traits
K. Frazer, S. Murray et al. Nature (April 2009)
 Из нескольких тысяч обычно удается выявить 5-10 SNP, слабо
ассоциированных с данным заболеванием (OR=1,11,2)
 Выявленные SNP ассоциированы сразу с несколькими
совершенно различными заболеваниями (признаками)
Куда подевалась остальная изменчивость,
 Влияние
выявленных
SNP
трудно объяснить,типа
прослеживая
и что
мы ловим
в исследованиях
GWAS?
биохимические и метаболические цепочки
 При анализе выборок из других популяций (особенно при смене
этноса) во многих случаях выявленные SNP теряют
ассоциативность
 Пока за счет SNP-изменчивости удается объяснить не более 30%
наследуемой изменчивости количественных признаков
Виды генетического полиморфизма
 SNP – Single Nucleotide Polymorphism - однонуклеотидные
замены оснований в ДНК
 STR, VNTR – изменчивость числа коротких повторов
(мини- и микросателлиты). Нейтральная изменчивость в
некодирующей части ДНК.
 Делеционный полиморфизм – в локусе может быть вырезана
длинная последовательность нуклеотидов. Тогда в популяции
встречаются 2 вида аллелей: функциональный и делетированный.
Гомозигота по делеции не синтезирует соответствующий белок.
Делеционный полиморфизм
 Дупликации
– в популяции
генов GSTM1
и GSTT1 – встречаются хромосомы с
несколькими копиями одного гена
это тоже CNV !
 CNV – copy number variations (> 1 кб)
 CNV+инверсии – Structural Variation (SV)
2006-2009: открытие масштабов
CNV-изменчивости
Прорыв года
Как регистрируют CNV ?
Микрочипы,
с нанесенными
Тестовая и контрольная
ДНК
aCGH - array-based Comparative
Genome
конкурируют
за Hybridization
гибридизацию
ДНК-фрагментами
(120-180 Кб),с
ДНК-фрагментами
на
покрывающими
весь геном
микрочипе
Если участок в тестовой ДНК
дуплицирован, то наблюдается
Тестовая и контрольная
импульс ДНК
красного цвета
метятся разными красителямм
Количественный сигнал, полученный после
компьютерного анализа изображений
Хр 17
Хромосомная локализация 1447 участков CNV
Частота полиморфных
вариантов CNV
в логарифмическом масштабе
Размер зоны CNV
от 10 кб до 1 Мб
в логарифмическом масштабе
Дупликации одинаковых
последовательностей
Дупликации с изменением
последовательности (копии
совпадают на 90%)
CNV: ключевые цитаты
( 30 работ из Nature, Science, PNAS et al., 2007-2009)
 CNV затрагивают около 3000 действующих генов и 15% из 3 Гб
генома (SNP только 0,3%). Для 800 CNV полиморфизм превышает 3%
 За счет делеционного полиморфизма два человека могут отличаться по
длине генома на 20 Мб

Список 18684 полиморфных CNV
2006 - сдва
человека в среднем
отличаются
копий 70 генов.
частотами
и генами
в зоне по
ихчислу
влияния
 2009 - два человека в среднем отличаются по числу копий в 250
локусах со средним размером копии 20 кб
http://projects.tcag.ca/variation/
 Мы отличаемся друг от друга в большей степени структурными
вариациями генома, чем нуклеотидным составом: 4 - 24 Mб за счет CNV и
лишь 2,5 Mб за счет SNP
 Из 3654 CNV из них 544 перекрывали действующие гены (2009)
 В выборке 2500 человек: 5-10% имеют CNV свыше 500 Кб и лишь 12% свыше 1Мб (2009)
Возможно CNV, а не SNP является главной
причиной генетического и фенотипического
разнообразия
 Делеции GST 15 лет лидируют по количеству значимых
результатов в ассоциативных исследованиях
 Устойчивость к HIV/AIDS сильно коррелирует с числом копий
гена CCL3L1 (chemokine (C-C motif) ligand 3-like 1, 17q21.1)
 Спорадические CNV, возникающие de novo, сильно
ассоциированы с аутизмом и шизофренией
 CNV регулярно и в больших количествах обнаруживаются в
клетках различных раковых опухолей
 У мужчин длина Y-хромосомы сильно коррелирует с
предрасположенностью к криминальному образу жизни
 Главное отличие человека от шимпанзе на уровне генома –
большое количество дупликаций
Выводы?
С этим лучше не спешить! Будем говорить о подозрениях:
 Похоже, широко распространенные SNP не вызывают
существенных изменений радиочувствительности хромосом и
организма в целом
 Похоже, во многом изменчивость радиочувствительности
связана с полиморфизмом структурных вариаций генома, которые
вызывают изменения неспецифической устойчивости
 Похоже, существуют селективные факторы, поддерживающие
полиморфизм структурной изменчивости генома на исключительно
высоком уровне
Спасибо
Оргкомитету школы
и всем присутствующим !!!
Копию презентации можно скачать на сайте ИОГен
www.vigg.ru