Вторичная структура белков HYDROLASE

Вторичная
структура
белков
PEPTOCOCCUS
AEROGENES
FERREDOXIN
HORMONE GLUCAGON
HYDROLASE
(SERINE PROTEINASE)
Первичная структура может свернуться в пространстве и
принять ту или иную пространственную структуру,
которая называется вторичной структурой.
Вторичная структура
(1)Возможности
относительно
свободного вращения
вокруг некоторых
связей
(2) Возможности
взаимодействий между
близкими по цепи,
но ковалентно
несвязанными
атомами
Образование водородных связей
(показаны стрелками)
В принципе, возможны
такие спирали,
.
стянутые Н-связями:
27, 310, 413 (обычно именуемая ), 516 (или ).
В названии "27" - "2" означает связь со 2-м по цепи остатком,
а "7" - число атомов в цикле (O......H-N-C'-C-N-C'),
замыкаемом этой связью.
Правые (R)
спирали
Левые (L)
спирали
Показан отсчет положительного угла:
близкая к нам стрелка вращается
против хода часов
Правая -спираль
а) Атомарная
структура.
R - боковые группы.
Голубые линии водородные связи
(б) Схематическое
изображение одного
витка -спирали,
вид с торца.
Стрелка показывает поворот спирали
(в расчете на один остаток)
по мере ее приближения.
Карта разрешенных и запрещенных значений
углов для всех гипотетически возможных
спиралей полипептидной цепи:
27, 310, 413 (), 516 (), правые (R) и левые (L).
-спираль
Модель -спиральной конформации
полипептидной цепи.
Водородные связи формируются
«параллельно» направлению полипептидного остова
вдоль оси спирали!
Параметры
-спирали:
1. 3,6 аминокислотных
остатков на виток спирали
2. Шаг спирали Р = 5.4Å
3. Трансляция на один виток
d = 1,5Å
4. Радиус спирали r = 2,3Å
5. Водородные связи
образуются между 1 и 4
пептидными группами
Параметры -спирали
6.  = -57о,  = -47о
-структура
Водородных связей в -структуре –
«перпендикулярно» направлению
полипептидного остова.
Параллельная
Антипараллельная
Характеристики -структуры:
6 полипептидных цепей
6 аминокислотных остатков в цепи
Ширина листа
(6 цепей)
t =25Å
Характеристики
-структуры:
t
d
Длина листа
(6 остатков)
d =20 Å
Характеристики -структуры:
Антипараллельные
= -139о,  = +135о
параллельные
= -119о,  = +113о
-лист складчатый
-лист скрученный
-листы скручены из-за того,
что скручены отдельные -тяжи
Боковые группы
расположены на складках;
каждая обращена в ту же,
что и складка, сторону,
т.е. направленные
вниз и вверх
боковые группы
чередуются
вдоль -тяжа.
Скрученность
отдельного -тяжа левая
(у L аминокислот),
боковые группы тяжа
поворачиваются по
часовой стрелке
(на  -165o на каждый
остаток)
по мере приближения
тяжа.
Скрученность -листа
Конформация идеальной (не скрученной) параллельной и антипараллельной
-структуры для поли(Gly), и усредненная конформация реальной
(сложенной из L аминокислот) скрученной (twist) -структуры.
Пунктир показывает область
энергетического минимума
для отдельно взятого остатка
Ala;
контуром показаны границы
области разрешенных
конформаций этого остатка.
Над диагональю лежат
левые (L) спирали,
под ней - правые (R).
Диагональ -карты
соответствует плоской
периодичной структуре,
имеющей 2 остатка на виток
(n=2).
- изгибы
Конформация -изгибов
типа I (а) и II (б)
- изгибы
Конформация
-изгибов
типа I (а) и типа II (б)
Пролиновые спирали
Третий тип спирали –
пролиновые спирали:
полипролин I
и полипролин II.
Первая – полипролин I - левая спираль, содержит 10
остатка на 3 витка; все пептидные связи в цисконформации.
Вторая – полипролин II - левая спираль, содержит 3
остатка на виток; пептидные связи в транс-положении.
Спираль полипролин II имеет более вытянутую цепь, чем
-спираль: смещение вдоль оси спирали 3.12 Å на остаток
по сравнению с 1.5 Å для -спирали.
В нормальных физиологических условиях спираль
полипролин II более стабильна.
Основные геометрические
параметры
наиболее распространенных
в белках
вторичных структур
H-связь
Остаток/
виток
Смещение/
остаток (Å)


Спираль R (413)R
CO0—HN+4
+3.6
1.5
-570
-470
Спираль (310)R
CO0—HN+3
+3
2.0
-500
-250
Лист -паралл.
меж цепей*
-2.3
3.4
-1190 +1130
Лист -анти
меж цепей*
-2.3
3.2
-1390 +1350
нет
-3
3.0
-800
Структура
Спираль Poly(Pro) II
+1550
Карты Рамачандрана для наиболее
распространенных в белках вторичных структур
для пролина
P
для аланина
для больших
остатков
Экспериментальное определение вторичной структуры
белков
Метод РСА
(ренгеноструктурный
анализ)
Спираль ввиду ее симметрии легко распознать и описать. На карте
электронной плотности, полученной методом РСА, спирали видны как
светлые круги (вид с торца) или как периодически расположенные
светлые пятна (вид спирали сбоку).
Сближенность ядер атомов Н,
наиболее характерная для
-спирали
ЯМР
ядерный
магнитный
резонанс
параллельной
-структуры
антипараллельной
-структуры
Экспериментальное определение вторичной структуры
белков
Спектры КД
ИК-спектры пропускания
в тяжелой воде (D2O)
Для полилизина в форме
-спирали (a), -структуры (b)
и неупорядоченного клубка (r).
Стабильность вторичной
структуры белков
и
кинетика ее образования
α-спирали
Первая водородная связь в α-спирали,
(СО)0 …(HN)4,
фиксирует конформации трех остатков 1, 2, 3;
следующая водородная связь, (СО)1 …(HN)5, дополнительно
фиксирует конформацию еще одного остатка - остатка 4;
связь (СО)2 … (HN)6 дополнительно фиксирует остаток 5, и т.д.
Таким образом, если в спирали фиксировано n
остатков, то их фиксирует n-2 водородные связи
Свободная энергия образования α-спирали
из клубка в водном окружении
F = F — Fклуб. = (n-2)fH — nTS = -2fH + n(fH —TS)
fH - свободная энергия водородной связи в α-спирали; и энергия,
и энтропия перестроек водородных связей в водном окружении,
S - потеря энтропии при фиксации одного остатка в спирали.
В F есть два члена.
(1) -2fH - не зависит от длины спирали;
fINIT = -2fH - свободная энергия инициации спирали;
fINIT - суммарная свободная энергия обеих границ спирали с
клубком учитывает и инициацию, и терминацию спирали.
(2) n(fH - TS) - прямо пропорционален длине спирали.
fEL = (fH - TS) - свободная энергия элонгации спирали на 1 остаток.
В общем виде,
F = fINIT + n.fEL
Отношение вероятности спирального состояния цепи
из n остатков к ее клубковому состоянию, равно
exp(-F /kT) = exp(-fINIT/kT).[exp(-fEL/kT)]n = sn
- фактор элонгации спирали: s = exp(-fEL/kT);
- фактор инициации спирали:  = exp(-fINIT/kT);
<<1, так как  = exp(-fINIT/kT) = exp(+2fH/kT);
свободная энергия водородной связи fH - большая
отрицательная величина, порядка нескольких kT.
Как образуется спираль при изменении
условий среды
(температуры, растворителя и т.д.):
переходом "все-или-ничего"
или
постепенно?
Теорема Ландау:
В системе, где обе фазы одномерны,
фазовый переход первого рода невозможен
«Одномерность» - это значит, что размер границы,
"стыка" фаз не зависит от размера фрагментов этих фаз.
В этом смысле и спираль, и клубок в полимере одномерны.
«Происходит как фазовый переход первого рода".
Это значит, что при температуре перехода стабильной может
быть либо одна, либо другая фаза, но перемешивание фаз
(например, льда и воды) ведет к повышению свободной
энергии, и потому нестабильно.
Выгодно ли сосуществование фаз в трехмерной системе?
Нет. Почему?
Рассмотрим температуру, где безграничная вода и
безграничный лед имеют равную свободную энергию – это
условие "точки перехода".
Если в воде плавает льдина
из n молекул,
свободная энергия границы
пропорциональна n2/3,
где n2/3 - характерное число пограничных молекул,
 > 0 - энергия границы в расчете на одну из
пограничных молекул.
Если  < 0, "перемешивание" (оно в этом случае
термодинамически выгодно) произойдет на молекулярных
масштабах, и двух фаз вообще не будет.
Поверхность льдинки повышает свободную энергию на n2/3.
Позиционная энтропия льдинки (она может находиться в разных
точках сосуда) не превосходит величину
порядка k.ln(N),
если в сосуде N молекул - N точек, с которых может начинаться
льдинка.
F  [n2/3 - kТ.ln(N)]
(cвободная энергия льдинки)
Логарифм медленно растет для больших N.
Если льдинка занимает заметную часть сосуда (n ~ N/10),
то ln(N) (23) мал по сравнению с (N/10)2/3,
то есть в F доминирует граничный член n2/3,
а он противится ее образованию.
В трехмерной системе макроскопические фазы
разделяются,
и фазовый переход первого рода в ней возможен
Выгодно ли сосуществование фаз в одномерной
системе? Оказывается, да.
Рассмотрим температуру "середины перехода", где
спираль и клубок имеют равную свободную энергию, т.е.
fEL=0.
Свободная энергия обеих границ спирали и клубка, fINIT,
не зависит ни от размера спирали, ни от размера клубка.
Позиционная энтропия спирали длины n
в цепи длины N равна
S = k.ln(N-n)
и свободная энергия этой спирали
Fhel  fINIT - kТ.ln(N-n)
При больших N член с ln(N-n) всегда доминирует
в выражении Fhel = fINIT - kТ.ln(N-n)
даже если n ~ 0.9 N
Логарифмический член ln(N-n) понижает
свободную энергию и способствует внедрению
спирали в клубок (и, точно так же, - клубка в спираль).
Поэтому в одномерной системе
фазы не разделяются,
они стремятся перемешаться и
фазовый переход первого рода,
или типа "все-или-ничего",
невозможен при достаточно большой длине цепи.
Теорема Ландау доказана.
Для большинства аминокислот
fINIT  4 ккал/моль,
и
  0.001, n0 ~ 30.
Для измерения влияния отдельных
аминокислотных остатков на стабильность
спиралей используют короткие
(длиной n0 ~ 30 или менее) полипептиды.
В них может образоваться только одна спираль, и
оценить влияние каждой аминокислотной замены на
спиральность здесь наиболее просто.
Вклад аминокислотного остатка в стабильность
спирали лежит в следующих пределах:
аланин - самый "спиралеобразующий" остаток:
fEL  -0.4 ккал/моль, т.е. s  2;
глицин - самый "спиралеразрушающий" остаток:
fEL  +1 ккал/моль, т.е. s  0.2;
пролин - иминокислота
(не имеющей NH группы, которая должна завязывать
структурообразующую водородную связь в α-спирали)
величина s  0.01- 0.001, но точно не измерена.
Переход спираль-клубок всегда - даже для бесконечно
длинных цепей - имеет конечную ширину.
-0.07 <  < 0.07
Это пример не фазового, а
кооперативного перехода:
при малой величине фактора
инициации спирали (<<1)
переход совершается
при небольшом
изменении величины fEL
(много меньше, чем kT).
Это показывает, что
"единица перехода" кооперирует
много звеньев цепи,
но не всю цепь.
Рассмотрим скорость образования вторичной
структуры в пептидах
Кинетика
"Медленность" процессов
связана с преодолением высокого
свободно-энергетического барьера.
Особенно это типично для
переходов типа "все или ничего", где
свободно-энергетический барьер
разделяет две фазы и он всегда
значителен.
Преодоление свободно-энергетического (активационного) барьера # при
переходе из состояния "А" в состояние "В".
F# - свободная энергия барьера - перехoдного состояния.
Такой барьер похож на активационный барьер в химических реакциях,
только в этом случае он имеет и энергетическую, и энтропийную
составляющие.
α-спирали образуются быстро:
за
наносекунды
(10-9с)
α-спираль
охватывает пептид из 20-30 остатков, т.е.
спирали нарастают со скоростью порядка
1 остаток за несколько наносекунд.
Скорость образования α-спирали зависит
от скорости, с которой она нарастает, и от
скорости, с которой в цепях появляются
первые зародыши спиральной структуры.
Инициация α-спирали требует преодоления
активационного барьера, поэтому для
образования первого витка спирали
необходимо больше времени, чем ее
последующее удлинение еще на 1 виток.
Т.е. элонгация α-спирали идет быстро,
а все наблюдаемое время тратится
на ее инициацию.
Характерная зависимость свободной энергии спирали (Fa)
от числа вовлеченных в нее аминокислотных остатков (N)
при разных свободных энергиях ее элонгации (fEL).
При fEL<0 - длинная спираль стабильна,
но ее образование требует инициации,
преодоления активационного барьера высотой fINIT.
При fEL>0 - спираль любой длины нестабильна
и, следовательно, не образуется.
Кинетика образования α-спиралей
проста: они всегда образуются быстро.
относительно
Кинетика образования -структуры много сложнее и
интереснее.
-структура в полипептидах часто образуется очень
медленно – и за часы, и за недели (но и за миллисекунду).
Почему?
Белки с -структурой сворачиваются не медленнее αспиральных белков. Как они успевают? И что отвечает за
аномалии
в
образовании
-структуры
в
полипептидах: медленная инициация или медленная
элонгация?
"Аномальная" (по сравнению с переходом спиральклубок) кинетика образования -структуры связана с
тем, что она - двумерный объект, а не одномерный, как
спираль или клубок.
Схема -листа. Аминокислотные остатки внутренних участков - черные кружки, краевых -участков - пустые
кружки; изгибы (или петли), соединяющие -участки, - уголки.
б
Край -листа сложен
из
краевых -тяжей
и
изгибов (петель),
соединяющих
все -тяжи.
Сценарий роста -листа. Самая нестабильная структура помечена #.
Находящиеся на краю листа звенья цепи имеют
меньше контактов с другими, чем внутренние звенья
листа.
Т.е., край -листа (как и граница другой фазы - капли
воды, льдинки или α-спирали) имеет повышенную
свободную энергию.
В отличие от α-спирали (и в сходстве с каплей) -лист
не одномерен, размер его края (и его свободная энергия)
растет с числом вовлеченных в лист звеньев цепи.
Поэтому переход клубок - -структура
фазовый переход первого рода,
как образование капли или льдинки.
В результате на пути образования -листа возникает
высокий (особенно при образовании лишь слегка
стабильной -структуры) свободно-энергетический
барьер, который во много раз замедляет инициацию его
сворачивания.
Край -листа сложен из (а) краевых -тяжей, и (б)
изгибов или петель, соединяющих все -тяжи.
б
б
а
а
б
Пусть свободная энергия клубка принята за 0 (начало отсчета),
тогда
f - свободная энергия остатка в центре -листа,
f +f - свободная энергия остатка на его краю (f - краевой эффект),
U - свободная энергия изгиба.
Если -лист образуется, то он стабилен (f
<0),
а краевые эффекты препятствуют его распаду ( f
> 0 и U > 0).
В кинетике образования
различать два случая:
-структуры надо
1) f+f<0
т.е. длинная -шпилька стабильнее клубка.
б
Тогда только образование
изгиба в вершине этой шпильки
требует преодоления
активационного барьера
(примерно такого же, как при
образовании -спирали),
а дальнейший рост структуры идет быстро, как
элонгация  -спирали.
б
а
а
б
2) f+f>0
т.е. -шпилька сама по себе нестабильна, и только прилипание
к инициирующей -шпильке последующих -тяжей стабилизует
-лист.
Активационному барьеру тогда соответствует образование
"зародыша" - такого -листа или -шпильки, что дальнейший
рост листа пойдет уже с общим понижением свободной энергии.
Образование и последующее
"прорастание" зародыша новой фазы характерная особенность
фазовых переходов первого рода,
к которым относится
образование -структуры.
б
б
а
а
б
Но преодоление связанного с образованием зародыша
активационного барьера может быть очень медленным
Рассмотрим простейший сценарий роста стабильного -листа:
• образование инициирующей -шпильки из изгиба и двух
-тяжей, по N звеньев (аминокислот) в каждом;
• образование последующего изгиба на ее конце;
• прилипание к листу -тяжа из N звеньев;
• образование последующего изгиба; прилипание -тяжа; и т. д.
Цикл "прилипание нового -тяжа и образование нового -изгиба"
изменяет суммарную свободную энергию на Nf+U.
В результате такого цикла свободная энергия должна снижаться (тогда
сворачивание цепи идет быстро), и прилипающий  -тяж (и тот, к которому он
прилипает) должен состоять не менее чем из Nmin
= U/(-f) звеньев.
«Переходным» - самым нестабильным состоянием при
образовании -структуры - это -шпилька с последующим изгибом (#).
Так как стабильность шпильки падает с удлинением, а -тяж в
инициирующей шпильке должен состоять как минимум из
Nmin
звеньев
Nmin = U/(-f), то Fmin инициирующей -шпильки равна
F# = U + 2Nmin(f +f ) + U = 2(U f )/(- f ).
Это свободная энергия переходного состояния при
образовании -листа по нашему сценарию.
f - свободная энергия остатка в центре -листа, U - свободная энергия изгиба.
f +f - свободная энергия остатка на его краю (f - краевой эффект),
Как меняется минимальная свободная энергия -листа с
его увеличением?
Пока лист мал, доминируют краевые эффекты, и свободная
энергия повышается. В большом листе доминируют
внутренние остатки, и его свободная энергия падает.
Общий ход изменения
минимальной свободной
энергии
-листа Fopt
с увеличением числа
звеньев в нем.
#
N
Кривые относятся к разным свободным энергиям f внутренних звеньев -листа.
-точка максимума величины Fopt по ходу роста -листа. При росте -листа (в
отличие от роста -спирали) максимум его свободной энергии не приходится на
самое начало этого процесса.
Так как, согласно теории переходного состояния, время
процесса t зависит от свободной энергии переходного (самого
нестабильного промежуточного) состояния F# как
t ~ .exp(+F#/kT),
где  - время элементарного шага (элонгации -листа на один остаток; скорость
элонгации -листа качественно не отличается от скорости элонгации спирали),
тогда характерное время образования -листа при малых -f есть
t  ~   .exp[A/(-f)] , где A - некая константа.
Общий вид зависимости характерного времени
образования -листа от стабильности -структуры
-
При малых -f время образования
структуры огромно, в пределе - бесконечно
велико.
Итак:
малостабильная -структура должна образовываться очень
медленно, и причина не в медленной элонгации, а в
медленной инициации: трудно собрать свободную энергию из
теплового движения и преодолеть высокий барьер.
Так объясняется и экспериментально
наблюдаемая, очень медленная скорость
образования -структуры в
неагрегирующих полипептидах,
и резкий ее рост с повышением
стабильности  -структуры.
В то же время стабильные  -листы и
шпильки (они и наблюдаются в белках)
должны образовываться довольно
быстро, примерно как -спираль.
Крайне медленная инициация - общее свойство фазовых
переходов первого рода, когда возникающая фаза находится
на грани стабильности.
Это связано с большой свободной энергией обширной
границы раздела фаз.
-структура образуется фазовым переходом первого рода со
всеми вытекающими последствиями.
Наоборот, -спираль не образуется
фазовым переходом первого рода:
граница спирали, в отличие от границы
-структуры (или льдинки), не растет с
ее размером. Поэтому барьер, который
нужно преодолеть при сворачивании
спирали, всегда имеет конечную,
небольшую величину, и она может успеть
"проинициироваться" за микросекунду.
Вопрос:
при каких характерных длинах цепи начинается
смешение клубковой и спиральной фаз?
Рассмотрим цепь из N звеньев при температуре "середины перехода",
где спираль и клубок имеют равную свободную энергию:
fEL= 0.
Свободная энергия инициации спирали - fINIT.
Число возможных положений спирали в цепи из N звеньев
порядка N2/2
(спираль может начинаться и кончаться в любом месте,
ее длина — не менее трех остатков).
Ни расположение спирали в цепи, ни ее длина
при fEL=0
не влияют на свободную энергию спирали.
Полная свободная энергия внедрения фрагмента
новой фазы - спирали - в цепь длины N:
 fINIT -
2kТ.ln(N).
Смешение клубковой и спиральной фаз
начинается в фрагментах
длины N
~ n0,
и величина n0 получается из уравнения
fINIT - 2kТ.ln(n0) = 0
и характерная длина кусков спирали и клубка в
середине перехода
n0 = exp(+fINIT/2kТ) =  - 1/2