Использование тест-объекта TETRAHYMENA PYRIFORMIS для

«ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ТЕНДЕНЦИИ ПОВЫШЕНИЯ
ПРОМЫШЛЕННОЙ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ,
ОХРАНЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ, РАЦИОНАЛЬНОЙ И
ЭФФЕКТИВНОЙ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЧЕЛОВЕКА»
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТА
TETRAHYMENA PYRIFORMIS ДЛЯ ОЦЕНКИ
ТОКСИЧНОСТИ ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА
Петрова С.Ю., Гомолко Т.Н., Ильюкова И.И.
ГУ «Республиканский научно-практический центр гигиены», 220012, г. Минск, ул.
Академическая, 8, тел. (+375 17) 284 13 70, e-mail: toxlab@mail.ru
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТА TETRAHYMENA PYRIFORMIS ДЛЯ
ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА
• Отходы – это все вещества или предметы, от которых
стремится избавиться их хозяин по собственной воле
или по требованиям властей.
• Промышленные отходы (ПО, отходы производства) –
остатки сырья, материалов, полуфабрикатов,
образовавшиеся при производстве продукции или
выполнении работ и утратившие полностью или
частично исходные потребительские свойства, вновь
образующиеся в процессе производства попутные
вещества, не находящие применения.
2
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТА TETRAHYMENA PYRIFORMIS ДЛЯ
ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА
• В Республике Беларусь Закон «ОБ ОБРАЩЕНИИ С
ОТХОДАМИ» от 20 июля 2007 г. N 271-З (в ред. Законов
Республики Беларусь от 08.07.2008 N 367-З, от 28.12.2009 N 93З, от 22.12.2011 N 328-З, от 07.01.2012 N 340-З, от 12.12.2012 N
6-З)
определяет правовые основы обращения с отходами и
направлен на уменьшение объемов образования отходов и
предотвращение их вредного воздействия на окружающую
среду, здоровье граждан, имущество, находящееся в
собственности государства, имущество юридических и физических
лиц, а также на максимальное вовлечение отходов в гражданский
оборот в качестве вторичного сырья.
3
Статья 4. Основные принципы в области обращения с отходами
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
обязательность изучения опасных свойств отходов и установления
степени опасности отходов и класса опасности опасных отходов;
нормирование образования отходов производства, а также установление
лимитов хранения и лимитов захоронения отходов производства;
использование новейших научно-технических достижений при обращении с
отходами;
приоритетность использования отходов по отношению к их обезвреживанию
или захоронению при условии соблюдения требований законодательства об
охране окружающей среды и с учетом экономической эффективности;
приоритетность обезвреживания отходов по отношению к их захоронению;
экономическое стимулирование в области обращения с отходами;
платность размещения отходов производства;
ответственность за нарушение природоохранных требований при обращении
с отходами;
возмещение вреда, причиненного при обращении с отходами окружающей
среде, здоровью граждан, имуществу;
обеспечение юридическим и физическим лицам, в том числе
индивидуальным предпринимателям, доступа к информации в области 4
обращения с отходами.
Статья 15. Классификация отходов
Отходы, в том числе коммунальные отходы, разделяются
по видам в зависимости от:
• происхождения - на отходы производства и отходы
потребления;
• агрегатного состояния - на твердые отходы и жидкие
отходы;
• степени опасности - на опасные отходы и неопасные
отходы;
• возможности их использования - на вторичные
материальные ресурсы и иные отходы производства и
потребления.
5
Классификация отходов
Опасные отходы – отходы, которые содержат в своем
составе вещества, обладающие каким-либо опасным
свойством
или
их
совокупностью
(токсичность,
инфекционность,
взрывоопасность,
пожароопасность,
высокая реакционная способность и (или) иные подобные
свойства) и присутствующие в таком количестве и в таком
виде, что эти отходы самостоятельно или при вступлении в
контакт с другими веществами могут представлять
непосредственную
или
потенциальную
опасность
причинения вреда окружающей среде, здоровью человека и
(или) имуществу лиц, в том числе вследствие их вредного
воздействия на окружающую среду.
6
Статья 15. Классификация отходов
Опасные отходы классифицируются по
классам опасности:
• первый класс опасности - чрезвычайно
опасные;
• второй класс опасности - высокоопасные;
• третий класс опасности - умеренно опасные;
• четвертый класс опасности - малоопасные.
7
Статья 16. Установление степени опасности
отходов и класса опасности опасных отходов
•
•
•
•
Степень опасности отходов производства и класс опасности опасных
отходов производства устанавливаются их производителями для всех
образующихся отходов производства, если степень опасности этих
отходов и класс опасности опасных отходов производства не указаны в
классификаторе отходов, образующихся в Республике Беларусь.
Установление степени опасности отходов и класса опасности опасных
отходов осуществляется на основании определения опасных для
окружающей среды, здоровья граждан, имущества свойств отходов
(токсичность, патогенность, взрывоопасность, пожароопасность,
высокая реакционная способность, способность при обезвреживании
образовывать стойкие органические загрязнители) и иных опасных
свойств отходов.
По результатам определения опасных свойств отходов оформляются и
выдаются заключения о степени опасности отходов и классе опасности
опасных отходов.
Класс опасности опасных отходов устанавливается исходя из
наиболее высокого класса опасности, определенного по результатам
исследования опасных свойств отходов.
8
Лаборатория профилактической и экологической
токсикологии ГУ «Республиканский научнопрактический центр гигиены»
аккредитована в Национальной системе аккредитации
Республики Беларусь на проведение работ по
определению токсичности и экотоксичности отходов
производства.
Аттестат аккредитации № ВY/112 02.1.0.0341. Срок
действия до 09.07.2015 г.
9
Лаборатория профилактической и экологической
токсикологии ГУ «Республиканский научнопрактический центр гигиены»
Исследования проводятся согласно
• Инструкции 2.1.7.11-12-42-2004 «Определение токсичности
отходов, содержащих органические вещества». Утверждена
Постановлением Главного государственного санитарного врача
Республики Беларусь 31 декабря 2004 г. № 164.
• Инструкции 2.1.7.11-12-3-2004 «Определение токсичности
металлсодержащих отходов». Утверждена Постановлением Главного
государственного санитарного врача Республики Беларусь 25
февраля 2004 г. № 27.
10
Согласно инструкциям обязательными при проведении
экспериментов по определению токсичности и
экотоксичности промышленных отходов являются:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
санитарно-химические исследования;
расчетный метод на основании санитарно-химических исследований;
токсикологические эксперименты на теплокровных животных в острых
и субхронических экспериментах;
токсикологические эксперименты на тест-объекте Tetrahymena
pyriformis;
изучение мутагенных свойств на модельных видах водных организмов;
изучение токсического воздействия отходов на тест-штаммы
микроорганизмов;
фитотоксический тест;
изучение водно-миграционного показателя (проводится по
необходимости при обнаружении водорастворимых соединений для
оценки миграции компонентов отхода в подземные водоисточники);
изучение цитотоксического действия на культуре фибробластов
(обязателен при получении положительных результатов в тесте Эймса
и тесте на водных организмах)
11
Объем токсикологических исследований отходов на
животных.
Исследования проводятся с целью установления класса
токсичности отхода и включают определение следующих
токсикологических показателей:
•DL50 при внутрижелудочном способе введения;
•DL50 при нанесении на кожу;
•CL50 при ингаляционном воздействии;
•ирритативное действие отходов (если pH отхода меньше 2 или больше 11,5 ирритативное действие
не изучается вследствие предсказуемости) с
обязательной пометкой в заключении о наличии раздражающего действия;
•местное раздражающее действие на кожные покровы (если pH отхода
меньше 2 или больше 11,5 - раздражающее действие
не изучается
вследствие предсказуемости) с обязательной пометкой в заключении о
наличии раздражающего действия;
•кумулятивные свойства и характер токсического действия отходов на
организм в условиях подострого эксперимента;
•сенсибилизирующее действие (при необходимости).
•Кроме того, в токсикологическое исследование могут быть включены и
дополнительные тесты, специфические для конкретного отхода.
12
Инфузория Tetrahymena
pyriformis относится к типу
Protozoa, классу Ciliata
(ресничные инфузории).
Свободноживущие
инфузории в воде и
почве этого класса
характеризуются сложной
организацией внутри
одной клетки, имеют
макро- и микроядро,
обеспечивающее обмен
генетической
информацией в
своеобразном половом
процессе (конъюгация).
13
Tetrahymena pyriformis имеет
удлиненную грушевидную
форму с более плоским
каудальным и слегка
заостренным вентральным
концом. Размер – 20х50 нм, вес
– 1,5х10-9 г. Клетка покрыта
двухслойной мембраной с
многочисленными порами: до
200 пор/мкм2. Инфузория имеет
ротовое отверстие с четырьмя
мембранами, глотку,
пищеварительные вакуоли,
сократительную вакуоль.
Штамм W в лабораторных
условиях микроядра не имеет,
но оно может появляться при
неблагоприятных воздействиях.
14
Преимущество одноклеточного организма Tetrahymena
pyriformis заключается в том, что
•
•
•
•
введенное в жидкую среду, где обитает инфузория, вещество
воздействует на нее не только изнутри, вследствие его заглатывания и
переваривания, но и снаружи, так как частично, в отличие от высших
животных, она питается и путем всасывания через свои мембраны,
покрытые многочисленными порами, простых пищевых веществ
(аминокислот, солей, витаминов).
на эти же оболочки действуют и вредные вещества возможно
присутствующие в исследуемом продукте.
В результате не только резко сокращается время выявления токсического
действия вещества, но и уменьшаются его количества, потребные для
таких целей, вплоть до минимальных уровней, не улавливаемых
организмом высших животных, имеющих более мощные механизмы
защиты от многих вредных факторов внешней среды.
Практика свидетельствует о высокой корреляции показателей токсичности,
полученных в экспериментах на белых крысах и Tetrahymena pyriformis.
15
Этапы и сроки токсикологической оценки
отходов производства на Tetrahymena
pyriformis.
• Первичная токсикологическая оценка отходов производства
осуществляется на популяции Tetrahymena pyriformis в
стационарной фазе роста. Эффект токсического действия
учитывается по реакции «жизнь-смерть».
• При проведении острого (3-6 часов) и подострого (24 часа)
экспериментов на основании расчета % летальности
устанавливаются основные параметры токсичности:
• ЛД16 – доза, вызывающая гибель 16% особей;
• ЛД50 – доза, вызывающая гибель 50% особей;
• ЛД84 – доза, вызывающая гибель 84% особей;
• Ккум – коэффициент кумуляции как частное между средней
смертельной дозой, полученной в подостром эксперименте и
средней смертельной дозой, полученной в остром
эксперименте.
• Общая длительность эксперимента – 2 рабочих дня.
16
Этапы и сроки токсикологической оценки
отходов производства на Tetrahymena
pyriformis.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
В хроническом эксперименте исследуются отходы, прошедшие
первичную токсикологическую оценку. Изучение токсичности отходов
производства в хроническом эксперименте осуществляется на
протяжении жизненного цикла популяции Tetrahymena pyriformis.
По результатам подсчета численности популяции в лаг-фазе,
логарифмической фазе, фазе замедленного роста и стационарном
состоянии рассчитывают показатели, характеризующие
закономерности роста популяций:
мгновенная скорость роста,
время генерации,
число поколений;
рассчитывают параметры угнетения роста популяции ЕД16, ЕД50, ЕД84,
коэффициент Ккум, кислотную резистентность, коэффициент
адаптагенности Кад, зону хронического действия Zchr.
На основании полученных данных определяют максимально
недействующую дозу (далее – МНД) и рассчитывают показатель
ЛД50/МНД.
Длительность хронического эксперимента 96 часов.
17
Этапы и сроки токсикологической оценки
отходов производства на Tetrahymena
pyriformis.
• Изучение токсичности отходов производства в
пролонгированном эксперименте осуществляется
при семикратном пересеве популяции Tetrahymena
pyriformis, культивируемой в среде, содержащей
исследуемый отход, в свежеприготовленную
среду, содержащую отход в тех же концентрациях.
• В пролонгированном эксперименте исследуются те
же показатели, что и в хроническом.
• Дополнительно рассчитывается показатель,
характеризующий резерв адаптационных
возможностей популяции – Рад.
• Длительность пролонгированного эксперимента
384 часа.
18
Этапы и сроки токсикологической оценки
отходов производства на Tetrahymena
pyriformis.
• Общий срок исследований по токсиколого-гигиенической
оценке отходов производства в остром, подостром и
хроническом экспериментах на Tetrahymena pyriformis – 1
месяц.
• Общий срок исследований по токсиколого-гигиенической
оценке отходов производства в остром, подостром,
хроническом и пролонгированном экспериментах на
Tetrahymena pyriformis – 2-3 месяца.
19
Токсикологическая классификация промышленных
отходов по результатам изучения их токсических
свойств на Tetrahymena pyriformis.
Отнесение отходов производства к классу
токсичности для Tetrahymena pyriformis
производят по показателю, значение которого
соответствует наиболее высокому классу по
«Классификации вредных веществ по степени
токсичности и опасности по результатам
изучения их токсических свойств на
Tetrahymena pyriformis».
20
Для ранжирования полученных результатов по классам
токсичности за основу принят ГОСТ 12.1.007-76
«Вредные вещества. Классификация и общие
требования безопасности».
Показатель
Классы по убывающей степени токсичности и
опасности
1
2
3
4
ЛД50, мг/мл
менее 0,1
0,1 – 1,0
1,1 – 20
более 20
Ккумac,
менее 0,1
0,10 – 0,30
0,31 – 0,50
более 0,50
Ккумchr.
ЛД50/МНД
более 106
10-6 – 105
105 – 104
менее 104
МНД, мг/мл
менее 10-6
10-6 – 10-4
10-4 – 10-1
более 10-1
21
Сравнительная оценка чувствительности
применяемых методов
Отход
По
расчитанному
индексу опасности
По
результатам
изучения
острой
токсичности
при
однократном
внутрижелудочном
введении
белым
крысам
На
тест-объекте
Tetrahymena
pyriformis
Фитотоксичнгость
(код
4 класс
IV класс опасности
3 класс
Не
оказывает
фитотоксического действия
отработанное
трансмиссионное
масло(код 5410206)
прочие сорбенты, не
вошедшие в группу VIII
Г (5964900)
5 класс
IV класс опасности
3 класс
Обладает
действием
4 класс
IV класс опасности
3 класс
Не
оказывают
фитотоксического действия
зола
от
сжигания
торфобрикетов
(код
3130400)
4 класс
IV класс опасности
3 класс
Не
оказывает
фитотоксического действия
зола и пыль (летучие)
топочных
установок
(код 3130100)
5 класс
IV класс опасности
3 класс
Не
оказывает
фитотоксического действия
отходы жиров (смазок)
и
парафинов
из
минеральных
масел
(код 5429900)
отходы
перлита
отработанного
с
азотнокислородных
установок осушки азота
(код 3143403)
4 класс
IV класс опасности
3 класс
Не
оказывают
фитотоксического действия
4 класс
IV класс опасности
3 класс
Не
оказывают
фитотоксического действия
отход
флюса
3991500)
фитотоксическим
22
Таким образом, применение тест-объекта Tetrahymena
pyriformis для определения токсичности отходов
производства отличается высокой чувствительностью,
экспрессностью, простотой использования, и что
немаловажно в наше время исследования не
дорогостоящи.
23
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!