методы оценки биодоступности лекарственных средств с

ГУ «Институт фармакологии и токсикологии
НАМНУ»
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ БИОДОСТУПНОСТИ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОЧНЫХ
ТЕХНОЛОГИЙ
А.И. СОЛОВЬЕВ
ВСТУПЛЕНИЕ



Одна из главных целей фарминдустрии - создание
препаратов с Good Oral Bioavailability.
Это происходит в том случае, когда потенциальный
препарат имеет Maximum Solubility и Maximum
Permeability в месте абсорбции.
Следовательно, оценка Intestinal Permeability
является чрезвычайно важным моментом в оценке
кандидата в новые лекарственные препараты.
2
К истории вопроса


European Centre for the Validation of
Alternative
methods
(ECVAM)
recommendations – since 1993.
Workings documents and Guidance's for
Industry of FDA and World Health
Organization – 2002-2004.
3
ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ
ТЕХНОЛОГИЙ В ФАРМАКОЛОГИИ И ФАРМАЦИИ




1.
Фундаментальные
исследования,
связанные с созданием новых лекарственных
средств.
2. Скрининговые исследования.
3. Изучение безвредности и
специфической
активности.
4.
Исследования
биодоступности
и
биоэквивалентности лекарственных средств.
4
Преобразование лекарственной формы до момента
поступления действующего начала в системный кровоток
Дезинтеграция
Переработка
печенью
Растворение
Вещество в системном
кровотоке
(Здесь тоже много чего
происходит)
Вещество в растворе
Проницаемость
Распад,
комплексообразование
5
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЛЕКАРСТВА С
ОРГАНИЗМОМ


I. Фармакокинетическая фаза (всасывание,
распределение, метаболизм, выведение).
II. Фармакодинамическая фаза (реализация
физиологического эффекта)
Растворимость и всасывание (абсорбция) – лимитирующие
факторы скорости протекания фармакокинетической фазы
6
АБСОРБЦИОННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА
Растворимость|Растворение +
Проницаемость =
Абсорбционный Потенциал
7

Эпителий кишечника представляет
собой
т.н.
gatekeeper,
т.е.
привратник, сторож. По сути, это
основной
барьер,
который
контролирует
поступление
(абсорбцию) в кровь питательных
веществ и ксенобиотиков, в том
числе и лекарственных препаратов.
8
БИОДОСТУПНОСТЬ
Определяется временем и количеством
активной
субстанции
лекарственного
препарата, которая абсорбируется из
лекарственной
формы,
поступает
в
системный кровоток
и
становится
доступной в месте действия препарата.
К этому определению у меня есть замечания
9
БИОЭКВИВАЛЕНТНОСТЬ

Два лекарственных препарата считаются
биоэквивалентными, если они являются
фармацевтически эквивалентными (т.е.
содержат одну и ту же субстанцию в
одинаковых концентрациях или дозах и
вводятся одним путем) и если их
биодоступность после введения в одной и
той же молярной дозе
достоверно не
отличается
10
ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭКВИВАЛЕНТНОСТЬ
Лекарственный
препарат-генерик
является
терапевтически эквивалентным, если он содержит
то же действующее начало или его терапевтически
активную часть и клинически проявляет такую же
эффективность и столь же безопасен как
инновационный препарат.
Проблема
клинических
испытаний
-
стандартизация
11
Пути и механизмы транспорта молекул через
эпителий кишечника
Апикальная мембрана
Плотные
контакты
Базолатеральная
мембрана
межклеточный
трансклеточный
1) межклеточный; 2) трансклеточная пассивная диффузия; 3) трансцитоз; 4) опосредованное
носителем поступление в апикальный участок с последующей пассивной диффузией через
базолатеральную мембрану. Способ переноса зависит от гидро\липофильности препарата,
12
размера молекулы, сродства к транспортным белкам и т.п.
ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА
АБСОРБЦИЮ ЛЕКАРСТВЕННОГО
ПРЕПАРАТА В КИШЕЧНИКЕ




1.
Моторика
желудочно-кишечного
тракта
(иннервация, гормональный контроль).
2.Физико-химические характеристики препарата
(мол. вес, рКа, растворимость, липофильность и
т.пд.).
3. Структурно-функциональные характеристики
ЖКТ (рН, желчь, число и состояние энтероцитов,
крово-лимфоток и т.п.).
4. Тип абсорбции (пара/трансцеллюлярный,
пассивная
диффузия,
трансцеллюлярный
эндоцитоз).
13
ТРИ ПОКАЗАТЕЛЯ, ПОЛНОСТЬЮ
ХАРАКТЕРИЗИЮЩИЕ СКОРОСТЬ И
СТЕПЕНЬ АБСОРБЦИИ ЛЕКАРСТВА
I. Растворимость
(физико-химическая характеристика субстанции)
II.Проницаемость (характеристика биологического
барьера для данной субстанции)
III. Растворение (характеризует скорость выхода
действующего начала из лекарственной формы)
14
ОСНОВНЫЕ ПАРАМЕТРЫ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ
ДОСТИЖЕНИЕ ОПТИМАЛЬНОГО
ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ЛЕКАРСТВА
I. Скорость/время доставки активной субстанции
лекарства к месту предполагаемого действия.
II. Концентрация\количество лекарства в месте
действия.
Для достижения оптимального терапевтического
эффекта лекарство должно быть доставлено к
месту действия в эффективной концентрации в
течение заданного отрезка времени
15
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ
АБСОРБЦИИ ЛЕКАРСТВ



IN VITRO METHODS:
A)
Клеточные культуры
B)
Изолированные клетки
C)
Мембранные везикулы ворсинчатого эпителия
D)
Вывернутые фрагменты кишечника
E)
Изолированные ткани
IN SITU METHODS:
A)
Замкнутая петля кишечника
B)
Перфузируемая петля
C)
Перфузируемый препарат кишечник-печень
IN SILICO METHODS (COMPUTATIONAL)
A)
Rule Of Five
B)
QMPRPlusTM (Quantitative Molecular Permeability Relationship)
C)
GASTROPlusTM
D)
iDEATM (In Vitro Determination For The Estimation Of ADME)
16
КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ




Клеточные культуры широко используются для изучения
абсорбции лекарств.
Эти модели основываются на допущении, что прохождение
лекарств через интестинальный эпителий является
главным барьером для лекарств на пути в кровоток.
Несколько клеточеных линий опухолей кишечника, такие
как Сaco-2, HT-29, SW116, SW-480, LS174T, используется
для изучения абсрбции лекарств.
Линия Caco-2 является наиболее изученной. Ее часто
называют «золотым стандартом».
17
КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ
• Клеточная культура – обычно это колония клеток в
•
виде монослоя, растущая на планшетах или
полупроницемых мембранах.
Клетки культивируются в растворах с высоким
содержание глюкозы - Dulbecco’s Modified Eagle’s
medium(DMEM)
Ingredients
Quantity
Glucose
4.5 g/lit
L-glutamine
NaHCO3 supplemented with heat
inactivated Fetal Bovine Serum(FBS)
10%
Streptomycin
0.1 mg/ml
Penicillin
100 units
HEPES buffer
10 mM
Non essential amino acids (NEAA)
Culture conditions
Temperature
370C
Relative humidity 95%
Air
5% CO2
Medium should be
exchanged every 4872 hours
18
Что такое Caco-2?


Культура клеток Caco-2 была внедрена в
практику в начале 1990-х и в настоящее
время широко используется для оценки
интестинального транспорта и скрининга
лекарств-кандидатов (золотой стандарт).
Происхождение:
Human
colon
Adenocarcinoma, которая спонтанно
дифференцируется
в
энтероцитподобные клетки.
19
20
Микрофотография монослоя клеток
культуры Сасо-2
21
ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ Сасо-2









Происхождение–колон-ректальная аденокарцинома человека
Рост в культуре – монослой
Дифференциация – на 14-21 день
Морфология – поляризованные клетки с плотными контактами и
ворсинками
Электрические параметры – высокое сопротивление
Ферменты – типичные пептидазы и диссахаридазы тонконо кишечника
Трансмембранный ионный транспорт– Na+/K+ATPase, H+/K+ATPase, Na+/H+
обмен,,Na+K+/Cl- ко-транспорт, апикальные Cl- каналы
Активный транспорт–аминокислоты, сахариды, витамины, гормоны
Рецепторы–витамин В12, витамин D3, епидермальный фактор роста,
переносчики сахаридов (GLUT1, GLUT2, etc)
22
РОССИЙСКАЯ КОЛЛЕКЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ
КУЛЬТУР








Происхождение: человек, аденокарцинома ободочной кишки (J Natl Cancer Inst,
1977, 58:209-214; J Natl Cancer Inst, 1977, 59:221-226).
Морфология: эпителиоподобная.
Условия культивирования : среда- ЕМЕМ или ДМЕМ,
Сыворотка: эмбриональнаяб, бычья 10-15%
Процедура пересева: снятие клеток с использованием трипсина 0.25%, версена
0.02% (1:1-1:3), кратность пересева 1:3-1:6, оптимальная плотность 2.0-4.0х104
клеток/см2. Криоконсервация- ростовая среда, 5-10% DMSO, 1.0х106 клеток в ампуле.
Жизнеспособность после криоконсервации: 80% (окраска трипановым синим на
нулевом пассаже).
Контроль контаминации: бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены.
Контроль видовой идентичности: кариологический анализ.
Кариология - 2n=46, пределы изменчивости по числу хромосом 91-107, модальное
число хромосом 96-101, количество маркеров 10, количество полиплоидов 3.2%
(АТСС).
Туморогенность: туморогенны в мышах nude.
Коллекция: ATCC HTB37, ECACC 86010202, ИНЦ РАН
23
Процедура подготовки клеточной
линии Сасо-2 к работе



Криоконсервация\расконсервация клеток
Культивирование, трипсинизация, 25105 пассажей (через 2 дня на 3-ий)
Культивирование на полупроницаемых
поликарбонатных мембранах в течение
21 дня
Итого,
полный
цикл
подготовки
составляет в среднем 216 дней.
24
ПРЕИМУЩЕСТВА CaCO-2 МОДЕЛИ
a.
b.
c.
d.
e.
In Drug Discovery: Позволяет оценить профиль абсорбции новой
химической структуры в различных модификациях.
In pre-clinical drug development: US FDA признает Caco-2 в
качестве способа оценки биодоступности лекарств.
Позволяет оценить роль наполнитетелей, улучшающих
ницаемостьбиодоступность (про за счет увеличения
растворимости, т.е. может быть использование в процессе
создания оптимальной лекарственной формы.
Caco-2 культура экспрессирует различные транспортеры, которые
либо способствуют, либо ограничивают транспорт лекарств.
Таким образом, caco-2 могут быть использован для изучения
авктивного транспорта лекарств.
In drug metabolism & toxicity effects, genetic studies.
25
НЕДОСТАТКИ CACO-2 МОДЕЛИ








Достаточно высокая цена.
Продолжительность, требуется 21 день для полной дифференциации
клеток.
Требуется соблюдение определенного режима для создания стабильного
монослоя клеток.
Относительно низкая производительность.
Необходимость LC / MS or HPLC для определения.
Клетки имеют злокачественную природу.
Caco-2 экспрессирует P-glycoprotein. Это может привести к завышению
данных для некоторых субстанций.
Концентрации лекарств, используемые в экспериментах с Caco-2 не
всегда соответствуют их дозировкам in vivo.
26
27
Транспорт веществ через стенку кишечника
описывается уравнением Фика
Jwall = Pwall x C,
где Jwall – поток препарата через стенку, Pwall –
коэффициент проницаемости, С – максимальная
концентрация в просвете кишечника
28
Kоэффициент проницаемости
монослоя Сасо-2
Papp = dQ\dt x 1\A Co,
где Papp – коэффициент проницаемости;
dQ\dt – скорость транспорта, нМ\с;
A – площадь поверхности монослоя, см2:
Co – исходная кон-я вещества в апикальном отсеке
камеры.
Высокий ≥
1х10-6 см\сек
Низкий
<
1х10-7 см\сек
Маркеры
проницаемости
монослоя
–
метотрексат,
-6
пропранолол, тестостерон (1.2 - 73 х 10 см\сек).
29
TEER - Измерение трансэпителиального
сопротивления

Легкий и неинвазивный метод.
Millicell ®-ERS system ohmmeter
The STX-100M electrode or
EVOM Epithelial Voltammeter.
Минимальное значения TEER →
450-650Ω cm2
 Монослои с меньшим TEER отбрасываются
30
Зависимость трансэпителиального электрического
сопротивления монослоя Сасо-2 от времени
культивирования
Сопротивление достигает стационарного значения 234 Ом∙см после 17 дней
культивирования и сохраняется как минимум 40 дней. В качестве маркера
целостности монослоя можно использовать С-маннитол (скорость прохождения
через монослой < 0.05%/час (данные из литературного источника).
31
Изолированные ткани




Изолированные сегменты слизистой
кишечника после удаления мышечного слоя.
Монтируются в специальном 2-х камерном
устройстве (Ussing chamber)..
Перфузируются раствором Кребса при 370С и
барботируется смесью О2\СО2=95\5%.
Целостность фрагмента подтверждается
ТЕЕR.
32
МЕТОД ЮССИНГА
33
Камера ЮССИНГА (USSING SYSTEM)
34
Недостатки:


Данные о жизнеспособности
препарата очень противоречивы.
Технически сложный метод.
35
Тест с помощью параллельных искусственных
мембран
- PARALLEL ARTIFICIAL MEMBRANE PERMEABILITY ASSAY (PAMPA)



PAMPA - быстрый и надежный инструмент для
скрининга лекарств на ранних этапах
Метод был внедрен в 1998 г. и заключается в
использовании покрытых фосфолипидом фильтрах,
разделенных двумя водными компартментами,
имитирующими пассивный транспорт малых молекул.
Благодаря высокой скорости, низкой стоимости и
универсальности является хорошим дополнением Caco2.
36
PAMPA
Artificial
membrane
37
Сравнение PAMPA & Caco-2
Методик
PAMPA MODEL
CACO-2 CELL MODEL
There is no cell culture involved, so
do not required long planning.
Membrane composition comprise of
phospholipids in alkane.
This method is based on cell
culture, so required planning
High throughput & low cost
Specific requirements are needed
For HT in this method like 96- well plats
& compatible detection system.
the method is Useful only for passive
transcellular permeability and not
for compounds transported through
an active mechanism or via the
paracellular rought.
For paracellular & transcellular
permeability
Useful tool in early drug discovery
to assess the permeability potential of
large no. of compounds.
Method is more suitable during lead
optimization or preclinical
development stages, where true
transepithelial permeability is needed. 38
МОДИФИКАЦИИ CaCO 2
39
Изолироваанные клетки
эпителия


Процедура получения изолированных клеток
слизистой кишечника заключается в
ферментативном разделении клеток с
помощью коллагеназы, хелатирующих агентов,
таких как EDTA, и механического
перемешивания.
Такие изолированные клети используются для
изучения активности ферментов, транспорта
лекарств и клеточного метаболизма.
40
ВАЛИДАЦИЯ МОДЕЛЕЙ
Acc. to FDA guidelines, validation of Caco-2 permeation assay was
performed using reference drugs known as low, moderate or high
absorbers.
HIGH ABSORPTION
INTERMEDIATE
LOW ABSORPTION
ABSORPTION
Isopropanol
Cimetidine (reference)
Atenolol (reference)
Paraquat (pesticide)
Cupric sulphate
(reference)
Ethylene glycol
(chemical)
Sodium Valproate
(chemical)
Paracetamol (drug)
Colchicine (drug)
(drug)
Acetylsalicylic acid
(drug)
41
MADIN-DARBY CANINE KIDNEY (MDCK)
CELL MODEL




MDCK cell достигают полной дифференциации к
3-7дню культивирования и их культивирование
представляет собой более легкую задачу, чем
культивирование Сaco-2.
НЕДОСТАТКИ
MDCK cell происходят из клеток почки собаки.
Экспрессия транспортеров сильно отличается
от таковой в кишечнике человека.
42
Везикулы мембран ворсинчатого
эпителия(BBMV)


Методы изоляции BBMV включают разрушение
клеточных структур, центрифугирование в градиенте
плотности, иммуноабсорбционную хроматографию или
преципитцию ферментов, не связанных с ворсинчатым
эпителием, в присутствии Са или Mg.
BBMV используются для изучения факторов, влияющих
на процессы всасывания в слизистой без участия
внутриклеточного метаболизма.
43
Технологии с использованием
вывернутых тканей




Everted Sac Technique:
Сегмент кишечника выворачивается наружу (inside out),
заполняется раствором и лигируется с двух концов.
Мешочек помещается в оксигенировапнный раствор,
содержащий исследуемый препарат.
Жидкость внутри мешочка исследуется на предмет
содержания препарата и, соответственно, оценки его
проницаемости.
44
Вывернутые кольца кишечника





Используются интактные сегменты кишечника с
сохраненным мышечным слоем.
Обычно это вывернутые наружу кольца
кишечника крыс, омываемые соответствующим
раствором при 370 и достаточной оксигенации.
При соблюдении всех правил остаются
жизнеспособными до 2 час.
Транспорт лекарств останавливается с помощью
перфузии холодным раствором и последующим
высушиванием.
Содержание лекарств определяется в mol/gm/time
и оценивается соответствующим образом
45
Изучения влияние липидного состава липосомальных препаратов,
используемых с целью повышения растворимости плохо
растворимых в воде субстанций, на прохождение через монослой
Caco-2



Сaco-2 используется для определения влияния на процессы транспорта
различных лекарственных форм. Например, для изучения влияния
различных концентраций липида на пассивную абсорбцию
прогестерона.
Прогестерон был инкорпорирован в фосфатидилхолиновые липосомы.
Абсорбция препарата оценивалась с помощью Caco-2 assay..
Вывод: Для липосомальных препаратов, Papp сильно снижается с увеличением
концентрации фосфолипида. Это объясняется тем, что только несвязанные молеекулф
проходят через монослой. Большая часть прогестерона, благодаря его липофильности,
распределена в мембране липосом.
46
ЛЕКАРСТВЕНЫЕ ПРЕПАРАТЫ, ИССЛЕДОВАНИЯ
БИОЭКВИВАЛЕНТНОСТИ КОТОРЫХ
РЕКОМЕНДУЕТСЯ ПРОВОДИТЬ IN VIVO (Annex 1
to Working document QAS/04.109, 11 October 2004)
I. Фармацевтические продукты орального применения с
немедленным освобождением системного действия.




Препараты для купирования неотложных состояний.
Препараты с малой широтой терапевтического действия
и «крутым» наклоном зависимости “доза-эффект”
(высокие значения коэффициента Хилла).
Препараты для которых существуют документально
подтвержденные
доказательства
проблем
с
биодоступностью (не связанные с растворением).
Препараты в которых наполнитель или сам процесс
производства могут влиять на биоэквивалентность.
47
ЛЕКАРСТВЕНЫЕ ПРЕПАРАТЫ, ИССЛЕДОВАНИЯ
БИОЭКВИВАЛЕНТНОСТИ КОТОРЫХ РЕКОМЕНДУЕТСЯ
ПРОВОДИТЬ IN VIVO (продолжение)
II. Препараты не орального и не парентерального
введения, созданные с расчетом на системную
абсорбцию (пластыри, свечи, гели и т.п.)
III. Фармацевтические продукты с модифицированным
освобождением,
действующие
путем
системной
абсорбции
IV.Комбинированные препараты системного действия, в
которых по крайней мере один из компонентов требует
изучения in vivo.
V. Препараты, не требующие для реализации эффекта
системного действия (глазные капли и т.п.),
48
Биофармацевтическая
классификационная система (BSC)








Класс 1
Класс 2
Класс 3
Класс 4
—
—
—
—
высокая растворимость, высокая проницаемость
низкая растворимость, высокая проницаемость
высокая растворимость, низкая проницаемость
низкая растворимость, низкая проницаемость
Класс 1 — от изучения биоэквивалентности in vivo можно отказаться
Класс 2 — от изучения биоэквивалентности in vivo можно отказаться,
если активное вещество-слабая кислота и препарат растворяется в
количестве ≥ 85% (pH 6,8) в течение ≤ 30 мин, а его профиль
растворения подобен профилю референтного препарата при pH 1,2;
4,5; 6,8
Класс 3 — от изучения биоэквивалентности in vivo можно отказаться,
если генерик и референтный препараты - очень быстро растворимые ≥ 85% в течение ≤15 мин при pH 1,2; 4,5; 6,8)
Класс 4 — исследования биоэквивалентности in vivo проводятся
всегда.
49
Измерение проницаемости монослоя
клеточной культуры Сасо-2 для
парацетамола
30
insert 1 - 0,46 0,02 мкмоль/мин
insert 2 - 0,54 0,01 мкмоль/мин
концентрация (мкмоль)
25
20
15
К1 = 19,2*10-6 см/с; logK1 = -4.72
К2 = 22.5*10-6 см/с; logK2 = -4.65
10
5
0
0
10
20
30
40
50
время (мин)
50
Динамика концентрации летромары в
акцепторной камере
Среднее значение проницаемости для летромары составило 5,72 ± 0,16∙х10-5 см/с,
что соответствует высокой проницаемости монослоя Сасо-2 для исследуемого
препарата.
концентрация, мкг/мл
0,9
0,6
0,3
0
0
20
40
60
время, мин
51
Абсорбция у человека (%)
Взаимосвязь (высокая корреляция) между
всасыванием веществ в кишечнике человека и
проницаемостью через монослой клеток Сасо-2
Сасо-2 Рарр(10-6см/c)
52
НОРМАТИВНА БАЗА
щодо вивчення біодоступності і біоеквівалентності
лікарських засобів в умовах in vitro

Наказ Міністерства охорони здоров'я
України від 17.04.2007 р. №190 “Про
затвердження
Порядку проведення
додаткових
випробувань
лікарських
засобів
при
проведені
експертизи
реєстрайійних матеріалів”
53