Влияние возраста пациентов на ангиогенные свойства

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова
Факультет фундаментальной медицины
Влияние возраста пациентов на
ангиогенные свойства
мезенхимальных стволовых клеток
жировой ткани
Докладчик:
Ефименко Анастасия Юрьевна
Москва - 2011
Мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани
(МСК-ЖТ) стимулируют рост кровеносных сосудов
Адипоцит
Сосуды
МСК
Преадипоцит
Жировая ткань
МСК-ЖТ
Продукция
ангиогенных
факторов роста
VEGF, HGF, bFGF,
Angpt1 и др.
Стабилизация
новообразованных
сосудов
МСК-ЖТ
uPA, плазмин,
матриксные
металлопротеиназы
Старение МСК
МСК пожилого
донора
Клеточное
старение
Снижение числа и/или
способности к
самообновлению и
регенеративного
потенциала МСК
Функциональные
нарушения
Укорочение теломер; Апоптоз
↓ теломеразной
активности;
Возраст↑оксидативного стресса;
ассоциированные
↑повреждения ДНК;
заболевания
↑ p16/INK4a, p19/ARF,
р21, p53
Клеточная терапия
МСК молодого
донора
аутологичными
клетками
Генетические и эпигенетические нарушения
El-Ftesi et al., 2009; Zhu et al., 2009; Huang et al., 2010; Madonna et al., 2011
Цель работы - оценить влияние возраста на
ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток
жировой ткани пациентов без кардиологических
заболеваний и больных ишемической болезнью сердца.
Задачи
 Сравнить иммунофенотип, пролиферативную активность и
накопление маркеров старения в МСК-ЖТ пациентов разного
возраста с ишемической болезнью сердца (ИБС) и без нее.
 Оценить содержание ангиогенных факторов (VEGF, PlGF, HGF,
ангиопоэтина-1,
ангиогенина
и
тромбоспондина-1)
в
кондиционированной среде и ангиогенную активность суммарных
продуктов секреции МСК-ЖТ пациентов разного возраста с ИБС и
без нее.
 Проанализировать профиль экспрессии генов, кодирующих
факторы, которые участвуют в регуляции ангиогенеза, в МСК-ЖТ
пациентов разного возраста с ИБС и без нее.
Пациенты
1. Пациенты без ИБС (n=31):
 2-12 лет (n=4, средний возраст 7,3±5,4 лет)
 35-55 лет (n=14, средний возраст 42,3±7,1 года)
 Старше 60 лет (n=13, средний возраст 66,2±6,8
лет)
2. Пациенты с ИБС (n=31):
 44-48 лет (n=6, средний возраст 46,0±1,67 лет)
 52-58 лет (n=10, средний возраст 55,4±1,9 лет)
 Старше 60 лет (n=15, средний возраст 68,9±4,2
лет)
Морфология и иммунофенотип МСК-ЖТ не
различаются у пациентов разного возраста
CD73
CD90
CD105
Пациент К., 2,5 года
PDGFRB
CD73(>85%),
CD90 (>95%),
CD105 (>95%),
CD14 (<10%),
CD34(<5%),
CD45 (<2%),
CD79 (<10%)
PDGFRB (>80%),
NG2 (>95%)
NG2
Маркеры
42-48 лет
Старше 60 лет
CD90
97 (96; 98)%
96 (95; 97)%
CD73
92 (88; 95)%
93 (92; 94)%
CD105
>99%
>99%
PFGFRB
83 (82; 84)%
85 (83; 88)%
NG2
>99%
>99%
Пациент Д., 61 год
С возрастом снижается доля активно
пролиферирующих клеток и длина теломер в МСК-ЖТ
Пациенты без ИБС
r = -0,47, p=0,03
80
70
60
50
40
30
20
10
0
r = -0,6, p=0,006
Возраст пациентов
Возраст пациентов
А
Пациенты с ИБС
0
2
4
6
8
10
12
80
75
70
65
60
55
50
45
40
14
0
2
Относительная длина теломер
8
Относительная длина теломер
Доля
клеток,
поделившихся
Доля клеток,
поделившихся
более 10 раз
за 5раз
днейза 5 дней
более 10
8,0
*
4,0
2,0
0,0
35-55 лет
Старше 60 лет
Median
пациентов
Возраст
пациентов *p=0,07
(25%-75%) Возраст
Относительная длина теломер, отн.ед.
Доля клеток в общей
популяции, %
6
Относительная длина теломер в
МСК-ЖТ пациентов старше 60 лет
r=0,8, p=0,006
6,0
4
14
*
12
10
8
6
4
2
0
Пациенты без ИБС
Пациенты с ИБС
*p=0,01
Ангиогенная активность суммарных продуктов
секреции МСК-ЖТ снижается с возрастом
Пациенты без ИБС
Пациент К.,
2,5 года
Пациентка М.,
71 год
Общая длина трубочек/тыс.
клеток, отн.ед.
200
150
Пациент Г.,
70 лет
r=-0,53, p=0,03
*
150
r=0,49,
p=0,01
*
100
50
0
Median
(25%-75%)
Пациент Н.,
44 года
Корреляция с
длиной теломер
в
200
МСК-ЖТ
r=-0,68, p=0,01
Общая длина
трубочек/тыс.клеток, отн.ед.
Пациенты с ИБС
2-12 лет
35-55 лет
Старше 60 лет
Возраст пациентов
*p=0,056
100
50
0
44-48 лет
Median
(25%-75%)
52-58 лет
Старше 60 лет
Возраст пациентов
*p=0,041
Общая длина трубочек, отн.ед.
Вклад VEGF в ангиогенную активность суммарных
продуктов секреции МСК-ЖТ снижается в клетках с
укороченными теломерами
120
100
80
60
40
20
0
Median
(25%-75%)
Без
стимуляции
(отриц.
контроль)
VEGF, 50нг/мл
35-55 лет
Старше 60 лет
Кондиционированная
среда от МСК-ЖТ
Без добавления антител
Добавление блокирующих VEGF антител
Корреляция между степенью подавления с помощью
блокирующих VEGF антител (%) и длиной теломер в МСК-ЖТ
r=0,46, p=0,09
Содержание белка в кондиционированной
среде от МСК-ЖТ, нг/млн.клеток
Содержание проангиогенных факторов роста в
кондиционированной среде от МСК-ЖТ снижается с
возрастом: пациенты без ИБС
VEGF
PlGF
70
1,0
60
Ангиогенин
50
0,8
40
14
0,6
30
12
0,4
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
r=-0,42, p=0,02
Ангиопоэтин-1
Корреляция с
ангиогенной
10
8
активностью
6
суммарных
4
продуктов секреции
2
0
0
4,0
3,5
10 r=0,66,
20 30 40p=0,05
50 60 70
r=-0,66, p=0,005
3,0
2,5
0,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
r=-0,59, p=0,01
HGF
80
40
35
30
25
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
0,2
10
20
30
40
50
60
70
80
Корреляция с
длиной теломер в
МСК-ЖТ
r=0,49, p=0,06
r=-0,38, p=0,11
Возраст пациентов
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
r=-0,59, p=0,03
90
Содержание белка в кондиционированной
среде от МСК-ЖТ, нг/млн.клеток
Содержание проангиогенных факторов роста в
кондиционированной среде от МСК-ЖТ снижается с
возрастом: пациенты с ИБС
PlGF
VEGF
1,6
45
1,4
40
Ангиогенин
35
30
1,2
1,0
10
25
0,8
20
0,6
8
15
0,4
10
0
40
45
50
55
60
65
70
75
80
r=-0,37, p=0,09
50
55
60
65
70
75
r=0,79,
r=-0,40,p=0,004
p=0,06
80
45
50
55
60
65
70
75
80
r=-0,59, p=0,004
0
40
Корреляция с
ангиогенной
активностью
суммарных
продуктов секреции
45
0,0
40
4
2
Ангиопоэтин-1
2,8
2,6
2,4
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
40
0,2
6
5
45
50
55
60
65
70
75
HGF
80
70
r=-0,72, p=0,001
60
50
Корреляция с
длиной теломер в
МСК-ЖТ
r=0,71, p=0,001
Возраст пациентов
40
30
20
10
0
40
45
50
55
60
65
70
75
r=-0,44, p=0,07
80
Содержание мРНК генов факторов,
регулирующих ангиогенез, в МСК-ЖТ пациентов
разного возраста
PlGF
9
Пациенты с ИБС
Содержание мРНК, отн.ед.
Содержание мРНК, отн.ед.
Пациенты без ИБС
*
6
3
0
2-12 лет
Median
(25%-75%)
35-55 лет
Возраст пациентов
Старше 60 лет
*p=0,076
9
*
6
3
0
44-48 лет
Median
(25%-75%)
52-58 лет
Возраст пациентов
Старше 60 лет
*p=0,05
HGF
*p=0,1
С возрастом происходит активация системы урокиназы в
МСК-ЖТ, особенно в группе кардиологических больных
Содержание мРНК, отн.ед.
9
uPAR
**
*
6
3
0
44-48 лет
Median
(25%-75%)
52-58 лет
Старше 60 лет
*p=0,02
**p=0,07
Возраст пациентов
21
*
18
15
12
9
6
3
0
44-48 лет
Median
(25%-75%)
PAI-1
Содержание мРНК, отн.ед.
Содержание мРНК, отн.ед.
uPA
5
52-58 лет
Возраст пациентов
r=0,46, p=0,001
*
4
3
2
1
0
44-48 лет
Median
(25%-75%)
52-58 лет
Возраст пациентов
r=0,47,
p=0,001
Старше 60 лет
*p=0,03
Старше 60 лет
*p=0,01
С возрастом происходит активация системы
урокиназы и металлопротеиназ в МСК-ЖТ
Экспрессия uPAR, отн.ед.
Экспрессия uPAR на поверхности МСК-ЖТ увеличивается с возрастом
400
*
200
100
0
Median
(25%-75%)
Пациентка П., 36 лет
Пациентка М., 71 год
*
300
35-45 лет
54-57 лет
Возраст пациентов
Старше 60 лет
*p<0,05
r=0,65, p=0,01
В МСК-ЖТ пожилых пациентов повышается содержание и
активность ММП-2 и ММП-9
А
Б
В
А – пациент К.,
2,5 года
Б – пациент П.,
52 года
В – пациентка Д.,
73 года
Заключение
МСК-ЖТ молодого
пациента
uPA, плазмин,
ММП
МСК-ЖТ пожилого
пациента
Накопление
маркеров
старения
Продукция
ангиогенных
факторов роста
VEGF, PlGF, HGF,
Angpt1, ангиогенина
Гипоксическое
прекондицинирование
Активация системы
uPA, матриксных
металлопротеиназ
Введение генетических
конструкций
Благодарности
Моим соавторам Джояшвили Н.А.,
Старостиной Е.Е.
Моим научным руководителям
Парфеновой Елене Викторовне и
Калининой Наталье Игоревне
Коллективу кафедры биохимии и
молекулярной медицины ФФМ МГУ
имени М.В.Ломоносова
Спасибо за внимание!