CH3 N Физическая химия биополимеров Лаврик О.И. НГУ-2012 O 4. Ингибирование ферментативных реакций. Методы описания и определения констант ингибирования. Применение элементов теории графов для вывода кинетических уравнений в стационарном режиме Cкорость ферментативной реакции v Активаторы стимулируют каталитическую активность ферментов v Ингибиторы подавляют каталитическую активность ферментов Взаимодействуя с ферментом, ингибиторы по тому или иному механизму тормозят катализ, и, таким образом, уменьшают скорость ферментативной реакции. Природные ингибиторы – продукты биохимической цепи Ингибитор Малонат Сукцинат Фумарат Аллостерическое (от греч. "инопространственный") ингибирование В процессе окисления глюкозы происходит фосфорилирование АDР АТР, для накопления энергетических запасов клетки в виде АТР. При накоплении в системе достаточного количества АТР процесс целесообразно притормозить: АТР Фруктозо-6-фосфат АDP Фруктозо-1,6-дифосфат Аллостерическое (от греч. "инопространственный") ингибирование Каталитический центр АТР АТР АТР АТР Аллостерический центр Фосфорилирование Ингибирование фосфорилирования Искусственные ингибиторы – лекарства, подавляющие активность вредных ферментов O HN HO O N O N3 Противовирусный препарат азидотимидин – нуклеозид ингибирующего субстрата ревертазы ВИЧ, аналог природного субстрата Связывание ингибитора с ферментом Обратимое Необратимое Обратимое связывание ингибитора с ферментом Необратимое связывание ингибитора с ферментом Пример необратимого ингибитора – пара-хлормеркурийбензоат (р-ClHg-бензоат) р-ClHg-бензоат модифицирует фермент по функциональной группе в активном центре, ковалентно связываясь с SH-группой цистеина и блокируя активность фермента. O NH CH SH C O + ClHg CH COOH -HCl S Hg COOH Пример обратимого ингибитора Обратимые ингибиторы, как правило – аналоги субстратов. Фенилаланин Фенилаланинол Фенилаланинол – аналог фенилаланина, конкурентный ингибитор фенилаланил-тРНК-синтетазы Типы ингибирования 1. Конкурентное ингибирование, 2. Неконкурентное ингибирование, 3. Бесконкурентное ингибирование, 4. Смешанное ингибирование. k1,,k2,, k3, k4, k-1, k-2, k-3, k-4 – константы скорости соответствующих реакций, KS, KS', KI, KI' – константы диссоциации комплексов фермента с субстратом и/или ингибитором, γ, γ', δ – численные коэффициенты. Рассмотрен случай kβ = 0, то есть когда тройной комплекс ESI не распадается с образованием продукта. При этом скорость реакции образования продукта равна: v = kα[ES] (при [S]0, [I]0 >> [E]0). Конкурентное ингибирование (δ = γ = 0) V= Vmax KS [I ] 1 1 [S ] K I Неконкурентное ингибирование (δ = γ = 1, KS = KS', KI = KI') Vmax V= [I ] 1 KI KS 1 [S ] Смешанное ингибирование (δ = γ ≠ 1, KS ≠ KS', KI ≠ KI') Vmax V= 1 [ I ] K' I 1 [ I ] K I K S 1 [ S ] 1 [ I ] K' I Бесконкурентное ингибирование (δ = γ' = 0) Vmax [I ] 1 KI V= 1 KS 1 [I ] [S ] 1 KI Графические методы определения кинетических параметров реакции в присутствии ингибитора На приведенных ниже схематически изображенных графиках: V – максимальная скорость реакции, К – эффективная константа, полученная экспериментально, KI – константа ингибирования; а - конкурентное, б - неконкурентное, в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование. Метод Лайнуивера-Берка 1/v (1/[S]) I2 > I1, -1/K = -1/KM(1+[I]/KI) Vmax V= K [I ] 1 S 1 [S ] K I 1/v Vmax V= [I ] 1 KI KS 1 [S ] 1/v Vmax Vmax 1 [ I ] K'I V= 1 [ I ] KI KS 1 [ S ] 1 [ I ] K'I V= 1/v 1 1 [S ] [I ] 1 K I KS [I ] 1 K I 1/v 1/[S] а - конкурентное, б - неконкурентное, в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование - [I]=0 Метод Эди-Хофсти v (v/[S]) I2 > I1, tg α = -K = -KM(1+[I]/KI) Vmax V= K [I ] 1 S 1 [S ] K I v Vmax [I ] 1 K I KS 1 [S ] V= v Vmax Vmax 1 [ I ] K'I V= 1 [ I ] KI KS 1 [ S ] 1 [ I ] K'I V= v 1 1 [S ] [I ] 1 K I KS [I ] 1 K I v v/[S] а - конкурентное, б - неконкурентное, в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование - [I]=0 Метод Диксона 1/v([I]) S2 > S1 Vmax V= K [I ] 1 S 1 [S ] K I 1/v Vmax V= [I ] 1 K I KS 1 [S ] 1/v Vmax Vmax 1 [ I ] K'I V= 1 [ I ] KI KS 1 [ S ] 1 [ I ] K'I V= 1/v 1 1 [S ] [I ] 1 K I KS [I ] 1 K I 1/v [I] а - конкурентное, б - неконкурентное, в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование Метод Корниш-Боуден [S]/v ([I]) S2 > S 1 Vmax V= K [I ] 1 S 1 [S ] K I [S]/v Vmax V= [I ] 1 K I KS 1 [S ] [S]/v Vmax Vmax 1 [ I ] K'I V= 1 [ I ] KI KS 1 [ S ] 1 [ I ] K'I V= [S]/v 1 1 [S ] [I ] 1 K I KS [I ] 1 K I [S]/v [I] а - конкурентное, б - неконкурентное, в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование Применение теории графов в ферментативной кинетике Теория графов Задача, положившая начало развитию теории графов: как пройти по всем семи мостам, не проходя ни по одному дважды. Теорема Эйлера: если сеть имеет не более двух «странных» (с нечетным количеством связей) вершин, есть по крайней мере один подобный путь. Граф Эйлера, 1736 г. B B A D A D A C C Леонард Эйлер 1707-1783 Швейцарский и российский математик Теория графов Задача: пройти через все вершины по одному разу (номера вершин указывают последовательность шагов, прохождение каждого ребра не обязательно). Граф Гамильтона, 1859 г. Уильям Роуэн Гамильтон 1805-1865 Ирландский математик и физик Теория графов Граф – это схематическое изображение некоторого множества элементов и их взаимосвязей. Граф состоит из вершин – узлов и соединяющих их линий. В применении к ферментативной кинетике узлам сопоставляются ферментные формы. Ветви графа – линии, соединяющие узлы, имеют направление. Ветвям графа сопоставляются элементарные стадии ферментативной реакции. Вес ветви – число, характеризующее ветвь графа, эквивалентно константе скорости реакции. Путь графа – непрерывная совокупность ветвей, в которой ни одна из вершин не встречается более одного раза, не замкнутая (не должно быть циклов). База – одна из вершин. Базовое дерево – совокупность ветвей, проходящих через все узлы и ведущих к базе. Определитель узла (базы) (D) – сумма величин (базовых) деревьев. Скорость ферментативной реакции можно выразить формулой: v = E0 k D , D r r где kr – константа скорости реакции, приводящей к i образованию продукта. Теория графов. Пример 1: односубстратная ферментативная реакция Граф: kr = k2 Вес параллельных ветвей, ведущих от узла ES к узлу E, складывается: Dr = DES = k1S DE = k-1 + k2 k 2 k 1S v = E0 k 1S k -1 k 2 k 2E0 k k2 1 1 -1 k1 S Теория графов. Пример 2: конкурентное ингибирование Граф: Определители (Di) и их деревья: DES = k-ik1S DEI = k-1kiI + kiIk2 DE = k-ik-1 + k-ik2 k 2 k -i k 1S v = E0 k -i k 1S k i Ik -1 k 2 k -i k -1 k 2 Здесь константа ингибирования k 2E0 k 2E0 k -1 k 2 k i I k -i k k2 k 1 1 i 1 -1 k 1S k -i k 1S k -i k i k 1 k 2 KI , а KM ki k1 I Теория графов. Пример 3: бесконкурентное ингибирование Граф: Определители (Di) и их деревья: DES = k-ik1S DESI = k1SkiI DE = k-ik-1 + k-ik2 k 2E0 k 2 k -i k 1S v = E0 k -i k 1S k 1 k i SI k -i k -1 k -i k 2 k -1 k 2 k i I k -i k 1S k -i k k 2 E 0 / 1 i k -i k -1 k 2 1 k k 1S1 i k -i I I