Молекулярный контроль биосинтеза бета
реклама
Молекулярный контроль биосинтеза бета-лактамных антибиотиков» Некоторые этапы исследования и индустрии бета-лактамных антибиотиков 1929 Открытие пенициллина 1941-1943 Разработка технологий ферментации P.chrysogenum 1945, 1955 Открытие цефалоспорина 1987-1991 Первые работы по генетической инженерии P.chrysogenum, A.chrysogenum 1945 Нобелевская премия по медицине Флеминг, Флори, Чейн 1964 Нобелевская премия по химии, Дороти Ходжкин 2001 Промышленное производство 7-АДЦК с помощью рекомбинантного штамма P.chrysogenum 1960-1980-ые Селекция промышленных штаммов – продуцентов 2008 Расшифрован геном P.chrysogenum Индустрия бета-лактамных антибиотиков сегодня Крупнейший сектор мировой биотехнологической промышленности Объем рынка ~US$ 10 млрд, ~ 50 % мирового рынка антибиотиков. Основное производство – Европа, Китай, Корея, Индия.. Рынок пенициллинов – 3,5 млрд долларов, мировое производство – 35 000 тонн. Основные компании – производители: DSM (Нидерланды), BristolMyers-Squibb (США), Glaxo-Smith Kline (США), Biochimie/Hoechst (Германия), North-China Pharma Works (Китай) Рынок цефалоспоринов – 7 млрд долларов, мировое производство – цефалоспорин С – 4300 тонн, 7-АЦК ~ 2200 тонн, 7-АДЦК ~ 2000 тонн. Основные компании – производители: Antibioticos SpA (Италия, Испания), Fujisawa (Япония), Bristol-Myers-Squibb (США), Glaxo-Wellcome (Великобритания), Biochimie/Hoechst (Германия), Cheil Jedang (Корея) Классификация бета-лактамных антибиотиков Группа Парентеральные Пероральные Пенициллины Чувствительные к b-лактамазам Ампициллин, Карбенициллин, тикарциллин, мезлоциллин, азлоциллин, пиперациллин, Бензилпенициллин Амоксициллин, ампициллин, Кариндациллин, Феноксиметилпенициллин Устойчивые к b-лактамазам Метициллин, оксациллин, нафциллин Клоксациллин, диклоксациллин Комбинированные препараты, включающие ингибитор b-лактамаз Тикарциллин/клавуланат, ампициллин/сульбактам, пиперациллин/тазобактам Амоксициллин/клавуланат Цефазолин, цефалотин, цефапирин Цефалексин, цефрадин, цефадроксил Цефалоспорины Первого поколения Второго поколения Третьего поколения Четвертого поколения Карбапенемы Монобактамы Цефамандол, цефуроксим, цефоницид, цефоранид, Цефокситин, цефотетан, цефметазол Цефтриаксон, цефотаксим, цефтизоксим, Цефтазидим, цефоперазон Цефепим, Цефквином Имипенем/циластатин Азтреонам Цефаклор, цефуроксим аксетил, цефиксима, цефпрозил, цефподоксима, лоракарбеф Нет Нет Нет Нет Этапы селекции промышленных штаммов P.chrysogenum и A.chrysogenum 100-300 mg/ml ATCC11550 М-8650 СВ-344 CK-101 2-5 mg/ml CW-19, C-10 ЦБИ-104 P.chrysogenum 84-3-87 (SIPI, CN) KFCC10785 CJCorp, KR А3,2, А7, B, C (Antibioticos) А.chrysogenum 20-35 mg/ml «До-геномные» представления о генетических и биохимических изменениях у промышленных штаммов P.chrysogenum У супепродуцентов тандемно амплифицирован кластер генов биосинтеза пенициллина pcbAB, pcbC and penDE, хотя нет линейной зависимости между числом копий и уровнем продукции. У суперпродуцентов более развиты микротельца - компартменты биосинтеза penG У суперпродуцентов инактивирован путь катаболизма фенилуксусной кислоты - экзогенного предшественника, боковой цепи бензилпепнициллина – точковая мутация в гене микросомального цитохрома P450 (pahA ) Геном Penicillium chrysogenum Транскриптомика P. chrysogenum Поиск с помощью микрочипов дифференциально-транскрибируемых генов у двух штаммов: Wis 54-1255 – умеренный, лабораторный продуцент, расшифрован геном DS17690 - промышленный продуцент, в условиях продукции penG. Функциональные категории генов 1. Рост и метаболизм Число генов с экспрессией DS17690> Wis54-1255 Число генов с экспрессией DS17690 < Wis54-1255 106 75 6 1 13 4 4. Пероксисомальные 2 4 5. Метаболизм бета-лактамов 4 2 2. От предшественников к penG 3. Секреция penG 6. Метаболизм фенилуксусной кислоты 6 7. Клеточная дифференцировка и морфология 14 8. Другие 156 Всего 307 0 11 174 271 Протеомика P. chrysogenum Сравнение цитозольных протеомов трех штаммов Penicillium chrysogenum NRRL 1951 – дикий тип, Wis 54-1255 – умеренный, лабораторный продуцент, расшифрован геном, AS-P-78 - промышленный продуцент Идентифицированы 950 белков, дифференциально представленных у трех штаммов в условиях вегетативного роста Jami MS, Barreiro C, García-Estrada C, Martín JF. Proteome analysis of the penicillin producer Penicillium chrysogenum: Characterization of protein changes during the industrial strain improvement. Mol Cell Proteomics. 2010 Изменения метаболизма P.chrysogenum по данным сравнительного протеомного анализа Прогрессивно усилены у умеренного продуцента и промышленного штамма: Биосинтез цистеина – аминокислота-предшественник пенициллина, Биосинтез NADPH – необходим для синтеза пенициллина, 10 молей NADPH на 1 моль пенициллина Уровень ферментов энергетического обмена – цикл трикарбоновых кислот, пентозофосфатный путь. Ответ на окислительный стресс – адаптация к условиям ферментации. Прогрессивно снижены по сравнению со штаммом дикого типа: Факторы вирулентности, белки деградации клеточных стенок, ферменты деградации пенициллина, Ферменты биосинтеза других вторичных метаболитов – терпеноидов, порфиринов, пигментов Без изменения: Путь деградации фенилуксусной кислоты, альтернативные пути биосинтеза бета-лактамов – мишени для дальнейшего манипулирования. Итоги сравнительного транскриптомного и протеомного анализа P.chrysogenum Penicillium chrysogenum – отличная модель для понимания глобальных изменений метаболизма, генной экспрессии, сигнальных путей, приводящих к усилению продукции целевого вторичного метаболита у грибов Усиление продукции пенициллина в ходе селекционных программ по улучшению промышленных штаммов – следствие интенсивной реорганизации метаболизма, основными факторами при этом являются энергетическая нагрузка, редокс метаболизм и доступность предшественников Помимо цитозольных белков важно идентифицировать и исследовать также мембранные транспортеры, обеспечивающие импорт предшественников и экспорт целевых продуктов. «Обратная генетика» P.chrysogenum A.chrysogenum – нокдауны и нокауты У A.chrysogenum и P.chrysogenum есть функционально-активная система РНКинтерференции – экспериментально показано на модели сайленсинга гетерологичного DsRed Геном P.chrysogenum - есть ортологи Dicer и Argonaute На P. chrysogenum проведен нокдаун белка ku70 (фактор негомологичной рекомбинации) – на порядок возросла эффективность гомологичной рекомбинации В полученном штамме P2: KU70i проведен нокаут гена Pcdcl2 – гомолог Dicer’ – нет сайленсинга при нормальной внешней морфологии штамма. Индуцируемый нокдаун гетерологичного гена DsRed на P.chrysogenum Цефалоспорин С – основной предшественник для получения полусинтетических беталактамных антибиотиков • Мировое производство (2008 год) – • 6000 тонн цефС и его производных • >50 наименований полусинтетических цефалоспоринов I-IV поколений • Мировой рынок – 7 млрд $ Acremonium chrysogenum – продуцент цефалоспорина С ATCC11550 – «дикий тип» , Бротцу, Сардиния, 1942 год №26/8 – суперпродуцент цефС, Бартошевич, 1994 г. Стратегии метаболической инженерии для A.chrysogenum Основаны на знании основного пути биосинтеза цефС Оптимизация «узких мест» биосинтеза Синтез предшественников, кофакторов Блокирование побочных реакций и путей деградации Улучшение физиологии и энергетического обмена Транспорт предшественников и конечных продуктов Инженерия ферментов – есть пространственные структуры всех ферментов биосинтеза цефС Инженерия новых метаболических путей и новых продуктов Промышленные штаммы Acremonium chrysogenum уступают в 2-3 раза по продуктивности промышленным штаммам Penicillium chrysogenum, Нет амплификации кластера генов биостнтеза цефС, следовательно, вместо долгой селекции….. ….можно попробовать повысить продукцию цефС за счет оверэкспрессии одного или нескольких генов… Ген Штамм Эффекты Год Фирма cefEF ATCC11550 («дикий тип») +15% CPC 1989 Elli Lilly cefG C10 (умеренный продуцент) +120%-210%CPC 1997 University of Leon cefD1+cefD2 C10 +80% CPC 2004 University of Leon cefT C10 +120% CPC 2002 University of Leon cefT DS49834 (пром) +70% ad7-accca 2008 DSM, University Groningen cefG+pcbAB +pcbC+cefEF B,C (промышленные) +X% CPC??? -8% DAC,DAOC 2004 Antibioticos cefG 84-3-87 (пром) +70% CPC 2010 Shanghai IPI cefG+vgb 84-3-87 (пром) +90% CPC 2010 Shanghai IPI pacCD Wis54 +300% PenG 2004 DSM pacCD DS49834/cefT? (пром) +X% ad7-accca????, рост на сахарозе 2008 DSM Экологически-чистые способы получения 7- аминодезацетоксицефалоспорановой к-ты с помощью рекомбинантных штаммов A.сhrysogenum и P.chrysogenum DSM=> <=Antibioticos 7-АДЦК 7-АЦК ~2000 т в год ~2200 т в год Предшественник для получения полусинтетических цефалоспоринов орального применения Предшественник для получения большинства полусинтетических цефалоспоринов 150 $/кг 120 $/кг Биосинтез пенициллинов и цефалоспоринов DAOC синтетаза (cefEF) IPN эпимераза (cefD1, cefD2, ) ACV синтетаза (acvA/pcbAB) DAOC синтетаза (cefEF) IPN синтаза (ipnA/pcbC) DAC ацетилтрансфераза (cefG) IPN ацилтрансфераза (aatA/penDE) Пенициллин G, V, DF, F, K Транскрипционный контроль биосинтеза бета-лактамов у грибов Модель активации РасС сигнал об изменении рН среды цитоплазма каскад усиления Раl белков ядро транспорт через ядерную пору автопротеолиз автоактивация ген расСу («открытая» конформация) автопротеолиз сигнальный протелоиз (процессированная форма) («закрытая» конформация) транскрипция трансляция M. A. Penalva, 2002 Строение белков семейства РасС сайт процессинга NH2 сайт сигнальный протеазы COOH ДНК-связывающий домен конформационный домен 1 Cys2His2 цинковый палец (сайт узнавания GCCARG) конформационный домен 2 активирующий домен конформационный домен 3 11550 №26/8 коричневый, желтый кремовый Рост при 280С (полная пластинчатая среда), дни 5-7 12-14 Размер колоний (полная пластинчатая среда), см 5-10 4-8 Наличие воздушного мицелия (полная пл. среда) + - нормальное редуцированное мицелий, конидии артроспоры 200-250 9000+ Цвет колоний (полная пластинчатая среда) Образование конидий на синтетической среде Основная морфологическая форма при глубинном культивировании на среде для ферментации, 72ч Продукция цефалоспорина С, мкг/мл 11550, ферментация 72h №26/8, ферментация 72h мицелий артроспоры кодиниоспоры 10 мкм прорастающий мицелий 10 мкм A B C D E F Сканирующая электронная микроскопия клеток штамма A.chrysogenum АТСС11550 Сканирующая электронная микроскопия клеток штамма A.chrysogenum №26.8 Подбор условий для эффективного протопластирования штаммов A. chrysogenum штамм 11500 26/8 ++++ +++ ++ + - фермент время протопластирования перед ДТТ 0 часов 1 часов 2 часа 3 часа Zym 1 мг/ мл Lyt 3 мг/ мл ++++ +++ +++ +++ ++ Zym 2.75 мг/ мл Lyt 3 мг/ мл ++++ +++ +++ +++ ++ Zym 0.55 мг/ мл Lyt 10 мг/ мл ++++ +++ +++ +++ ++ Zym 2.75 мг/ мл Lyt 10 мг/ мл ++++ +++ ++ ++ + Zym 2.75 мг/ мл Lyt 3 мг/ мл ++++ +++ +++ ++ + Zym 0.55 мг/ мл Lyt 10 мг/ мл ++++ +++ +++ ++ + Zym 2.75 мг/ мл Lyt 10 мг/ мл ++++ +++ + - - типичный мицелий (для данного штамма A. chrysogenum) начальная деградация мицелия, частичная сегментация и утончение гиф сильная деградация мицелия, утонченные гифы очень сильная деградация мицелия (на 85-90 %), практически нет оформленных гиф полная деградация мицелия использовано в дальнейшей работе Агробактериальная трансформация Растения Клетки млекопитающих Грибы (Saccharomyces cerevisiae, Magnaporthe grisea, Fusarium oxysporum, Aspergillus awamori, Calonectria morganii, Acremonium chrysogenum …) 10 мкм A.tumefaciens AGL0 c кассетой для переноса pZEM5 Прорастающий мицелий A.chrysogenum №26/8 Экспрессионные вектора для A.chrysogenum Схема эксперимента по агробактериальной трансформации A.chrysogenum Создание векторной системы для переноса в Agrobacterium tumefaciens Трансформация полученных конструкций в Agrobacterium tumefaciens Выбор морфологической формы A.chrysogenum для АТМТ Получение конидий для A.сhrysogenum АТСС11550 Подготовка препаратов мицелия Для A.chrysogenum № 26/8 Инкубация A.chrysogenum с Agrobacterium tumefaciens Глубинное ко-культивирование Культивирование на агаризованной среде с фильтрами Инактивация Agrobacterium tumefaciens Отбор трансформантов, скрининг Частоты агробактериальной трансформации A.chrysogenum ZeocinTM G418 Штамм A.chrysogenum Метод 1 11550 №26/8 11550 №26/8 2-5 * 102 1-2 * 101 6-8 * 101 - 1-3 * 103 5-7 * 101 3-5 * 102 - Перенос колоний на фильтрах Метод 2 Глубинное культивирование Анализ трансформантов Стратегии создания рекомбинантных штаммов A.chrysogenum c улучшенными характеристиками • Введение дополнительных копий биосинтетических генов • Усиление транспорта цефС из клетки • Оптимизация транскрипции генов биосинтеза • Усиление импорта предшественников биосинтеза цефС Транспорт цефС в A.chrysogenum «ранние» гены cefT «поздние» гены Модель пространственной организации cefM и сefT cefT Вектора экспрессии cefT МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ S Маннопротеины 40% GPI якоря S 1-3 глюкан Трансмембранные белки 50% 1-6 глюкан 8% Хитин 2% Белки КС A.chrysogenum ATCC11550 24 ч 48 ч 120 ч 24 ч 48 ч 120 ч #26/8 ATCC11550 #26/8 24 ч 48 ч 120 ч 24 ч 48 ч 120 ч 24 ч SEP- белки 48 ч 120 ч 24 ч 48 ч 120 ч GPI-белки Структурные изменения КС у штамма A.chrysogenum суперпродуцента цефС связаны с резким снижением количества ферментов, участвующих в поддержании ее структуры, отсутствием фракции белков, ковалентно- связанных с полисахаридным матриксом КС. Морфология и структура КС штаммов A.chrysogenum Чувствительность препаратов КС к действию гидролаз и детергентов. Электронная микроскопия клеточных стенок штамма АТСС11150 A. chrysogenum (А, Б, В) и клеточных стенок штамма 26/8 A. chrysogenum (Г, Д, Е, Ж, З). – на разных стадиях роста. Различия в морфологии и структуре клеточных стенок штаммов ATCC11550 и №26/8. затрагивают молекулярную организацию КС и в значительной степени зависят от условий культивирования штаммов Неорганические полифосфаты - источник энергии при синтезе цефС Падение уровня АТФ в штамме 26\8 в условиях индукции синтеза цефС Снижение содержания высокомолекулярных фракций полиР2, полиР3 и полиР5 и возрастание содержания низкомолекулярной полиР1 при синтезе цефС у A.chrysogenum. Дифференциальная экспрессия Н+АТРазы плазмалеммы у разных штаммов A.chrysogenum 60 ATPase nmol/mkg/min 70,00 50 40 30 20 60,00 58,22 58,81 50,79 50,00 46,67 40,00 №26/8 11550 30,00 20,00 10,00 1,43 10 1,43 1,30 2,35 0,00 24 0 48 72 96 120 144 Динамика изменения активности Н+-АТФазы в штаммах 26/8 (1,2) и АТСС 11550 (3,4) при выращивании на крахмале (1,3) и на глюкозе (2,4) 48 72 96 часы Различия в уровнях активности Н+АТФазы в штамме 26/8 и АТСС 11550 Штамм A.chrysogenum №ЦБИ-104 – суперпродуцент цефС Графическая модель биосинтеза цефалоспорина С в аппарате вместимостью 10 л углеводы, г/л биомасса,%об. рНх10 рО2 35 цефалоспорин С,мг/мл 100 120 30 100 25 70 80 60 50 60 40 40 30 Выход цефС, г/л углеводы,биомасса, рН,а, 80 РО2, цефалоспорин С С 90 20 15 10 5 20 20 10 0 0 0ч 18 ч 36 ч 54 ч 72 ч время 90 ч 108 ч 0 115 ч №26/8 ЦБИ-104 DSM Штаммы A.chrysogenum CJ Corp
