ЦИТОЛОГИЯ Предмет и методы цитологии. История развития

ЦИТОЛОГИЯ
Лекция 1. Предмет и
методы цитологии.
История развития
учения о клетке.
Цитология – наука о клетке, ее функциях,
структуре, закономерностях развития, наука
о микроскопическом и субмикроскопическом
строении организма.
Методы цитологии



Микроскопический – световая
микроскопия; электронная микроскопия;
фазово-контрастная микроскопия;
флуоресцентная микроскопия…
Цито-, гистохимический;
Метод культивирования in vitro клеток,
тканей на искусственных питательных
средах.
История развития цитологии
Развитие оптики




Оптические свойства изогнутых поверхностей
(Евклид, 300 л. до н.э.; Птоломей 121-157 гг.).
Изобретение первых очков (Арлеати, 1285).
Изобретение лупы и использование для изучения
мелких объектов (Л. Да Винчи, Мауролико, XVI).
Первый микроскоп – две линзы внутри одной
трубки, увеличение от 3 до 10 раз (братья
Янсены).
Микроскоп
от греческих
«микрос» небольшой и
«скопео» рассматриваю.
Открытие клетки
Роберт Гук
1650 г.
Клеточная теория
Бактерии, грибы, водоросли
имеют клеточную структуру
Антони Ван Левенгук
(Левенгук, 1673).
 Открытие ядра (Броун, 1831).
 Открытие протоплазмы (Пуркинье, 1839).
 Ядро и цитоплазма важнейшие компоненты
клетки (Моль, 1847).
 Клеточная теория (Шлейден, 1838; Шван, 1839).
 Теория целлюларной патологии (Вирхов, 1859).

Положения клеточной теории




Клетка – есть последний
морфологический элемент, способный к
жизнедеятельности.
Каждая клетка возникает только от клетки.
Вне клетки ничего живого не может
возникнуть de novo. Жизнь начинается
только с клетки.
Организм – есть сумма клеток.
М. Шлейден
Х. Моль
Микроскоп Левенгука
Развитие
микроскопов
Развитие
микроскопов
Развитие
микроскопов
Отечественные ученые - цитологи







С.Г. Навашин (двойное оплодотворение).
И. Чистяков (митоз).
В. Беляев (мейоз).
Н. Горожанкин (оплодотворение).
М.С. Навашин (кариология, морфология
хромосом).
Г.А. Левитский (цитогенетика).
Л.П. Бреславец (первый учебник по цитологии).
Значение цитологии для генетики и
селекции




Цитогенетика.
Слияние протопластов.
Клеточная селекция.
Гаметная селекция.
Методы наблюдений







Метод светлого поля.
Метод фазового контраста.
Метод темного поля.
Методы наблюдения в поляризованном
свете.
Флуоресцентная микроскопия.
Конфокальная микроскопия.
Электронная микроскопия.
Устройство микроскопа
Устройство
светового микроскопа
Устройство микроскопа
Микмед-1 с встроенным
осветителем: 1 – окуляры;
2 – бинокулярная насадка;
3 – револьверное
устройство; 4 – объектив;
5 – предметный столик; 6
– конденсор; 7 – корпус
коллекторной линзы; 8 –
патрон с лампой; 9 –
шарнир.
Устройство
светового микроскопа
Бинокулярная насадка
Окуляры
Устройство
светового микроскопа
Револьверное устройство
Объективы
Устройство
светового микроскопа
Разрешающая
способность объектива
– способность давать
раздельное изображение
точек объекта,
расположенных близко
друг к другу.
Зависит от нумерической
апертуры и длины волны.
d

NA
NA=n×sinα
Устройство
светового микроскопа
Иммерсионные системы.
Устройство
светового микроскопа
Выбор окуляра для работы микроскопа
(правило подбора окуляра) должен
производиться так, чтобы общее
увеличение микроскопа не превышало
величину 1000 NA, т. е. предельную
величину полезного увеличения
микроскопа.
Устройство
светового микроскопа
Аберрации оптики микроскопа:
 Сферическая аберрация – изображение точки передается в виде
кружка рассеяния.
 Астигматизм – изображение точки передается в виде кружка
рассеяния эллипсоидной формы.
 Кома – резкость изображения снижается от центра к границе поля
зрения.
 Кривизна поля зрения не позволяет одновременно видеть резко
центр и края поля зрения.
 Дисторсия – нарушение подобия между объектом и его
изображением вследствие разного линейного увеличения на краях и
в центре поля зрения.
 Хроматизм положения – изображения, созданные разными
цветами, располагаются на разном расстоянии от оптической
системы.
 Хроматизм увеличения – изображения находятся в одной
плоскости, но имеют неодинаковые размеры.
Метод светлого поля




Прозрачные объекты – исследования в
проходящем свете, непрозрачные – в
отраженном свете.
Окрашенные объекты.
Предельное полезное увеличение – 1600 раз.

d

Разрешающая способность
NA
при косом освещении: d 

2 NA
Метод темного поля




Изображение создается за счет
дифракции световых волн,
возникающей на границах
мельчайших частиц .
Используется для исследования
живых объектов, а также
выявления живых и неживых
объектов при совместном
наблюдении.
Применяется специальный
конденсор.
Разрешающая способность выше,
чем при светлом поле (d=20NA)
Метод темного поля
Диатомовая водоросль
http://micro.magnet.fsu.edu
Метод темного поля
Часть крыла бабочки
http://micro.magnet.fsu.edu
Метод темного поля
Кристаллическая ДНК
концентрированный раствор
http://micro.magnet.fsu.edu
Фазово-контрастная микроскопия
•Принцип метода: изменение фазы
света и снижение интенсивности света
нулевого порядка и в результате
уравнивание его с другими порядками.
•Используется для исследования как
живых, неокрашенных объектов, так и
окрашенных.
•Применяется специальный конденсор
(либо пластина, вставляемая в него),
специальный объектив и
вспомогательный микроскоп.
Фазово-контрастная микроскопия
Фазово-контрастная микроскопия
Пыльца в фазовом
контрасте
http://micro.magnet.fsu.edu
Фазово-контрастная микроскопия
Пустула листовой ржавчины
на листе пшеницы в
фазовом контрасте
http://micro.magnet.fsu.edu
Повышение контраста
•
•
•
•
Использование специальных устройств;
Использование красителей;
Использование светофильтров;
Использование механизмов микроскопа.
Интерференционная микроскопия
•Принцип: разложение
света и использование
определенных пучков.
•Используется для
изучения поверхности
объекта, для определения
концентрации веществ,
определения толщины
объекта.
•Применяются
специальные специальные
объективы для
интерференционных
наблюдений.
http://micro.magnet.fsu.edu
Интерференционная микроскопия
Зародыш курицы
http://micro.magnet.fsu.edu
Интерференционная микроскопия
Мейоз у лягушки
http://micro.magnet.fsu.edu
Интерференционная микроскопия
Мейоз у лилии
http://micro.magnet.fsu.edu
Сравнение интерференционной
микроскопии и фазового контраста
ФК
DIC
Диатомовые водоросли
http://micro.magnet.fsu.edu
Сравнение интерференционной
микроскопии и фазового контраста
ФК
DIC
Tilia
http://micro.magnet.fsu.edu
Сравнение интерференционной
микроскопии и фазового контраста
Мейоз у лягушки
http://micro.magnet.fsu.edu
Поляризованный свет
http://micro.magnet.fsu.edu
Поляризованный свет
нефрит
гранит
http://micro.magnet.fsu.edu
глауконит
Поляризованный свет
хлопчатник
лён
Волокна хлопчатника, льна,
конопли
http://micro.magnet.fsu.edu
конопля
Флуоресцентная микроскопия
•Принцип: способность
некоторых веществ за счет
поглощения коротких длин
света.
•Используется для выявления
флуоресцирующих пигментов
(хлорофилла), витаминов,
жиров, пыльцы (первичная
люминесценция) и для
окрашивания флуорохромами
(акридин оранжевый – ДНК
окрашивается в зеленый, РНК в
красный цвет.
•Разрешающая способность до
1000 раз выше.
Флуоресцентная микроскопия
•Применяются
специальные микроскопы,
имеющие источник
освещения светом
коротких длин волны,
комплекты светофильтров.
•Флуоресцентная
гибридизация in situ - FISH,
GISH.
http://micro.magnet.fsu.edu
Флуоресцентная микроскопия
http://micro.magnet.fsu.edu
Флуоресцентная микроскопия
24-цветная 3D-FISH: нормальные
ядра фибробластов человека
Bolzer et al, 2004
Конфокальная сканирующая
микроскопия
Основана на удалении
фонового света,
который снижает
разрешение и ухудшает
изображение
оптических срезов.
Используется вместе с
флуоресцентной
микроскопией.
http://micro.magnet.fsu.edu
Конфокальная сканирующая
микроскопия
Конфокальная микроскопия
http://micro.magnet.fsu.edu
Трехмерная реконструкция оптических
срезов на примере пыльцевого зерна
http://micro.magnet.fsu.edu
Электронная микроскопия



Принцип: изображение создается
пучком электронов,
воспринимаемых электромагнитной
линзой.
Просвечивающая электронная
микроскопия (ПЭМ) и сканирующая
ЭМ.
Предельный уровень разрешения
0,1 нм – ПЭМ, 2-3 нм – СЭМ.
Живые клетки печени зеленой
африканской обезьяны
http://micro.magnet.fsu.edu
Амёба
http://micro.magnet.fsu.edu
Эвглена
http://micro.magnet.fsu.edu