Автор: ученица 10 класса Специализированного учебно-научного центра (факультета) – школы-интерната имени А.Н.

Автор: Расчетнова Наталья Игоревна,
ученица 10 класса Специализированного учебно-научного
центра (факультета) – школы-интерната имени А.Н.
Колмогорова Московского государственного
университета имени М.В. Ломоносова.
Руководитель: Астахова Алина Анатольевна, младший
научный сотрудник, МГУ им. М.В. Ломоносова, НИИ ФХБ
им. А.Н. Белозерского, отделение биокинетики.
Место выполнения работы: ФББ МГУ
Актуальность
Рецепторы PPAR являются транскрипционными факторами белками, регулирующими экспрессию целого ряда генов,
участвующих в обмене углеводов и липидов, в
воспалительных и других процессах, протекающих в
организме.
PPARβ
PPAR исследуются как мишени для ряда лекарственных препаратов. В настоящее
время лиганды PPAR используются для лечения гиперлипидемии, диабета 2 типа, их
предлагают как противовоспалительные средства.
PPARβ
Показана эффективность PPARβ в регуляции важных провоспалительных функций в
астроцитах: он стоит на пересечении факторов транскрипции PPARα и PPARγ и
регулирует их эффект на экспрессию провоспалительного агента COX2. А COX2 – это
главная фармакологическая мишень для противовоспалительных средств.
Эндотоксиновая толерантность
Цитокины
ядро
патоген
патоген
Воспалительный процесс в
клетке в состоянии
эндотоксиновой
толерантности
Воспалительный
процесс в наивной
клетке
Литературный обзор
Врожденный иммунитет не может распознавать каждый проникший в организм
антиген, для распознавания чужеродных структур PAMP(Pathogen-associated
molecular patterns) на клеточной мембране организма находятся рецепторы
PRR (Pattern recognition receptors).
TLR4
TLR4 путь
TLR4 рецептор
TLR4 – рецептор липополисахарида (ЛПС).
Как только ЛПС связался через посредников с
рецептором TLR4 происходит инициация
каскада сигналов и сигнал идет через
адапторные белки в ядро. В процессе передачи
сигнала происходит активация факторов
транскрипции, контролирующих экспрессию
генов иммунного ответа.
COX2
Вследствие активации ядерных
рецепторов PPAR начинается экспрессия
еще одного белка-фермента,
являющегося провоспалительным
агентом – Cyclooxygenase (COX).
На этом основано действие многих
медикаментов: они угнетают активацию
COX2 в результате чего подавляется
воспаление, снижается боль. Примером
таких ингибиторов являются аспирин и
ибупрофен.
При воздействии провоспалительного стимула
рецептор TLR 4 запускает активацию фактора
транскрипции PPAR, который запускает синтез
COX 2.
Избыточная активация иммунитета опасна для организма, поэтому
существуют механизмы, препятствующие избыточному синтезу
воспалительных факторов. Одним из таких механизмов является
эндотоксиновая толерантность, при которой клетки не начинают
продуцировать провоспалительные цитокины в ответ на многократное
воздействие провоспалительных стимулов.
Мыши, которые были стимулированы воспалительным агентом ЛПС перед
инсультом, лучше выживают, менее тяжко переносят, быстрее
восстанавливаются.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы является исследовать как изменяется экспрессия
ядерных рецепторов PPARβ в астроцитах, стимулированных
липополисахаридом (ЛПС) в модели клеток эндотоксиновой
толерантности.
Задачи

Проанализировать изменение экспрессии PPARβ в клетках,
подвергнутых длительной стимуляцией ЛПС 10 нг/мл с уровнем,
выявляемом при стимуляции клеток ЛПС 100 нг/мл в течение 4 часов.

Проанализировать изменение экспрессии PPARβ в клетках,
подвергнутых длительной стимуляцией ЛПС 10 нг/мл и последующей
стимуляцией ЛПС 100 нг/мл с уровнем, выявляемом при стимуляции
клеток ЛПС 100 нг/мл в течение 4 часов.
Методы исследования
1) Стимуляция астроцитов
 Наивные клетки
 ЛПС (стимулированные ЛПС на 4 часа)
 ЭТ + ЛПС (стимулированные дважды: на 48
часов, затем на 4 часа)
 ЭТ (стимулированные на 48 часов)
(ЛПС)
2) Выделение РНК
1) добавили лизат к полученному раствору астроцитов для
получения гомогенного раствора. Так как некоторые
клеточные компоненты не растворяются в реагенте, то
раствор центрифугировали и, отбросив нерастворимый
осадок, собрали жидкость.
2) добавили к фильтрату 70% спирта (400 мкл), смешали
пипетированием, центрифугировали. Спирт добавляли
для удаления органических соединений из раствора.
3) внесли в колонку (РНК осаждена на мембране) 500 мкл
промывочного буфера HS для очищения раствора,
центрифугировали.
4) повторили промывку еще раз с 700 мкл промывочного
буфера LS.
5) центрифугировали повторно для полного удаления
спирта, высушивания продукта.
6) добавили 30-80 мкл воды, в результате получили
растворенную в воде РНК и проверили его чистоту на
спектрофотометре.
3) Обратная транскрипция РНК
в пробирки для постановки реакции добавили
растворолиго-дТ (раствор праймеров), выделенную
мРНК и довели водой, тщательно перемешав.
2) инкубировали пробирки в термостате для того, чтобы
произошла денатурация белка; после чего охладили в
ледяной бане, чтобы произошел отжиг праймеров
(праймеры присоединились к цепи РНК).
3) добавили буфера для обратной транскрипции,
раствора обратной транскриптазы и раствора
дезоксинуклеотидтрифосфатов, тщательно
перемешали.
4) инкубировали пробирки в термостате 1 час –
происходила обратная транскрипция.
5) инкубировалив термостате при при повышенной
температуре в течение 10 мин. для денатурации белка
- фермента обратной транскриптазы; после чего
охладили в ледяной бане.
Получили кДНК, готовую к проведению ПЦР.
1)
4)Определение уровни экспрессии PPAR
методом ПЦР в реальном времени.
1)
2)
3)
приготовили реакционную смесь для постановки ПЦР
в реальном времени: буфер, раствор MgCl2, раствор
дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP), раствор
фермента Taq (термоустойчивой) ДНК-полимеразы и
воды.
добавили праймеры. При постановке ПЦР в реальном
времени поставили амплификацию еще одного гена
для сравнения - актина. После добавления праймеров
тщательно перемешали смесь и раскапали по
пробиркам для постановки ПЦР в реальном времени
по 20 мкл. Поставили пробирки с кДНКв
амплификатор.
с помощью флуоресцентного красителя SYBR Green I
отследили амплификаторы. Полученные величины
нормировали на значения экспрессии актина. В
качестве контроля использовали уровни PPARβ,
полученные в наивных астроцитах (из первых лунок),
а также в клетках, стимулированных ЛПС (100 нг/мл)
в течение 4 часов (без предварительной обработки
ЛПС 10 нг/мл в течение 48 часов) - астроциты вторых
лунок.
Результаты
работы
При исследовании изменения экспрессии PPARβ установили, что при
повторной стимуляции воспалительным агентом экспрессия ядерных
рецепторов PPAR возрастает меньше, чем в наивных клетках,
стимулированных этим же воспалительным стимулом.
Выводы
Полученные данные свидетельствуют о том, что индукция
экспрессии PPARβ частично подавляется в условиях модели
эндотоксиновой толерантности в астроцитах крыс. Данные
результаты согласуются с результатами исследований
изменения индукции экспрессии других провоспалительных
медиаторов (например, IL6) и подтверждают гипотезу об
общей провоспалительной активности рецептора PPARβ.
Кроме того, данные результаты указывают на возможность
регуляции воспаления с помощью агонистов PPARβ в
астроцитах в условиях эндотоксиновой толерантности.
Данное предположение требует дальнейших исследований.
Список литературы
 Aleshin S., Grabeklis S., Hanck T., Sergeeva M. and Reiser G. (2009) Peroxisome ProliferatorActivated Receptor (PPAR)-gamma Positively Controls and PPAR alpha Negatively Controls
Cyclooxygenase-2 Expression in Rat Brain Astrocytes through a Convergence on PPAR beta/delta via
Mutual Control of PPAR Expression Levels. 76, 414-424.
 Aleshin S., Strokin M., Sergeeva M. and Reiser G. (2013) Peroxisome proliferator-activated receptor
(PPAR)beta/delta, a possible nexus of PPAR alpha- and PPAR gamma-dependent molecular pathways
in neurodegenerative diseases: Review and novel hypotheses. 63, 322-330.
 Biswas S. K. and Lopez-Collazo E. (2009) Endotoxin tolerance: new mechanisms, molecules and
clinical significance. 30, 475-487.
 Cavaillon J. M. and Adib-Conquy M. (2006) Bench-to-bedside review: Endotoxin tolerance as a
model of leukocyte reprogramming in sepsis. 10.
 Chen Y. M. and Swanson R. A. (2003) Astrocytes and brain injury. 23, 137-149.
 Chistyakov D. V., Aleshin S., Sergeeva M. G. and Reiser G. (2014) Regulation of peroxisome
proliferator-activated receptor beta/delta expression and activity levels by toll-like receptor agonists
and MAP kinase inhibitors in rat astrocytes. 130, 563-574.
 Farina C., Aloisi F. and Meinl E. (2007) Astrocytes are active players in cerebral innate immunity. 28,
138-145.
 Font-Nieves M., Gloria Sans-Fons M., Gorina R., Bonfill-Teixidor E., Salas-Perdomo A., MarquezKisinousky L., Santalucia T. and Planas A. M. (2012) Induction of COX-2 Enzyme and Downregulation of COX-1 Expression by Lipopolysaccharide (LPS) Control Prostaglandin E-2 Production
in Astrocytes. 287, 6454-6468.
 Chistyakov D., Aleshin S., Astakhova A., Sergeeva M. and Reiser G. (2015) Regulation of
peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) α and -γ of rat brain astrocytes in the course of
activation by toll-like receptor agonists. J Neurochem. 2015 Mar 25.
 Akira S., Takeda K. (2004) Toll – like receptor signaling. Nature Reviews Immunology 4 July, 499511
Спасибо за внимание!