Проблемы долговременного культивирования клеток человека

Проблемы
долговременного
культивирования клеток
человека и животных
Егоров Егор Евгеньевич
доктор биологических наук, профессор,
ведущий научный сотрудник Института
молекулярной биологии им.
В.А.Энгельгардта РАН
Смертные и бессмертные клетки
1890-е годы. Клетки асцитной опухоли
1913 г. Каррель
1961 г. Хейфлик
Всегда можно было предположить, что какое-либо новое
усовершенствование техники культивирования снимет
ограничения пролиферативного потенциала, и клетки
мортальные станут иммортальными.
Cуществует некий счетчик, ограничивающий общее
количество делений, отпущенных данной клетке.
Схема маргинотомической редупликации ДНК (по Оловникову, 1971).
Открытие теломеразы
1985 г. Грейдер и Блекборн.
1989 г. В клетках человека.
Теломеразы - являются рибонуклеиновыми ферментами.
РНК-компонент теломеразы содержит короткий район
(матрицу), комплементарный теломерной ДНК.
Cоматические клетки лишены теломеразной активности.
Их теломеры укорачиваются, как в процессе онтогенеза,
так и при культивировании клеток in vitro.
В иммортальных, в том числе в половых клетках есть
теломеразная активность, и не происходит укорачивания
теломер.
Схема действия теломеразы.
При аутосомно-доминантном варианте
наследственного дискератоза, происходят мутации
РНК, что приводит к снижению теломеразной
активности, укорачиванию теломер, и развитию
преждевременного старения в высоко
пролиферирующих тканях.
антисипация
Причины миелодиспластических синдромов
Каталитическая субъединица теломеразы представитель древнего семейства обратных
транскриптаз (ОТ)
hTERT (human telomerase reverse transcriptase).
Отличается от других ОТ наличием
последовательности, называемой “T-мотив’’
Гомологии обратных транскриптаз. Т - теломеразные
мотивы;.
Эволюционное дерево обратных транскриптаз.
Структура гена hTERT.
Черным обозначены экзоны, серым - нетранслируемые районы. Т теломеразный мотив, 1, 2, A, B’, C, D, E - мотивы обратных
транскриптаз. 1, α, β, 2,3,4 - сайты альтернативного сплайсинга.
МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ТЕЛОМЕРАЗНОЙ
АКТИВНОСТИ
Амплификация гена hTERT
Альтернативный сплайсинг hTERT
Метилирование не ответственно за репрессию hTERT в
соматических клетках.
Некоторые раковые клеточные линии,
экспрессирующие hTERT, обладают
гиперметилированными промоторными районами
hTERT.
Промоторная область hTERT.
Среди факторов транскрипции, известных как
активаторы hTERT, онкобелок c-Myc является
наиболее хорошо изученным.
Считают, что белок вируса папилломы E6 способен
активировать транскрипцию hTERT совместно с с-Myc.
Негативные регуляторы hTERT, это факторы
транскрипции MZF-2, p53, Menin и Mad1.
Menin (продукт гена опухолевого супрессора MEN 1).
Мутации в гене MEN1 приводят к множественным
эндокринным неоплазиям (MEN). Подавление
транскрипции Menin вызывает активацию
транскрипции hTERT, появление теломеразной
активности, удлинение теломер и иммортализацию
нормальных фибробластов человека.
Подавление!!! экспрессии hTERT может быть
стратегией вирусного канцерогенеза. Онкоген Tax
вируса Т-клеточной лейкемии человека (HTLV-1)
блокирует транскрипцию hTERT. Блокирование
теломеразы происходит на ранних стадиях
заражения лимфоцитов, что вместе с
бесконтрольным усилением пролиферации и
инактивацией p53 способствует быстрому
накоплению мутаций и, в дальнейшем, к раковой
эволюции клеток.
ТЕЛОМЕРЫ
Цитологи называют теломерами концевые участки
хромосом, видимые в световом микроскопе. Это
очень большие структуры, охватывающие районы в
миллионы пар оснований ДНК.
Молекулярные биологи имеют дело со значительно
меньшим концевым районом хромосомы,
перекрывающим тысячи нуклеотидных пар. Именно с
этими теломерами оперирует теломерная теория.
Разнообразие теломерной ДНК
субъединица теломерного повтора
Организм
Все позвоночные, Nicotiana tabacum и виды
TTAGGG
Aloe,Physarum polycephalum, Didimium
iridis,Histoplasma capsulatum,Trypanosoma brucei,два
вида класса Polychaeta, некоторые муравьи и
ракообразное Asellus aquaticus
TTTAGGG
Растения: Arabidopsis thaliana, рожь, кукуруза,
ячмень, пшеница
TTTTAGGG
Chlamydomonas reinhardtii
TTAGG
Большинство насекомых, некоторые ракообразные
TTAGGC
Нематоды, Caenorhabditis elegans
TTGGGG
Tetrahymena thermophila
TTTTGGGG
Euplotes crassus
G1-8A
Dictyostelium discoideum
TG2-3(TG)1-6
Saccharomyces cerevisiae
Повтор 53 нуклеотида
Tetrahymena thermophila (митохондриальная ДНК)
Повтор 350 нуклеотидов
Chironomus tentans
Повтор 375 нуклеотидов
Лук (Allium cepa) и некоторые лилейные
Ретротранспозоны HeT-A (~6 kb) и
TART (~10 kb)
Drosophila melanogaster
Согласно теории
недорепликации,
образуется только
один
одноцепочечный
участок на две
новосинтезирован
ные теломеры.
Расчеты показывают, что
последовательности, содержащие
повторяющиеся кластеры GGG
могут легко образовывать
неканонические структуры
(триплексы, квадруплексы).
Гуанины внутри тетрады
стабилизируются Хугстеновскими
водородными связями.
Планарная структура из 4
гуанинов,
стабилизированная
Хугстеновскими
водородными связями.
Возможное
участие квадруплексов в
биологических процессах
Различные варианты G-4 структур.
Теломерная ДНК формирует петли. В силу ограничения
свободного вращения, ДНК в петле имеет напряженную
конформацию. При укорачивании теломерной ДНК
вследствии недорепликации, наступает момент, когда
длина теломерного повтора не позволяет образоваться
петле. Теломерный конец ДНК приобретает свободную
конформацию, которая воспринимается клеткой, как сигнал
повреждения. В результате запускается механизм
пролиферативного старения клеток.
М1-М2 гипотеза иммортализации клеток человека
Белки различных опухолевых ДНК-содержащих
вирусов способны увеличивать пролиферативный
потенциал клеток человека и тем самым обходить
(отменять) М1. Этими свойствами обладают Тантиген SV40, антигены Е6/Е7 вируса папилломы
человека типа 16, антигены Е1а/Е1в аденовируса
типа 5.
В реализации М1 участвуют белки р53 и рRb.
Вероятно пролиферативный блок при М1
опосредуется факторами типа р21, которые
подавляют активность комплексов циклин/CDK.
Обход (отмена) М1 позволяет клеткам
пролиферировать дополнительное время (для
фибробластов человека - около 30-40 удвоений
популяции), пока второй механизм (М2) не вызовет
состояние кризиса.
Кризис характеризуется процессом пролиферации,
сопровождающимся массовой гибелью клеток. При
этом размер популяции какое-то время может быть
стабильным. С низкой вероятностью после кризиса
могут возникнуть иммортальные клетки.
ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
Механизмы старения в кризисных клетках либо
инактивированы, либо уничтожены.
Бессмертные клетки человека в культуре появляются
только после продолжительного пребывания в
состоянии кризиса.
Частота спонтанной трансформации диплоидных
фибробластов человека примерно на порядок ниже
частоты спонтанного мутационного события.
Реактивация теломеразы происходит в 85% опухолей.
Клетки не нуждаются в теломеразной активности на ранних
стадиях канцерогенеза, поскольку имеют достаточной длины
теломеры.
Большинство опухолевых клеток человека изначально начинают
пролиферацию из-за изменений в регуляции роста, но не из-за
реактивации теломеразы.
КРИЗИС (M2)
Механизмы, ограничивающие рост клеток во время кризиса,
когда происходит чрезвычайное (полное) укорачивание
теломер отличаются от механизмов остановки пролиферации
во время старения, когда длина теломер составляет несколько
тысяч оснований.
Кризис начинается, когда отдельные, самые короткие теломеры
полностью исчезают. Дальнейшее укорачивание прямо или
косвенно ведет к потерям генетического материала,
несовместимым с жизнью клетки.
В любой момент в клетке существует самая короткая
теломера. Процесс репликации такой теломеры приводит к
образованию полной копии и укороченной. Клетка с
укороченной копией умирает, в то время как другая клетка
продолжает размножаться.
Процесс повторяется.
Гипотеза,
объясняющая
длительное
поддержание
размера
популяции во
время кризиса.
Теломеры кризисных клеток воспринимаются
клеткой как двуцепочечные разрывы.
Эти разрывы чиняться путем теломерных
слияний.
Образуются дицентрики.
Происходят ряд событий слияние-мостразрыв
Многократно возрастает генетическая
изменчивость
Облегчается реактивация теломеразы
РОЛЬ РЕПРЕССИИ ТЕЛОМЕРАЗЫ В ПРОТИВОРАКОВОЙ ЗАЩИТЕ.
Последовательные этапы клонирования при
развитии опухоли.
2 50 = 1 тонна
Если положить, что в среднем частота мутаций 1 на
106 клеток, то каждое такое событие потребует
примерно 20 генераций (220 = 106). Значит, для
образования опухоли потребуется, в среднем, от 60
до 140 генераций.
Как видно, ограничение в 50 удвоений вполне
достаточно для остановки роста большинства
опухолей на еще не диагностируемых стадиях.
Поскольку примерно 90% опухолей человека обладают
теломеразной активностью, можно утверждать, что реактивация
теломеразы участвует в канцерогенезе.
Прямым свидетельством в пользу этого является обнаружение
онкогена, кодирующего субъединицу теломеразы у куриного вируса
болезни Марека (опухоль).
Хотя сама по себе экспрессия теломеразы не нарушает регуляцию
роста клеток, однако она является “разрешением” для разного
рода измененных клеток эволюционировать в составе организма.
Такая эволюция неизбежно приводит к злокачественной опухоли.
Почему репрессия теломеразы ненадежна в клетках
мыши, а в клетках мелких холоднокровных организмов
(рыб, раков) она вообще отсутствует?
Если сравнить человека и мышь в единицах клеткаделение, то мы получим различия примерно в 100 000
раз.
Если не принимать в учет проблемы, связанной с
канцерогенезом, то экспрессия теломеразы
является позитивным признаком. Для клеток - это
поддержание стабильности генома, для организма это возможность регенерации.
В эволюции должна вырабатываться некая средняя
стратегия регулирования экспрессии теломеразы, в
зависимости от многих параметров:
продолжительности жизни, размера организма, его
температуры, метаболизма и пр.
Нетеломеразные способы удлинения теломер
ALT - альтернативные способы удлинения
теломер у человека
Примерно в 5% опухолей человека теломеры
поддерживаются без участия теломеразы. Необычайно
высокая доля ALT обнаружена в мультиформных
глиобластомах - 25%.
Значение теломеразы в диагностике опухолей
Способы подавления опухолей, опосредованные
теломерами и теломеразой
Иммунотерапия
Использование промоторов теломеразы
Быстрый запуск репликативного старения
Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды
Введение в клетки гена, кодирующего
антисмысловую последовательность к РНК
компоненту теломеразы
Введение в клетки олигонуклеотидов,
комплементарных РНК компоненту теломеразы.
РНК-интерференция
Блокирование сборки теломеразы
Ненуклеотидные мелкие молекулы ингибиторы теломеразы
теломестатин
Принцип подавления теломеразы соединениями,
стабилизирующими квадруплексы.
ТЕЛОМЕРИЗАЦИЯ КЛЕТОК
Теломеризация не ведет к злокачественной
трансформации
Теломеризация не только иммортализует клетки, но и
меняет экспрессию ряда генов.
increased expression of active b-catenin (Wnt pathway )
Теломераза влияет на работу митохондрий.
В 2001г. были подобраны условия культивирования,
при которых эпителиальные клетки
иммортализуются при помощи введения только
одного гена hTERT.
Клетки надпочечников
Теломеризованные клетки оказались способными формировать
функциональную ткань надпочечников при трансплантации в мышей
SCID.
Стромальные клетки костного мозга
Клетки поджелудочной железы
Клетки печени
Хондроциты
Бета-клетки островков Лангерганса,
лечение диабета
Telomerase gene therapy in adult and old mice delays aging
and increases longevity without increasing cancer
Bruno Bernardes de Jesus
Elsa Vera
Kerstin Schneeberger
Agueda M. Tejera
Eduard Ayuso
Fatima Bosch
Maria A. Blasco
EMBO Mol Med
2012, 4, 1–14
Increased median and
maximum
longevity of AAV9mTERT treated mice.
insulin sensitivity,
osteoporosis,
neuromuscular
coordination and several
molecular biomarkers of
aging