Стехиометрия

В основе функционирования многих белков (рецепторов) лежит их способность к
избирательному и специфическому взаимодействию с другими веществами —
лигандами. Лигандом может быть как низкомолекулярное вещество, так и
макромолекула, в том числе другой белок. Лиганд присоединяется к
определенному участку на поверхности белковой молекулы — сайту (центру)
связывания .
Взаимодействие лиганда с этими сайтами можно охарактеризовать следующими
параметрами (параметрами связывания):
• константа связывания (или аффинность взаимодействия, сродство –
прочность связывания реагирующих веществ)
• число мест связывания (или стехиометрия связывания – количественное
соотношение реагирующих веществ).
В случае, когда лиганд обладает одинаковым сродством ко всем сайтам
связывания рецептора, можно говорить о существовании одной моды
связывания. Если связывание лиганда с различными сайтами характеризуется
различными значениями параметров связывания – существует несколько мод
связывания.
Раствор лигада с рецептором всегда представляет собой равновесную систему
свободного и связанного с рецептором лиганда. В случае существования одной
моды связывания, константа связывания (Kb) может быт представлена
следующим образом:
Cb
Kb 
nC p  Cb  C f
• Cf и Cb – концентрация свободного и связанного с рецептором лиганда,
соответственно,
• Сp – концентрация рецептора,
• n – число мест связывания в пересчете на молекулу рецептора,
• nCp – концентрация мест связывания.
Простым и удобным подходом для определения концентраций свободного и
связанного с рецептором лиганда, необходимых для расчета параметров
связывания, является абсорбционная спектроскопия (измерение спектров
поглощения) растворов, полученных методом равновесного микродиализа.
Приспособление для проведения равновесного микродиализа фирмы Harvard
Apparatus (Amika, USA).
мембрана
Приспособление проведения для
равновесного микродиализа состоит из
двух камер равного объема, разделенных
мембраной. Размер пор мембраны
выбирается таким образом, чтобы через
них свободно проходил лиганд и не
проходил рецептор.
Камеры №1 и №2
Раствор лиганда c известной
концентрацией (С0) помещается в одну
из камер, а раствор рецептора с
известной концентрацией (Cp) – в
другую камеру в том же объеме.
Диффузия лиганда через мембрану будет
продолжаться до тех пор, пока не будет
достигнуто равновесие, при котором
концентрация свободного лиганда в двух
камерах станет одинаковой. Однако, в
камере
с
рецептором
суммарная
концентрация лиганда будет выше, так как
часть его связана с рецептором.
С использованием полученных растворов могут быть
поглощения свободного и связанного с рецептором лиганда.
раствор образца и
раствор сравнения
линза
источник
света
призма
щели
детектор
определены
спектры
С использованием значений измеренной оптической плотности раствора в
камере со свободным лигандом (Df), его коэффициента молярной экстинкции (εf)
и длины оптического пути (l) можно определить концентрацию свободного
лиганда:
Cf 
Df
 f l
Поскольку концентрация свободного лиганда в обеих камерах одинакова и
равна Cf, концентрация связанного с рецептором лиганда может быть
определена из уравнения:
C b  C 0  2C f
Для того, чтобы определить параметры связывания лиганда с рецептором,
необходимо иметь информацию о числе мод связывания лиганда с рецептором
Наглядное представление о числе мод связывания дает построение зависимостей
Скетчарда:
 Cb

C
 p


 C f  nK b  K b  C b

C

 p




тиофлавин Т +
ацетилхолинэстераза
-3
-1
(Cb/Cp)/Cf .10 , M
12
8
4
0
0.0
(Cb/Cp)/Ñf.10-5, M-1
Линейность экспериментальных зависимостей свидетельствует о том, что все
центры связывания лиганда идентичны, т.е. существует одна мода связывания.
Нелинейный характер зависимостей Скетчарда свидетельствует о наличии как
минимум двух мод связывания лиганда с рецептором.
1.2
тиофлавин Т +
амилоидные фибриллы
0.9
0.6
0.3
0.0
0.1
0.2
0.3
Cb/Cp
0.4
0.5
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
Cb/Cp
Зависимости Скетчарда, характеризующие связывание лиганда – специфического красителя
тиофлавина Т с рецептором – ферментом ацетилхолинэстеразой (1 мода связывания) и
упорядоченными белковыми агрегатами амилоидными фибриллами (2 моды связывания) .
Число мест связывания лиганда в пересчете на молекулу рецептора и
константы связывания лиганда с рецептором могут быть определены с
использованием значений Cb и Cf, полученных при многократном проведении
равновесного микродиализа с различными С0, с помощью уравнений:
Cb 
nC p C f K b
1  C f Kb
Cb  
i
ni C p C f K bi
1  C f K bi
в случае одной моды связывания
в случае двух и более мод связывания
Расчет может быть проведен методом множественной нелинейной регрессии
с использованием программного обеспечения (например, GrapfPad, Sigma
Plot).
Правильное определение параметров связывания весьма актуально для
фундаментальных исследований (при изучении взаимодействия и
функционирования различных веществ), а также может иметь
существенное значение для решения прикладных задач (в медицине,
фармакологии и т.д.). В частности, информация об аффинности и
стехиометрии связывания белковых рецепторов с лигандами может быть
востребована при разработке и тестировании лекарственных средств.