Физиология поглощения и транспорта антропогенных

Физиология поглощения и
транспорта антропогенных
токсикантов в растениях
Тема 2. Принципы оценки
токсичности вещества
Н.В. Иваненко, доцент кафедры ЭПП,
канд. биол. наук
Проникновение токсичных
соединений в семена
Кожура
Семядоля
Апекс побега
Апекс корня
Эндосперм
Рис. Структура семян двудольного (слева) и однодольного
(справа) растений
Поглощение семенами кукурузы, сои,
клещевины гербицидов из водного раствора:
флуметурон < 2,4-Д < дифенамид < дрифлуралин <
< атразин < прометрин < хлорпрофам
 Dt
4a
 Dt 
M(t) 
(C0  C1 )   2 
Ws
  
a
2
1/ 2
где M(t) - масса гербицида, абсорбированного семенем,
мкг/г; t время инкубации, с; а - радиус семени, см; Ws воздушно-сухая масса семени, г; D - коэффициент
диффузии гербицида в поглощаемой среде, см2/с; С0 исходная концентрация гербицида в среде (мкг/мл), С1 концентрация гербицида у поверхности семенной
кожуры (мгк/мл).
Поглощение токсичных соединений листьями
Рис. Клеточное строение части
листа двудольного растения.
Показаны верхняя и частично
нижняя поверхность,
продольный и поперечный
срезы. Области проводящих
путей - жилок - не изображены.
В правой части слой верхнего
эпидермиса отогнут.
1 - клетки верхнего эпидермиса; 2 - клетки нижнего эпидермиса; 3 - клетки
столбчатой паренхимы; 4 - клетки губчатой паренхимы; 5 - замыкающие клетки
устьиц, щель между каждой их парой - просвет устьица; 6 - кутикула; 7 межклеточные пространства, в данном случае - губчатой паренхимы (они
заполнены воздухом, сообщаются между собой, а через просветы устьиц - и с
внешней средой; на рисунке они изображены темным). Ядра имеются во всех
клетках эпидермиса и листовой паренхимы, но на срезах они видны не везде, так
как во многих клетках срез проходит в стороне от ядра, выше или ниже его. В
паренхимных и околоустьичных клетках видны хлоропласты. Цитоплазма во всех
представленных на рисунке клетках расположена пристеночно (изображена
пунктиром).
Основные
типы
устьичного
аппарата
Устьице листа томата
Проникновение жидкостей через устьица
зебрины пурпурной (Zebrina purpusii)
устьица
1. Поверхностное натяжение меньше 30 дин/см
2. Поверхностное натяжение больше 30 дин/см
Транспорт через кутикулу
Безвосковая линия гороха
Листья гороха с восковым
слоем (1)
Пестициды карбофос и тетилнитрофос через 3-4 часа полностью
проникают в фотосинтезирующие ткани листьев растений
безвосковых линий
Проникновение токсиканта через кутикулу зависит от
физико-химических свойств вещества
• Соединения, обладающие большей липофильностью
проникают через кутикулу интенсивней и в больших
количествах;
• Кутикула более проницаема для веществ с небольшой
молекулярной массой (корреляция м/д проницаемостью и
молекулярной массой проявляется не всегда);
• Проницаемость увеличивается с возрастанием степени
дисперсности в следующем порядке:
порошок < суспензия < эмульсия < истинный раствор
• Чужеродные молекулы, в особенности слабые кислоты
перемещаются преимущественно в недиссоциированном
состоянии;
• Повышение температуры от 10 до 30° увеличивает
проницаемость кутикулы и мембран.
Трихомы
Семя хурмы
Лист кукурузы
Проникновение токсичных соединений в корни
• В корень вещества проникают только через неопробковавшуюся
клеточную стенку, не имеющую кутикулы;
• Токсиканты проникают в корни тем же путем, что и питательные
вещества – с непрерывным током воды;
• К транспортирующей ткани – ксилеме – токсиканты, в основном,
передвигаются по апопласту, свободному внеклеточному
пространству.
• Малое количество токсикантов движется по симпласту – через
клетки и соединяющие их плазмодесмы.
Транспорт по апопласту и симпласту
Перемещение токсичных соединений в
растениях
Движущими силами являются:
1.
Транспирационный ток – транспорт воды и растворенных в
ней веществ, направленный от корней к побегам, который
проходит по сосудам и трахеидам, расположенным в ксилеме
(транспорт через ксилему);
2.
Ток ассимилятов – транспорт веществ из листьев к частям
растений, расположенным ниже (ось побега, корень) и выше
(верхушки побегов, плоды) листьев. Ток ассимилятов
проходит через ситовидные трубки, имеющиеся во флоэме
(транспорт через флоэму).
Ситовидная трубка
Флоэмную подвижность ксенобиотиков объясняет
гипотеза промежуточной проходимости:
• любая молекула с высокой проницаемостью через мембрану
способна войти во флоэму, но может также выйти из флоэмы и
быстро перемещаться в ксилемном потоке;
• любая молекула с низкой проходимостью через мембрану не
сможет достичь достаточно высокой концентрации во флоэме,
чтобы эффективно передвигаться в ней;
• вещества, которые имеют промежуточную между этими
крайними значениями проницаемость, должны обладать самой
высокой флоэмной подвижностью.
Системные гербициды, обладающие способностью проникать в
растения и перемещаться по транспортным путям, делятся на классы:
• флоэмо-мобильные,
• ксилемо-мобильные,
• амби-мобильные (способны перемещаться как во флоэме, так и
ксилеме).
Принадлежность к какому-либо классу определяется такими физикохимическими параметрами, как константа диссоциации (рКа) и
липофильность (Kow).
– К флоэмо-мобильным относятся такие гербициды, которые
диссоциируются со степенью, характерной для сильных и средних
кислот (значение рКа < 4) и имеют среднюю липофильность (log
Kow приблизительно от 1 до 2,5-3).
– Способность перемещаться только по ксилеме характерна для
гербицидов со средней липофильностью (log Kow от 0 до 4) и с
низкой степенью ионизации (рКа > 7).
– Слабые кислоты (рКа > 7), обладающие высокой гидрофильностью
(log Kow < 0), являются амби-мобильными.
– Высоко липофильные гербициды (log Kow > 4), несмотря на
значения рКа, часто являются несистемными (так называемые
контактные гербициды), так как не могут перемещаться в ксилеме
или флоэме.
Влияние антропогенных токсикантов на
структурную организацию клетки
Общая картина действия органических токсикантов на
растительные клетки выглядит следующим образом:
1.
На начальных этапах действие органических токсикантов на
растительную клетку проявляется в изменении конфигурации ядер.
Отмечается угнетение синтеза ДНК. Нарушается барьерная функция
плазмалеммы, а также ее способность накапливать кальций.
Повышается концентрация Са2+ в цитоплазме, ингибируется
активность Са2+-АТР-азы. В клетках, подверженных действию
токсикантов, встречаются митохондрии с набухшими кристами и
уплотненным матриксом, пластиды также электронно-плотные и
увеличенных размеров;
2.
Более продолжительное воздействие токсикантов приводит к
расширению цистерн эндоплазматического ретикулума и аппарата
Гольджи, вакуолизации цитоплазмы; уменьшается объем цитоплазмы
и увеличивается периплазматическое пространство. В некоторых
клетках кортекса корневых апексов наблюдается увеличение
количества рибосом в гиалоплазме, а также образование полисом.
Происходит лизис митохондрий, отделение рибосом от мембран
шероховатой эндоплазматической сети. Отмечаются частые контакты
эндоплазматического ретикулума с плазмалеммой, плазмодесмами,
вакуолями, ядерной мембраной и митохондриями. Наблюдается
увеличение объема ядер и так называемая хроматиновая коагуляция
– патологический процесс, при котором происходит склеивание
хромосом, что в конечном счете приводит к нарушению синтеза ДНК.
Нередко ядра принимают нехарактерные формы в связи с развитием
многочисленных выступов ядерной оболочки .
В клетках листьев нарушается форма и изменяется качественный
состав всех хлоропластов, которые приобретают неопределенную
конфигурацию. Наружная мембрана не просматривается, нарушается
ориентация ламеллярной системы, матрикс становится
просветленным с большими осмиофильными включениями. В
цитоплазме дифференцированных клеток корневого чехлика,
секретирующих слизь, наблюдается скопление гипертрофированных
секреторных везикул, большинство из которых вместо перемещения
на периферию и слияния с плазмалеммой остаются в местах их
образования или в контакте с цитоплазматическими органеллами
(например, с митохондриями). Часть таких гипертрофированных
везикул сливается с образованием массивных внутриклеточных
«депо» слизи. Подавление процесса перемещения созревающих
секреторных везикул к клеточной периферии часто коррелирует не
только с набуханием везикул, но и с исчезновением нормальных
диктиосом;
3. Дальнейшее увеличение времени экспозиции токсикантов с
растительными клетками вызывает ярко проявляющуюся и
необратимую деструкцию клеток и в результате гибель растения.
На основании многочисленных экспериментальных исследований
влияния различных токсикантов на ультраструктурную
организацию клетки можно выделить три уровня концентрации
ксенобиотиков в зависимости от степени воздействия на
растительную клетку:
• при метаболической концентрации токсичных соединений в
ультраструктуре клетки не отмечается видимых отклонений от
нормы. Эта доза соответствует наиболее часто встречающейся
в природе концентрации антропогенных органических
токсикантов;
• концентрация, ингибирующая клеточные процессы,
приводит к заметным изменениям в ультраструктуре клетки, нарушению биосинтеза нуклеиновых кислот и кальциевого
гомеостаза;
• летальная концентрация ведет к полной деструкции клетки
и гибели растения.
• Все известные токсичные соединения в различной степени
изменяют строение растительной клетки.
• Несмотря на то что при низких, так называемых
метаболических, концентрациях токсиканты не меняют
цитологию клетки, несомненно, что и в этом случае в
ультраструктуре клеток имеют место некоторые обратимые
отклонения от нормы (например, расширение
периплазматического пространства, уменьшение количества
плазмодесм или их полное исчезновение, увеличение объема
эндоплазматической сети и т.д.).
Процессы, способствущие обезвреживанию токсичных
соединений и их удалению из клетки
• Депонирование проникших в клетку ксенобиотиков в вакуолях (в
вакуолях в основном складируются частично превращенные токсиканты;
чаще всего они являются конъюгатами ксенобиотиков и/или промежуточных
продуктов их превращений с эндогенными соединениями (белками,
пептидами, аминокислотами, низкомолекулярными сахарами и т. д ). Под
действием токсикантов размеры вакуолей значительно увеличиваются. В
процессе конъюгации токсикантов, кроме интенсификации процесса
вакуолизации, часто наблюдаются слияние вакуолей малых размеров и
образование из них более крупных органелл, которые занимают довольно
большое внутриклеточное пространство растительной клетки. При снижении
в цитоплазме концентрации токсичных соединений, клетка регулирует вынос
токсичных остатков из вакуолей в цитоплазму, а затем и межклеточное
пространство.
• В растительных клетках под воздействием токсичных
соединений увеличивается количество рибосом, что, очевидно,
связано с усилением процесса биосинтеза белков. Усиление
биосинтеза белков должно способствовать, с одной стороны,
сбалансированию дефицита белков, израсходованных во время их
конъюгации с токсичными соединениями и их метаболитами, а с другой
стороны, способствовать индукции ферментов, участвующих в
детоксикационных процессах.
• «Митохондриальный контроль» над окислением ксенобиотиков –
координация энергетического обмена (энергия поставляется в виде
электронов, а не АТФ)
Трансформация антропогенных токсикантов в
растительной клетке
Растения наряду с другими защитными механизмами обладают
определенным набором биохимических и физиологических
процессов, с помощью которых они противостоят токсичным
проявлениям чужеродных веществ:
• экскреция;
• конъюгация токсичных соединений с внутриклеточными
соединениями с дальнейшей компартментализацией
конъюгатов;
• деградация токсикантов до стандартных клеточных
метаболитов и углекислого газа.
Чаще всего ксенобиотики проникают в клетки и подвергаются
ферментативным превращениям, приводящим к уменьшению
степени их токсичности. На сегодняшний день рассматривают три
последовательные фазы трансформации, которым подвергаются
токсичные соединения в растительной клетке:
1. Функционализация – это процесс, когда молекула гидрофобного органического ксенобиотика за счет ферментативных
превращений (окисление, восстановление, гидролиз и т. д.)
приобретает гидрофильную функциональную группу
(гидроксильную, аминную, карбоксильную и т.д.). В результате
функционализации полярность и реакционная способность
молекул токсиканта значительно увеличиваются. В то же время
эти превращения способствуют повышению сродства
образованных метаболитов к ферментам, катализирующим их
дальнейшие превращения (конъюгация или глубокое
окисление). В определенных случаях происходит окислительная
деградация токсиканта до стандартных клеточных метаболитов
и в конечном итоге до СО2. Этим путем растительная клетка не
только полностью обезвреживает токсичность чужеродных
соединений, но и использует их углеродные атомы для
собственных пластических и энергетических целей.
Совокупность таких превращений и составляет сущность
растительных детоксикационных процессов.
2. Конъюгация – это внутриклеточный процесс, в результате
которого происходит химическое сочетание токсикантов с
эндогенными веществами клетки (белками, пептидами,
аминокислотами, органическими кислотами,
низкомолекулярными сахарами и полисахаридами,
пектиновыми веществами, лигнином и т. д.) за счет
образования пептидных, эфирных, сложноэфирных и других
связей ковалентной природы. Процессу конъюгации
подвергаются промежуточные продукты превращения
ксенобиотиков или сами ксенобиотики, изначально имеющие
функциональные группы, которые способны реагировать с
внутриклеточными соединениями. Образование конъюгатов
приводит к значительному возрастанию гидрофильности
органического токсиканта и, следовательно, повышению его
подвижности. Такие свойства облегчают процессы дальнейшей
компартментализации трансформированных токсичных
соединений.
3.
Компартментализация – в большинстве случаев конечный
этап «складирования» токсичных соединений в определенных
клеточных структурах. Обычно растворимые конъюгаты
аккумулируются в вакуолях, а нерастворимые конъюгаты с
пектином, лигнином, гемицеллюлозой или другими
полисахаридами выносятся из клетки экзоцитозным
процессом и накапливаются в клеточной стенке.
Трансформация 2,3,4,5,6-пентахлорфенола в растительной клетке
В начальных реакциях химической модификации токсичных
соединений участвуют следующие ферменты:
• оксидазы, катализирующие гидроксилирование,
деметилирование и другие окислительные реакции, такие как
цитохром Р450-содержащие монооксигеназы, пероксидазы,
фенолоксидазы, аскорбатоксидазы, каталазы, и т.д.;
• редуктазы, катализирующие восстановление нитрогрупп
(нитроредуктазы);
• дегалогеназы, отщепляющие атомы галогенов от
полигалогенизированных токсичных соединений;
• эстеразы, гидролизирующие эфирные связи в пестицидах и
других токсичных соединениях.
Процессы второй фазы детоксикации – реакции конъюгации
токсикантов с внутриклеточными соединениями катализируются
трансферазами (глутатион-S-трансферазой,
глюкуронозилтрансферазой и др.).
Компартментализация конъюгатов происходит с участием АТРсвязывающих кассетных транспортеров (АКТ). В зависимости от
структуры ксенобиотиков другие ферменты могут также участвовать
на различных этапах внутриклеточного окисления токсичных
веществ.