Иммунологические методы диагностики туберкулезной

Методы. Возможности. Пути развития.
Перспективы
М.А.Владимирский (НИИ
фтизиопульмонологии)






Определение первичного
туберкулезного инфицирования у
детей и подростков.
Определение туберкулезной
этиологии экссудативного плеврита
Отечественная тест-система
«Тубинферон»
Оценка активности туберкулезной
инфекции
Дифференциальная диагностика
туберкулеза
Мониторинг специфического
иммунного ответа в процессе
лечения
Инкубация
образцов
цельной
гепаринизированной крови 22-24 ч. в 3-х
стерильных
пробирках
по
1
мл:
отрицательный контроль - без антигена;
митоген или туберкулин PPD (положительный
контроль)
и
пробирка
специфических
антигеновсмесь рекомбинантных антигенов
ESAT-6 и CFP-10
 Измерение
концентраций
исследуемых
цитокинов (ИФН-γ, ФНО-α) и хемокинов в
надосадочной
плазме
с
помощью
количественного иммуноферментного анализа
 Анализ индукции внутриклеточных цитокинов :
проточная цитофлуориметрия






Применение отечественной тест-системы является актуальным,
поскольку импортная тест-система очень дорогостояща, что делает ее
малодоступной для отечественных потребителей.
С целью повышения эффективности отечественной тест-системы в
качестве антиген-специфического индуктора интерферона-гамма in vitro
использован существенно более очищенный генно-инженерный слитный
белок, состоящий из специфических пептидов ESAT-6-CFP-10
Был установлен новый пороговый критерий определения
положительного результата исследования: уровень антигениндуцированного интерферона-гамма – 14 пг/мл
Этот пороговый уровень соответствует пороговому уровню в 0,35 ME,
который используется в системе QuantiFeronTB
В сравнительном испытании исследовали одновременно по двум тестсистемам образцы крови 100 пациентов : 37 из консультативного приема
и 63 – пациентов стационара детско-подросткового отделения клиники
НИИ фтизиопульмонологии




Из 37-х амбулаторно обследованных пациентов случаев
активной туберкулезной инфекции не было обнаружено.
При использовании каждой из сравниваемых тест-систем
было получено по 14 совпадающих положительных
результатов 31 отрицательных совпадающих результатов.
Однако по 2-м положительных и 2-м отрицательным
результатам в обоих тест-системах были противоположными.
При этом все эти 4 пациента были инфицированными судя по
данным двух кожных тестов (р.Манту и Диаскин-тест).
В 5 случаях при положительных результатах в обоих инвитровых тестах и 2-х положительных кожных пробах при
компьютерной томографии грудной клетки были выявлены
кальцинаты без признаков активности туберкулезной
инфекции
В 3-х случаях положительных по 2-м кожным тестам без
признаков патологии легких при анализе крови ин витро
были отрицательными по обоим тестам



Из исследованных стационарных больных при использовании
тест-систем «Тубинферон» (IFN-) и QuantiFeron (Q) для
анализов крови ин витро в каждой тест-системе совпадающие
положительные результаты были отмечены в 27 случаях.
Совпадающие отрицательные результаты – в 29 случаях
Однако, по 4 случая были положительными в Квантифероновом
тесте при отрицательных по «Тубинферону» и наоборот 2 случая
были положительными при использовании «Тубинферона» при
отрицательных результатах с использовванием Квантиферона.
Это различия были в 4-х случаях у больных с с
генерализованным туберкулезным процессом и в 2-х случаях у
пациентов с первичным туберкулезным комплексом
(ПТК)
неясной активности.
Среди отрицательных результатов, совпадающих по обоим
тестам ин витро в
2-х случаях были пациенты с
генерализованным туберкулезным процессом, в том числе 1 – с
туберкулезным менингитом; 1 – туберкулез + ВИЧ –инфекция, 2при постуберкулезных изменениях , а также очаговый туберкулез
после
проведенного
курса
химиотерапии;
1
случай
микобактериоза, неспецифические: ревматоидный артрит, а
также пациенты с неспецифическими заболеваниями дыхательной
системы.






Сравнительные показатели уровней индукции интерферона-гамма в
обоих тестах коррелируют при высоких уровнях ответа.
В целом, обе тест-системы показывают одинаковую эффективность
в определении туберкулезной инфекции, как латентной , так и
активной.
При наличии больших и генерализованных процессах
иммунологические исследования при использовании обоих тестсистем нередко дают отрицательные результаты
По литературным данным результаты исследований образцов крови
в разных лабораториях с использованием QuantiFeron.TB дают около
10 % разночтений за счет отсутствия серой зоны.
Определение активности туберкулезной инфекции с помощью обоих
тест-систем невозможно.
Применение тест-системы «Тубинферон» позволяет также
определить туберкулезную этиологию экссудативного плеврита: при
концентрации ИФН-γ в плевральном экссудате выше 50 пг/мл

1. По мнению всех международных специалистов-иммунологов,
занимающихся проблемой диагностики туберкулезной инфекции
ни внутрикожные тесты, ни тесты с исследованиями крови ин
витро не дифференцируют латентную и активную
туберкулезную инфекцию. Эта проблема является одной из
наиболее актуальных в диагностике туберкулеза и может быть
решена в течение 5-10 лет.

2. Перспективные международные работы основаны на
использовании мультипараметрических исследованиях спектра
цитокинов и хемокинов в супернатантах – образцах плазмы
крови после индукции специфическими антигенными пептидами

3. В связи с тем, что в нашей стране вакцинация БЦЖ является
обязательной, реальный уровень инфицированности населения,
если он оценивается по р. Манту, остается в значительной
степени неизвестным.

Об этом свидетельствует работа М.М.Зориной и коллег из
Новосибирского НИИ туберкулеза. Инфицированность
сотрудников , по критерию положительных реакций с
использованием Квантиферона составила около 30% .






N.Pollock et al. 2008, Inf.ControlHosp.Epidemiol. 143 Манту
положит. ( 10 мм) рабочих –медперсонал (группа риска) БЦЖ
вакцинированы, Квантиферон (QFT) – положительных 28%.
H.Stavri et al. , 2010, J. of Clinical Medicine / Румыния. 60 детей с
подтвержденным семейным инфицированием по контакту с
бактериовыделителями и положительным Манту (10 мм)
Квантифероновый тест положительный только у 47%.
G.Alvarez et al. Plos one, (2014). 233 канадских аборигенов
БЦЖ вакцинированных с положит р. Манту, Квантифероновый
тест был положительным только у 50% .
Hsia EC et al. , США, 2012. 781 пациент с ревм. артритом. 119 с Манту положительной пробой , QFT положительных - 71.
Несмотря на широкое применение квантиферонового теста ряд
исследователей предлагает относиться к этому с
осторожностью, возможно, потому, что в нем не используется
весь спектр антигенов МБТ .
Большинство отечественных работ по применению нового
кожного теста ДСТ показывают, что QFT и ДСТ сопоставимы,
однако, сравнительные исследования требуют дополнительного


Некоторые полученные нами данные об отрицательных
результатах в обоих тестах, основанных на антигениндуцированной продукции интерферона-гамма, как и ,
очевидно, кожного теста ДСТ
при конверсии
туберкулиновых проб у детей из контактных
по
туберкулезу
семей,
заставляют
нас
сделать
предположение о необходимости расширить спектр
применяемых
специфических
рекомбинантных
антигенов для оценки туберкулезного инфицирования в
тестах как ин витро, так и, возможно, кожных проб.
Такие дополнительные антигены уже получены и новые
комплексы
специфических антигенов требуют
исследования
 По результатам пробы Манту мы не можем судить об уровне



инфицированности всего населения или с абсолютной
точностью в группах риска.
Можем ли мы сейчас полностью заменить р.Манту на
Квантифероновый или Диаскин-тест для диагностики
туберкулезной инфекции? Пока не можем.
Для этого нужны широкие и независимые исследования,
включающие эпидемиологию, кожные тесты и тесты
образцов крови ин витро.
В России создана новая генно-инженерная вакцина, которая
содержит спектр специфических антигенов, в том числе уже
известные
специфические
пептиды
(ESAT-6-CFP-10).
Вакцина
рассчитана
на
применение
уже
БЦЖвакцинированных лиц. В 2015 г. проводятся клинические
испытания этой вакцины. Возможно, в
рамках этих
испытаний мы получим
новые знания для понимания
латентной туберкулезной инфекции.
7
6.2
6
5
4
3
нг/мл
3
2
2.2
1.4
1
0
впервые
ранее
активный туберкулёз малые формы в фазе
инфицированные МБТ инфицированные МБТ
легких
уплотнения и
кальцинации
9.1
6.2
2.14
нг/мл
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0.96
АКТИВНЫЙ
ТУБЕРКУЛЁЗ
ТУБЕРКУЛЁЗ
ЛЕГКИХ,
ЗАКОНЧИВШИЕ
ОСНОВНОЙ КУРС
ЛЕЧЕНИЯ
НЕАКТИВНЫЕ
НЕТУБЕРКУЛЁЗНЫЕ
ТУБЕРКУЛЁЗНЫЕ
ЗАБОЛЕВАНИЯ
ИЗМЕНЕНИЯ В
ЛЕГКИХ
ЛЕГКИХ

Образцы цельной крови инкубируют с антигенами
5 часов.

Эритроциты лизируют

Клеточную секрецию цитокинов блокируют

клеточные маркеры и продукты антигенной
индукции определяют с помощью флуоресцентно
меченых моноклональных антител методом
проточной цитофлюорометрии.
1
0,9
0,8
0,7
%
0,6
контроль
0,5
PPD
0,4
ESAT -6
0,3
0,2
0,1
0
1
2
1 - инфицированные МБТ
2 – больные туберкулезом легких
12
10
8
%
контроль
PPD
6
ESAT-6
4
2
0
1
1 – инфицированные МБТ
2 – больные туберкулезом легких
2
•
•
•
1. Анализ нескольких антиген-индуцированных
цитокинов клетками крови ex vivo имеет перспективы
применения для дифференцирования активной и
латентной туберкулезной инфекции, а также для
мониторинга иммунного ответа в процессе лечения
туберкулеза.
2. Перспективным может быть использование
многопараметрического анализа ряда цитокинов и
хемокинов с помощью Bioplex-(Luminex) технологии:
ИФН-, ФНО-α, хемокин – IP-10, IL-6 и IL-10.
3. В целях дифференциальной иммунодиагностики
необходимо углубленное исследование антигениндуцированной экспрессии цитокинов в популяциях
и субпопуляциях клеток крови ex vivo