российская академия наук - Институт биологии развития им. Н.К
реклама
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова На правах рукописи ПОДГОРНЫЙ ОЛЕГ ВЛАДИМИРОВИЧ Дифференцировка и поведение нейральных стволовых клеток человека в культуре ткани и при трансплантации в головной мозг крыс Специальность 03.00.30. – биология развития, эмбриология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2006 Работа выполнена в лаборатории экспериментальной нейробиологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Директор Института – доктор биологических наук, профессор Н.Д. Озернюк Научный руководитель: доктор биологических наук М.А. Александрова Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.Я. Бродский (ИБР РАН) доктор биологических наук А.В. Куликов (ИТЭБ РАН) Ведущая организация: Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова Защита состоится 2006 г. в часов. На заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26. Факс: (495) 135-80-12 E-mail: volina@proxima.idb.ac.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.) Автореферат разослан « Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук 2 » 2006 г. Е.В. Волина ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. В последнее время в нейробиологии особое внимание приковано к проблеме стволовых клеток в центральной нервной системе. На сегодняшний день окончательно утвердились представления о постоянном нейрогенезе в некоторых областях мозга млекопитающих, который обеспечивается за счет пула нейральных стволовых клеток (Doetsch et al., 1999; Palmer et al., 2000; Seri et al., 2001). Нейральные стволовые клетки определяют как клетки с неограниченным пролиферативным потенциалом, способные к самовоспроизведению и генерации мультипотентных потомков, которые в последствии дадут три основные ветви нейральной дифференцировки: нейроны, астроциты и олигодендроциты. Существенным шагом в изучении стволовых клеток стало их выделение и культивирование. В культуре in vitro стволовые клетки активно размножаются в условиях бессывороточных сред с ростовыми факторами, формируя свободноплавающие колонии шарообразной формы, которые называются нейросферами (Reynolds and Weiss, 1992; Lois and Alvarez-Buylla, 1993; Palmer et al., 1995; Weiss et al., 1996). Клонирование нейросфер дало инструмент для установления свойства «стволовости» у тех или иных первичных популяций нейральных клеток. Именно с помощью этого подхода было продемонстрировано, что некоторые области развивающегося и зрелого мозга млекопитающих, включая человека, содержат пулы нейральных стволовых клеток (Reynolds and Weiss, 1996; Carpenter et al., 1999; Kukekov et al., 1999; Pagano et al., 2000; Vescovi et al., 1999). С одной стороны, культивирование нейральных стволовых клеток позволяет поновому подойти к проблемам исследований дифференцировки клеток нервной системы, а с другой – развить идею о применении клеточной терапии для лечения различных патологий центральной нервной системы. Проведенные многочисленные исследования показали, что культуры нейральных стволовых клеток гетерогенны (Mokry et al., 1996; Carpenter et al., 1999; Kukekov et al., 1999; Vescovi et al., 1999; Suslov et al., 2002; Bez et al., 2003; Lobo et al., 2003), и эта гетерогенность обусловлена многими факторами. По этой причине такие культуры стали называть популяциями нейральных стволовых/прогениторных клеток (НСПК). Здесь возникает вопрос о стандартизации методов их выращивания и способов получения их характеристик. Этот вопрос является особенно принципиальным по отношению к культурам клеток человека. Кроме того, анализ культур in vitro может быть недостаточным для оценки их потенциальной значимости для практического применения, и поэтому необходимо учитывать результаты трансплантационных исследований на моделях повреждений мозга у животных. Нейротрансплантация уже достаточно давно рассматривается как перспективный подход для коррекции патологических состояний мозга. В 70-х и 80-х годах прошлого столетия эксперименты с трансплантацией эмбриональной нервной - Список сокращений приведен на последней странице. 3 ткани показали большую эффективность этого подхода как в фундаментальных вопросах нейральной дифференцировки, так и для практических целей. На сегодняшний день именно пересадка культур нейральных стволовых клеток стала новым этапом развития направления, связанного с нейротрансплантацией (Svendsen et al., 1996; Lundberg et al., 1997; Snyder et al., 1997; Brock et al., 1998; Fricker et al., 1999; Vescovi et al., 1999; Auerbach et al., 2000; Rubio et al., 2000; Akiyama et al., 2001; Ogawa et al., 2002; Enomoto et al., 2003). Анализ переживания и поведения клеток после трансплантации, а также их влияния на компенсаторные процессы на экспериментальных моделях повреждения мозга у животных является основной задачей исследований по нейротрансплантации. Однако для предполагаемого практического использования клеточных культур существует некоторые проблемы. Получение культур нейральных стволовых клеток для аутотрансплантации является фактически невыполнимой задачей, в связи с тем, что нет возможности доступа к областям зрелого мозга человека, из которых такие клетки могут быть выделены. Другая проблема носит этический характер. Это выделение нейральных стволовых клеток из образцов тканей мозга эмбрионов человека, полученных путем медицинского аборта. По этой причине возникла задача поиска альтернативных источников нейральных клеток. С развитием представлений о стволовых клетках, присутствующих практически во всех органах и тканях, появилась концепция «пластичности стволовых клеток», которая заключается в том, что при определенных условиях стволовая клетка данной ткани способна давать потомков с нетипичными ветвями дифференцировки. В частности, имеются данные о том, что мезенхимные стволовые клетки (МСК) стромы костного мозга могут развиваться по нейральному пути как in vitro, так и при трансплантации в центральную нервную систему (Azizi et al., 1998; Kopen et al., 1999; Nakano et al., 2001; Priller et al., 2001; Munoz-Elias et al., 2004). Эти данные в корне меняют представления о процессах развития и дифференцировки клеток в организме. Однако результаты многих таких исследований все-таки можно поставить под сомнение. Многочисленные работы по проблеме нейральных стволовых клеток концентрируют свой взгляд в основном либо на анализе клеточных культур, либо на изучении результатов трансплантации. По этой причине возникает необходимость в проведении исследования, которое захватило бы оба аспекта проблемы. Кроме того, появившиеся в последнее время работы, в которых авторы демонстрируют нейральную дифференцировку культур мезенхимных стволовых клеток после трансплантации в мозг, требуют тщательной проверки. Вследствие этого, именно параллельный анализ культур нейральных и мезенхимных стволовых клеток in vitro и при трансплантации позволит прояснить ситуацию в данной проблеме. Цель исследования. Цель настоящей диссертационной работы состояла в изучении дифференцировки и поведения в культурах нейральных стволовых/прогениторных клеток развивающегося мозга человека in vitro и после трансплантации в мозг крыс. 4 Задачи исследования. 1. С использованием гистологических и иммуногистохимических методов охарактеризовать культуры НСПК развивающегося мозга человека. 2. Проанализировать судьбу (дифференцировку, пролиферацию и миграцию) трансплантированных клеток из культур НСПК эмбрионального мозга человека и их взаимодействие с тканями нормального и патологического мозга реципиентов. 3. Изучить влияние трансплантатов культур НСПК эмбрионального мозга человека на поведение крыс, подвергнутых острой гипоксии, и на гистологическую картину нейродегенеративных процессов. 4. Проанализировать культуру МСК стромы костного мозга человека и переживание клеток этой культуры после трансплантации в головной мозг нормальных крыс и крыс с острой гипоксией. Научная новизна. Настоящая диссертационная работа посвящена анализу клеточного состава и поведения клеток в нейральных культурах, полученных из развивающегося мозга человека, а также изучению их судьбы и влияния на компенсаторные процессы в патологическом мозге крыс после трансплантации. Кроме того, в работе был исследован вопрос относительно нейральной дифференцировки нативных культур мезенхимных стволовых клеток в микроокружении зрелого мозга крыс при трансплантации. Впервые в рамках одной работы детально были охарактеризованы с помощью методов гистологии, иммуногистохимии и электронной микроскопии культуры нейральных стволовых/прогениторных клеток эмбрионального мозга человека, и затем была исследована судьба этих охарактеризованных культур после трансплантации в мозг крыс. Анализ клеточных культур показал, что они гетерогенны. Нейросферы включают клетки, находящиеся на разных этапах нейральной дифференцировки. Рост клеточной культуры обеспечивается за счет стволовых, прогениторных и глиальных клеток. Иммуногистохимическое исследование адгезивных нейросфер показало, что многие клетки могут одновременно экспрессировать маркеры предшественников и дифференцированных клеток. Культивирование нейросфер на бессывороточной среде с митогенами позволяет получить популяцию клеток только нейрального ряда. Впервые на модели диффузного повреждения мозга у крыс было продемонстрировано, что после трансплантации клеточных культур происходит нормализация поведения и улучшается выживаемость собственных нейронов мозга реципиента. Это указывает на то, что трансплантаты культур нейральных стволовых/прогениторных клеток изменяют среду микроокружения патологического мозга, предотвращая гибель затронутых повреждением нейронов. Анализ переживания самих трансплантатов показал, что клетки человека сохраняются как минимум 27 дней после операции у животных без иммуносупрессии. В трансплантатах выявляются клетки на разных этапах дифференцировки: стволовые и прогениторные клетки, нейробласты и глиобласты. Однако дифференцированных нейронов выявлено 5 не было. Трансплантированные клетки мигрируют по тканям мозга реципиента, часто вдоль капилляров. Используя методические подходы, аналогичные тем, которые применяли для исследования нейральных клеток, был проведен анализ культуры мезенхимных стволовых клеток человека in vitro и при трансплантации. Здесь впервые были получены убедительные данные о том, что нативные мезенхимные стволовые клетки не дифференцируются в нейральном направлении в среде микроокружения зрелого мозга. Трансплантаты отторгаются с практически полной элиминацией клеток к 20-ым суткам. Вокруг трансплантатов развивается мощная глиальная реакция, и наблюдаются сильные морфологические изменения в окружающей ткани. В тоже время синтезируемый трансплантированными клетками фибронектин, по-видимому, обеспечивает врастание нервных волокон хозяина в область трансплантата. Таким образом, полученные результаты служат важным звеном между фундаментальными проблемами биологии стволовых клеток (такими как дифференцировка, роль микроокружения в процессах дифференцировки клеток и регенерации в нервной системе, пластичность стволовых клеток) и клеточной терапией центральной нервной системы. Практическая значимость работы. Результаты, полученные в настоящем исследовании, служат базой для разработки практических подходов клеточной терапии центральной нервной системы. Экспериментально обоснованно, что трансплантаты культур нейральных стволовых/прогениторных клеток оказывают нейропротективное действие на дегенерирующие нейроны при диффузном поражении мозга, и это нейропротективное действие, пожалуй, должно служить отправной точкой при формулировании целей и задач для практической нейротрансплантации. Здесь явно продемонстрирована необходимость сравнительного анализа клеточного материала из различных источников, который предполагается использовать для нейротрансплантации в практических целях, и создания единой концепции оценки трансплантационных и терапевтических потенции тех или иных популяций клеток. Материалы настоящей диссертации могут быть использованы в курсах лекций в биологических и медицинских ВУЗах. Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 1-ом съезде Общества клеточной биологии, Санкт-Петербург, октябрь 2003; II-ом Московском международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, ноябрь 2003; 15th Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience, Edinburgh, Scotland, august 2004; Международном Симпозиуме по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», Санкт-Петербург, октябрь 2004; VII-ой Всероссийской конференции по патологии клетки, Москва, февраль 2005; Конференции молодых ученых ИБР РАН, Москва, декабрь 2005. Публикации. По теме диссертации опубликовано пятнадцать работ, из них 6 статей в рецензируемых журналах и 9 публикаций в сборниках тезисов. 6 Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав (из которых две: обзор литературы и материалы и методы, а остальные посвящены собственным результатам и их обсуждению), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 171 странице машинописного текста и содержит 60 рисунков. Список цитируемой литературы включает 304 литературные ссылки. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Культура НСПК человека. Культуры НСПК человека выращивали в лаборатории клинической иммунологии Центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН (руководитель лаборатории академик РАМН, профессор Г.Т. Сухих). Из больших полушарий переднего мозга эмбрионов человека 9-12-ти недельного возраста выделяли кусочки ткани и путем длительного пипетирования получали суспензию клеток, которую затем культивировали при либо в ростовой бессывороточной среде DMEM/F-12 с N2-добавкой и ростовыми факторами ЭФР и ФРФ-2, а в некоторых случаях с ЛИФ, либо на среде DMEM/F-12 без факторов роста, но с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (ФСТ). Кроме этого, после культивирования на бессывороточных средах нейросферы помещали в среду с 10% ФСТ на несколько дней в чашку Петри с покровными стеклами, где они прикреплялись к покровным стеклам без адгезивного субстрата. Для трансплантаций использовали культуры НСПК выращенные в виде нейросфер в течение 25-ти и 65-ти дней. Культура МСК человека. Культуру МСК человека выращивали в лаборатории стромальной регуляции иммунитета Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (руководитель лаборатории д.б.н. Чайлахян Р.К.). Клетки костного мозга получали из гребня тазовой кости взрослого человека. Культивирование проводили на среде α-MEM с добавлением 10% аутологичной сыворотки крови человека и 10% ФСТ. Для трансплантации использовали культуру клеток с общим сроком культивирования 30 дней. В день трансплантации часть клеток из культуры была посажена на покровные стекла. Затем через 2 дня они были зафиксированы и использованы для иммуногистохимических исследований. Методы трансплантации культур НСПК и МСК человека в головной мозг взрослых крыс. Трансплантацию клеточных культур человека проводили в головной мозг нормальных крыс и крыс, подвергнутых острой гипоксии (см. ниже). Суспензии НСПК человека вводили в область гиппокампа, а МСК в область стриатума, латеральней бокового желудочка. Фиксация головного мозга. Животных усыпляли высокой дозой хлоралгидратного наркоза. Затем применяли транскардиальную перфузию. Сначала головной мозг промывали раствором 0.01 М PBS при рН 7.4 в течение 10-15 мин, а затем фиксировали холодным 4% параформом на 0.01 М PBS (рН 7.4) в течение 20-30 7 мин. После перфузии головной мозг извлекали и оставляли в том же фиксаторе в течение нескольких часов на холоду. Методы фиксации клеточных культур. Для иммуногистохимических исследований образцы клеточных культур фиксировали 4% параформом на 0.01 М PBS (рН 7.4) при комнатной температуре в течение 10-30 мин. Для электронномикроскопических исследований образцы нейросфер сначала фиксировали 2.5% глютаровым альдегидом на Na-какодилатном буфере при рН 7.3, а затем в 2% четырехокиси осмия на том же буфере. Приготовление срезов головного мозга крыс. Материал, предварительно пропитанный 30%-ной сахарозой на 0.01 М PBS (рН 7.4), резали на микротоме с замораживающим столиком. Полученные срезы толщиной 20-40 мкм монтировали на предметные стекла, покрытые желатиной. Приготовление срезов нейросфер. Для электронно-микроскопических исследований образцы нейросфер заливали в аралдит по стандартной методике и затем приготавливали полутонкие срезы (толщиной 1-2 мкм) и тонкие срезы (толщиной 600-700 Å) на ультратоме "Nova". Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим. Тонкие срезы контрастировали растворами уранилацетата и цитрата свинца. Гистологические методики. Во всех экспериментах с трансплантациями была использована рутинная окраска крезилвиолетом, тионином и по Гимза. Методы иммуногистохимического окрашивания. Исследуемые образцы инкубировали в растворе первичных антител в соответствующей концентрации в течение ночи при температуре 4°С. Затем, после отмывки в 0.01 М PBS (рН 7.4), инкубировали в растворе вторичных антител, меченых флуорохромами в течение 2-х часов при комнатной температуре. Готовые препараты заключали под покровное стекло в глицерин. Двойное иммуногистохимическое окрашивание проводили по той же схеме, инкубируя образцы одновременно с двумя первичными антителами различных животных-хозяев, а затем – одновременно с двумя вторичными антителами, меченными разными флуорохромами. При необходимости препараты докрашивали растворами люминесцентных ДНК-связывающих красителей для выявления клеточных ядер: DAPI, Hoechst 33342, Toto®-3 йодидом и пропидием йодидом. Первичные антитела и их описание. Anti-nestin: нестин является наиболее распространенным маркером для идентификации стволовых клеток в различных областях развивающейся и зрелой ЦНС. Anti-vimentin: виментин – белок, экспрессирующийся в нервных и глиальных клетках-предшественниках, реактивных астроцитах, клетках мезенхимного ряда, фибробластах. Anti-GFAP: глиальный фибриллярный кислый белок (ГФКБ) – маркер клеток астроглии. Anti-β-tubulin-III: βтубулин III класса служит маркерным белком нейробластов. Anti-Neurofilaments: нейрофиламенты – белки, экспрессирующиеся в дифференцированных нейронах. AntiNeuN: NeuN – ДНК-связывающий белок, экспрессирующися исключительно в дифференцированных нервных клетках. Anti-Ki67: Ki67 – белок, экспессирующийся во 8 всех фазах клеточного цикла кроме G0. Anti-fibronectin: в настоящей работе использовали антитела против фибронектина для выявления фибробластов. Antihuman nuclei: антитела против белка ядер клеток человека (hNuc) специфично выявляют все типы клеток человека. Гипоксическая модель повреждения головного мозга. Крыс помещали под стеклянный колпак на металлический диск, через который были продеты две трубки. Через одну из них непрерывно поступала струя свежего воздуха, что можно было регулировать краном. Через другую трубочку воздух откачивали из-под колпака с помощью вакуумного насоса. В течение одной минуты понижали атмосферное давление в барокамере от нормального (760 мм рт. ст.) до 180 мм рт. ст. Под этим давлением крыс выдерживали 3 мин, и затем под колпак впускали воздух в течение 30 с, восстанавливая нормальное атмосферное давление. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА И ПОВЕДЕНИЕ НЕЙРАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЭМБРИОНАЛЬНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO. В работе было исследовано восемь культур НСПК. При культивировании на бессывороточной среде с митогенами на 5-7 сутки во всех исследованных культурах отмечали появление нейросфер. По мере культивирования нейросферы увеличивались в размере за счет пролиферации клеток в них и представляли собой шаровидные структуры, содержащие 100 и более клеток (Рис. 1). Размеры нейросфер варьировали от 50 мкм до 500 мкм и более в диаметре. Иммуногистохимические исследования нейросфер показали, что они включают клетки, находящиеся на различных этапах нейральной дифференцировки (Рис. 2). Морфологический анализ полутонких срезов нейросфер свидетельствовал о том, что среди хаотически распределенных клеток встречаются группы клеток организованные в розетко-подобные структуры (Рис. 3). Тела клеток в розетках имеют уни- или биполярную форму и располагаются радиально на некотором расстоянии от центра. Ядра клеток лежат, как правило, в несколько слоев. В центре розетки - полость, к которой сходятся апикальные отростки составляющих ее клеток. Апикальные отростки вблизи центральной полости соединены протяженными десмосомоподобными контактами. В розетках часто встречаются митотически делящиеся клетки. Ядра делящихся клеток находятся ближе к центру, чем ядра остальных клеток в розетке (Рис. 3B). Клетки в розетках окрашиваются на нестин. Розетко-подобные структуры были обнаружены в нейросферах при длительном культивировании в течение 65-ти суток (Рис. 3C), при котором нейросферы тщательно разбивали до единичных клеток с использованием ферментативной диссоциации. Это указывает на возможность развития розеток из отдельных клеток. Для более детального исследования дифференцировки и пролиферации клеток нейросферы осаждали на покровные стекла в среде с 10% ФСТ без факторов роста. В этих условиях нейросферы малых размеров (50-200 мкм), как правило, «распластываются», образуя практически монослой. У средних и крупных нейросфер 9 (300-500 мкм и более) сохраняется плотное скопление клеток в центре в виде полусферы, а по краям мигрирующие от центра клетки формируют один или несколько слоев. И в том, и в другом случае клетки мигрируют в радиальном направлении от центра прикрепившейся нейросферы. Среди клеток прикрепленных нейросфер значительную популяцию составляют клетки, иммунопозитивные к нестину и виментину (Рис. 4). Одновременная окраска антителами против нестина и виментина «распластанных» нейросфер показала, что выявляемые при этом картины практически идентичны. Это указывает на то, что многие клетки имеют положительную реакцию на оба белка одновременно. Морфология этих клеток разнообразна. Помимо мигрирующих клеток биполярной формы, внутри и по краям адгезивных нейросфер можно обнаружить клетки с хорошо распластанной цитоплазмой. Исследования дифференцировки клеток в адгезивных нейросферах проводили с использованием антител против β-тубулина III и ГФКБ (Рис. 5). Клетки с нейрональной дифференцировкой (нейробласты) имеют ярко выраженную морфологию, которая сильно отличается от клеток, окрашивающихся на нестин и/или виментин и ГФКБ. Среди β-тубулин III позитивных клеток встречаются клетки моно-, бии мультиполярной формы. Форма ядра практически у всех нейробластов веретеновидная. Нужно отметить, что клетки, иммунопозитивные к β-тубулину III, никогда не прикреплялись непосредственно к покровному стеклу, а всегда располагались и распространяли свои отростки поверх клеток других фенотипов. Отростки нейробластов, часто оканчиваются конусом роста. При окраске антителами против ГФКБ было выявлено, что клетки, иммунопозитивные к этому белку, в морфологическом отношении во многом сходны с нестин- и/или виментин-положительными клетками. Однако, в отличие от последних, они образуют более разреженную популяцию в «распластанных» нейросферах (Рис. 5А). Двойная окраска антителами против ГФКБ и виментина или нестина явно демонстрирует, что многие ГФКБ-позитивные клетки окрашиваются на маркеры стволовых и прогениторных клеток. Исследование пролиферативной активности проводили с использованием антител против белка Ki67. Анализ показал, все без исключения адгезивные нейросферы содержали Ki67-положительные клетки. Однако соотношение количества Ki67-положительных и Ki67-отрицательных клеток варьировало между нейросферами. Кроме того, при наблюдении ядер, окрашенных люминесцентным красителем Hoechst 33342, на препаратах часто обнаруживались клетки в различных фазах митотического деления. Фигуры митозов можно было обнаружить в клетках, которые окрашиваются на нестин, виментин и ГФКБ (Рис. 6). В проблеме получения характеристик клеток в культурах НСПК, выращенных из первичных суспензий диссоциированных клеток эмбрионального мозга, важным является вопрос о сохранении в процессе культивирования клеток ненейрального происхождения. Первыми кандидатами на контаминацию культур нейральных клеток являются фибробласты, поскольку их источником могут являться оболочки 10 эмбрионального мозга. Положительной окраски на фибронектин не было выявлено как в свободноплавающих нейросферах, так и в осажденных нейросферах. В тоже время во всех адгезивных культурах, выращенных с самого начала в среде с ФСТ, выявляются клетки, окрашивающиеся на фибронектин, а также внеклеточный фибронектин (Рис. 7). Особенно показательны данные исследований культур клеток, которые были получены путем разделения первичной суспензии пополам и затем выращенные параллельно двумя способами. Это указывает на то, что при культивировании на бессывороточной среде с ростовыми факторами происходит элиминация фибробластов, которые присутствовали в начальной суспензии. При двойных окрасках антителами против фибронектина и нестина, фибронектина и виметина адгезивных клеточных культур было обнаружено, что, во-первых, все без исключения фибронектин-позитивные клетки имеют положительную реакцию на виментин, а, во-вторых, некоторые фибронектин-позитивные клетки окрашиваются на нестин. В условиях поставленного эксперимента возможны два пути формирования нейросфер. Первый - агрегация диссоциированных клеток. Второй – развитие из отдельных клеток, потомки которых остаются тесно связанными между собой. Вне зависимости от происхождения нейросферы имеют гетерогенный состав. Они включают клетки, находящиеся на различных стадиях нейральной дифференцировки. Полученные здесь данные подтверждают многие другие исследования относительно характеристики свободноплавающих нейросфер (Suslov et al., 2002; Bez et al., 2003; Lobo et al., 2003). Клетки в нейросферах обладают пролиферативной активностью. Однако уровень этой активности сильно варьирует от нейросферы к нейросфере даже в пределах одной культуры. Исходя из этого, можно заключить, что клетки начальной суспензии, которые дали начало нейросферам, были гетерогенны. Эта гетерогенность может быть обусловлена, во-первых, их функциональным состоянием на момент посева, а, во-вторых, тем, как они впоследствии отвечали на факторы, которые оказывают влияние на клеточный цикл и способ деления. Это согласуется с предположениями, сделанными в других исследованиях (Tropepe et al., 1999; Suslov et al., 2002). Клетки, обнаруженные в розетках по многим признакам: положительной окраске на нестин и характерной миграции ядер при митозе, сходны с нейроэпителиальными клетками. Розетко-подобные кластеры клеток могут формироваться с самого начала культивирования. Это указывает на то, что они могут возникать двумя путями: либо за счет замыкания фрагментов неокортекса, которые сохранились, не смотря на длительное пипетирование с трипсинизацией, либо в следствие самоагрегации диссоциированных клеток нейроэпителия. Способность диссоциированных клеток различного происхождения агрегировать in vitro с образованием гистотипических структур, в настоящее время, рассматривается как перспектива развития тканевой инженерии (Layer et al., 2002). Имеются результаты исследований на схожих объектах, таких, как культуры диссоциированных клеток фетальной сетчатки (Sheffield and 11 Moscona, 1970) культуры эмбриональных стволовых клеток, направленных в нейральную дифференцировку (Chen et al., 2003, Ying Q.-L. et al., 2003) и переживающих эксплантатах неокортекса эмбрионов человека (Смирнов et al, 1996). Здесь также образовывались агрегаты сфероидальной формы, содержащие розеткоподобные структуры. Осаждение свободноплавающих нейросфер на покровные стекла в среде с ФСТ позволило установить, какие маркеры нейральной дифференцировки клетки могут экспрессировать одновременно. При двойных окрасках было обнаружено, что в адгезивных нейросферах встречаются клетки, иммунопозитивные к нестину и/или виментину, нестину и/или ГФКБ, виментину и/или ГФКБ. Ранее было показано, что в ГФКБ-положительные глиальные клетки как зрелого, так и развивающегося мозга могут экспрессировать одновременно нестин и виментин (Eliasson et al., 1999; Whittemore et al., 1999; Messam et al., 2000, 2002). Одновременная экспрессия нестина или виментина ГФКБ-позитивными глиальными клетками, по-видимому, играет важную роль при определенных функциональных нагрузках, как, например, при реактивном глиозе вследствие травмы или нейродегенеративных заболеваний, а также в процессе дифференцировки глиальных клеток. При осаждении нейросфер клетки радиально мигрируют по направлению от центра к периферии. Вследствие этого, клетки прикрепленных нейросфер имеют преимущественно биполярную форму с длинными отростками, направленными радиально. В тоже время, среди нестин-, виментин- и ГФКБ-позитивных клеток встречаются клетки с хорошо расплатанной цитоплазмой и короткими отростками. Клетки, окрашивающиеся антителами против β-тубулина III, имеют выраженную морфологию нейробластов. Как показал опыт, популяции клеток эмбрионального мозга человека можно успешно сохранять in vitro в среде без ростовых факторов, но с добавлением ФСТ в виде адгезивной культуры. В целом в таких культурах сохраняются клетки, окрашивающиеся на те же маркеры, что и клетки нейросфер. Закономерности их поведения и морфологические признаки сходны с таковыми, демонстрируемыми клетками адгезивных нейросфер. Здесь нужно напомнить, что источником материала служат ткани эмбрионального мозга, содержащие, помимо нейральных клеток, эндотелий и вероятно клетки соединительных тканей, которые невозможно эффективно удалить из первичной культуры. В настоящей работе удачным подходом оказалось параллельное культивирование клеток эмбрионального мозга человека двумя способами: в виде нейросфер и в виде адгезивной культуры. Это позволило достоверно показать, что, даже не смотря на длительное содержание прикрепленных нейросфер (до 6-ти дней) в среде с сывороткой, в них никогда не обнаруживались фибронектин-позитивные клетки. В тоже время, адгезивные культуры, которые можно рассматривать как контроль, содержали значительные популяции положительных к фибронектину клеток. Особое внимание на себя обращает тот факт, что некоторые фибронектин-иммунопозитивные клетки, окрашиваются антителами против нестина. 12 Рис. 1 Свободноплавающие нейросферы в культуральной среде после 15-ти дней культивирования. Фазовый контраст. Масштаб: 50 мкм. Рис. 2 Нейросферы гетерогенны по своему составу. В них выявляются клетки на разных стадиях дифференцировки: нестин-положительные стволовые и малодифференцированные клетки-предшественники (A), виментин-положительные коммитированные клетки-предшественники (B), глиальные клетки, иммунопозитивные к ГФКБ (C) и β-тубулин III положительные нейробласты (D). Ядра клеток докрашены Toto-3 (A,B,D). Масштаб: 20 мкм. 13 Рис. 3 Общий вид розетко-подобных структур в нейросферах. (A) Клеточная розетка через 1 сутки после начала культивирования. (B) Симметричное и асимметричное деление клеток. (C) Розетка в нейросфере (стрелка) через 65 суток культивирования. Полутонкие срезы (толщина 2 мкм). Окраска метиленовым синим. Масштаб: 30 мкм (A), 10 мкм (B) и 50 мкм (C). 14 Рис. 4 Нестин (A) и виментин (В) иммунопозитивные клетки в прикрепленных к покровному стеклу нейросферах. В связи с тем, что очень часто клетки, иммунопозитивны к обоим белкам одновременно, картины, наблюдаемые при двойной окраске антителами против них, совпадают (A и В). Масштаб: 200 мкм. Рис. 5 Дифференцировка клеток нейросфер по глиальному (A) и нейрональному (B) пути. Окраска антителам против ГФКБ (A) и β-тубулина III (B). Микрофотографии сделаны с одной области препарата. Масштаб: 200 мкм. Рис. 6 Фенотипы митотически делящихся клеток в культурах НСПК человека. Окраска: нестин (A), виментин (B) и ГФКБ (С). Ядра клеток (A,B,C) докрашены Hoechst 33342 (синий). Среди клеток, окрашивающихся на маркеры нейрональной дифференцировки, митотически делящихся выявлено не было. Масштаб: 10 мкм. 15 Рис. 7 Иммунопозитивные к фибронектину (красный) клетки в популяциях НСПК человека, выращенных в виде адгезивной культуры в среде с сывороткой. Помимо этого выявляются фибронектиновые тяжи внеклеточного матрикса (стрелка). Ядра клеток докрашены Hoechst 33342. Масштаб: 200 мкм. Рис. 8 Трансплантированные клетки человека в гиппокампе (A: Гп), таламусе (A: Тл) и коре (В) мозга экспериментальных крыс. 27 дней после трансплантации. Окраска антителами против hNuc (зеленый). Масштаб: 100 мкм (A), 300 мкм (B). Рис. 9 Трансплантированные клетки сохраняют пролиферативную активность, Окраска: (А) антитела против Ki67 (зеленый) и пропидий йодид (красный), (В) антитела против hNuc (зеленый) и нестина (красный). Масштаб: 50 мкм (А) и 10 мкм (В). 16 Рис. 10 Трансплантированные клетки человека иммунопозитивны к нестину (А: зеленый) и виметину (В: красный). 27 дней после трансплантации. Масштаб: 200 мкм. Рис. 11 Нейрональная и глиальная дифференцировка клеток трансплантатов НСПК человека в мозгу крыс. 27 дней после трансплантации. Окраска антителами: (А) против нестина (зеленый) и β-тубулина III (красный), (В) против ГФКБ (зеленый) и hNuc (красный). Масштаб: 50 мкм. 17 Рис. 12 Вокруг трансплантатов наблюдалась глиальная реакция. Однако ни в одном случае не было выявлено формирования плотного глиального рубца. 27 дней после трансплантации. Окраска антителами против hNuc (зеленый) и ГФКБ (красный). Масштаб: 100 мкм. Рис. 13 (см. объяснения в тексте). 18 Рис. 14 (см. объяснения в тексте). Рис. 15 Трансплантированные клетки из культуры МСК человека в стриатуме нормальных и гипоксированных крыс. (А) нормальная крыса, 10 дней после трансплантации; (B) нормальная крыса, 20 дней после трансплантации; (C) крыса с острой гипоксией, 10 дней после трансплантации; (D) крыса с острой гипоксией, 20 дней после трансплантации. Окраска антителами против hNuc (зеленый). Желтое сечение – автофлуоресценция макрофагов. Масштаб: 100 мкм (A,C) и 50 мкм (B,D). 19 Рис. 16 Внутри трансплантатов выявляются фибронектин-иммунопозитивные клетки человека, а также внеклеточный фибронектин. (А) нормальная крыса, 10 дней после трансплантации; (B) крыса с острой гипоксией, 10 дней после трансплантации. Двойная окраска антителами против фибронектина (красный) и hNuc (зеленый). Желтое сечение – автофлуоресценция макрофагов. Обозначения: (Тр) – трансплантат. Масштаб: 50 мкм. Рис. 17 Глиальная реакция вокруг трансплантатов (Тр) МСК человека. (А) нормальная крыса, 10 дней после трансплантации; (B) крыса с острой гипоксией, 10 дней после трансплантации. Двойная окраска антителами против ГФКБ (красный) и hNuc (зеленый). Желтое сечение – автофлуоресценция макрофагов. Масштаб: 50 мкм. Рис. 18 Врастание отростков собственных нейронов реципиента в область трансплантатов МСК человека (Тр). Нормальная крыса, 10 дней после трансплантации. Окраска антителами против нейрофиламентов (зеленый). Желтое сечение – автофлуоресценция макрофагов. Масштаб: 50 мкм. 20 Аналогичные наблюдения были сделаны и другими исследователями в культурах клеток, выделенных из костного мозга (Sanchez-Ramos, 2002; а также собственные наблюдения). Эти и многие другие наблюдения показывают, что белок нестин играет существенную роль в организации ансамблей промежуточных филаментов у недифференцированных клеток разных органов и тканей. В заключении хотелось бы отметить следующий тезис. Тот факт, что по данным настоящего исследования и литературным данным нейросферы гетерогенны, позволяет по-новому взглянуть на проблему нейральных стволовых клеток в целом. В этом случае нейросферы можно рассматривать как «нишу» стволовых клеток in vitro, поскольку их составляют практически те же типы клеток, что и нейрогенные кластеры нативного мозга. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ПОПУЛЯЦИЙ НЕЙРАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ/ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ЭМБРИОНАЛЬНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА В ГОЛОВНОЙ МОЗГ ВЗРОСЛЫХ КРЫС. В настоящей работе были проведены трансплантации культур НСПК человека в головной мозг нормальных крыс и крыс, подвергнутых острой гипоксии. Было сделано две серии экспериментов. В первой серии проводили исследования, направленные на изучение вопроса о переживании трансплантированных популяций НСПК эмбрионального мозга человека в мозгу крыс, подвергнутых острой гипоксии, и влиянии нейротрансплантации на когнитивные функции этих животных. В этой серии исследования проводились на четырех группах экспериментальных животных: 1) с острой гипоксией (группа Г, n=5); 2) с острой гипоксией и трансплантацией культуры НСПК (группа Г+НСПК, n=7); 3) с острой гипоксией и введением физиологического раствора (Г+ФР, n=6); 4) нормальные животные (группа Н, n=5). Через сутки после сеанса гипоксии животным производили трансплантацию культуры НСПК (группа Г+НСПК), которую выращивали в течение 65 дней в присутствии ЭФР, ФРФ-2 и ЛИФ, или инъецировали физиологический раствор (группа Г+ФР). На 4-ые сутки после сеанса гипоксии крыс обучали условному рефлексу двустороннего избегания (УРДИ) в «челночной камере». Через 9 и 23 суток после сеанса гипоксии проводили проверку закрепления рефлекса. Поведенческие тесты проводили в лаборатории функциональной нейроморфологии Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (руководитель лаборатории д.б.н. Лосева Е.В.). Объединенные показатели двух тестов (на 9-й и 24-й дни после сеанса острой гипоксии) для групп Г, Г+ФР и Г+НСПК и 2-го теста для группы Н представлены на Рис. 13. В контрольной группе Н крысы статистически значимо (Р<0.05) лучше обучались УРДИ по сравнению с крысами из других групп, включая группу Г+НСПК. Животные из группы Г+НСПК статистически значимо (Р<0.05) лучше обучались УРДИ по сравнению с животными из группы Г+ФР. Этот эффект менее выражен при сравнении группы Г+НСПК с группой Г, где животные были подвергнуты только острой 21 гипоксии. Статистически достоверной разницы не выявлено, однако наблюдалась выраженная тенденция (Р<0.1). Через 27 дней после трансплантации (или через 28 дней после сеанса гипоксии для группы Г) проводили гистологические и иммуногистохимические исследования мозга экспериментальных и контрольных животных. Трансплантаты клеток человека были расположены в коре, гиппокампе и таламических отделах мозга (Рис. 8). Была выявлена миграция клеток от трансплантатов в области неокортекса и гиппокампа. В коре мозга клетки человека мигрировали в III-V слои, нейроны которых наиболее подвержены влиянию гипоксического повреждения. В гиппокампе трансплантированные клетки мигрировали по субпирамидному слою. Пересаженные клетки мигрировали как по паренхиме мозга, так и по кровеносным сосудам. Спустя 27 дней после пересадки трансплантированные клетки человека способны митотически делиться. Так, при двойной окраске препаратов антителами против hNuc и нестина были выявлены митотические фигуры среди нестин-позитивных клеток (Рис. 9В). Окраска антителами против Ki67 показала, что в отличие от нейросфер in vitro во всех трансплантатах обнаруживались только единичные клетки, окрашивающиеся на этот белок (Рис. 9А). Это указывает на снижение пролиферативной активности клеток после трансплантации. Иммуногистохимическая окраска на нестин человека выявила множество клеток в трансплантатах, иммунопозитивных к этому белку (Рис. 10А). В зонах контакта трансплантата с мозгом реципиента отростки нестин-иммунопозитивных клеток глубоко врастали в прилежащую ткань. Похожая картина наблюдается при окраске антителами против виментина (Рис. 10В). β-тубулин III иммунопозитивные клетки равномерно распределялись по трансплантатам и имели, как правило, биполярную форму с небольшими отростками. На препаратах среди нестин-позитивных клеток было четко видно множество нейробластов, которые имели более короткие отростки, мало выходящие за пределы трансплантатов (Рис. 11А). Окраска с использованием антител к ГФКБ позволила показать, с одной стороны, реакцию астроцитов реципиента, с другой, глиальную дифференцировку клеток в трансплантатах. Двойная иммуногистохимическая окраска антителами против hNuc и ГФКБ позволила выявить в трансплантатах отдельные группы, состоящие из 510 клеток, окрашивающиеся на оба маркера (Рис. 11В). Двойная иммуногистохимическая окраска антителами к нестину, которая позволяла полностью выявлять область трансплантата культуры НСПК, и белку NeuN, маркеру дифференцированных нейронов свидетельствовала о том, что в трансплантатах отсутствуют дифференцированные нейроны. Формирования плотного глиального рубца вокруг трансплантата выявлено не было. Однако незначительная глиальная реакция присутствует (Рис. 12). Эта реакция не препятствует реципрокному росту волокон клеток трансплантата и хозяина. Так, при окраске антителами против нестина человека было обнаружено, что клетки трансплантата, окрашивающиеся этими антителами и расположенные на границе 22 трансплантат-хозяин, часто распространяют свои отростки глубоко в паренхиму мозга реципиента. С другой стороны, волокна нейронов мозга хозяина, окрашивающиеся антителами против нейрофиламентов, проникают в ткань трансплантата. Таким образом, полученные гистологические данные показывают успешное переживание трансплантатов НСПК в мозгу гипоксированных крыс. Однако эти данные не указывают на возможность функциональной интеграции трансплантатов. Таким образом, возникает вопрос: с чем связан эффект улучшения обучения УРДИ в группе гипоксированных животных получивших трансплантат по сравнению с контрольными группами? Было сделано предположение о том, что трансплантат НСПК за счет трофического действия может обеспечивать лучшую выживаемость собственных нервных клеток реципиентов. Для проверки этого предположения был сделан морфометрический анализ нормальных и дегенерирующих нейронов в мозгу у крыс разных групп. При статистической обработке данных, полученных путем подсчета трех типов нейронов (нормальных, сморщенных и отечных), была показана существенная разница в их процентном содержании в группах крыс Н, Г+ФР и Г+НСПК (Рис. 14). Это свидетельствуют о генерализованном нейропротективном действии трансплантата. Во второй серии исследования были направлены на проведение сравнительного анализа переживания культуры НСПК после трансплантации в мозг нормальных крыс и крыс, подвергнутых острой гипоксии. Для трансплантации использовали культуру, выращенную в течение 25 дней в присутствии двух факторов ЭФР и ФРФ-2. Были использованы две группы экспериментальных животных: 1) интактные крысы, получившие трансплантат культуры НСПК человека (n=4) и 2) подвергнутые острой гипоксии крысы, которым через сутки после сеанса гипоксии трансплантировали культуру НСПК человека (n=4). Животных фиксировали через 10 и 20 дней после трансплантации. В этой серии экспериментов не было выявлено существенных различий между переживанием клеток в интактном и патологическом мозгу. Здесь обращает на себя внимание то, что клетки пересаженной культуры в значительной степени дегенерировали в независимости от того: переживали они в интактном или патологическом мозгу. Окраска антителами против маркеров различных этапов нейральной дифференцировки показала, что во всех случаях в областях, где располагались трансплантированные клетки, обнаруживалась четкая окраска на нестин человека. Также выявлялись клетки, иммунопозитивные к виментину. При окраске антителами против β-тубулина III ни в одном случае не было выявлено клеток в трансплантатах, иммунопозитивных к этому белку. В тоже время, как показали исследования этой культуры перед трансплантацией, β-тубулин III положительные клетки присутствовали в суспензии в значительном количестве. Эти наблюдения указывают на то, что после трансплантации нейробласты резорбировали, и, кроме того, не происходило новой генерации клеток с нейрональной дифференцировкой. Аналогичная ситуация и с глиальными клетками. По-видимому, этот результат в большей степени зависел от самой культуры и условий предварительного 23 культивирования, нежели от условий переживания в нормальном или поврежденном мозгу. Тот факт, что в первой серии экспериментов у гипоксированных крыс, получивших трансплантат, происходит нормализация поведения в виде тенденции (p<0.1), по-видимому, связан с незначительной выборкой в экспериментальной группе. Однако если рассматривать более детально результаты по каждой крысе в отдельности, то в группе Г единственная крыса достигла заданного критерия выработки УРДИ только 3-ем тесте. В тоже время, в группе Г+НСПК две крысы стабильно достигали заданного критерия выработки УРДИ во 2-ом и 3-ем тестах. Улучшение когнитивных функций после трансплантации популяций НСПК у животных с экспериментальной дисфункцией гиппокампа было также продемонстрировано в работе Джелша с соавт. (Jeltsch et al., 2003). Это улучшение связано с нейропротективным действием трансплантированных клеток, что также ранее также было продемонстрировано на других моделях повреждения мозга у животных (Hagan et al., 2003; Akerud et al., 2001). Используя иммуногистохимический метод, удалось получить убедительные доказательства того, что клетки из культуры НСПК эмбрионального мозга человека переживают без признаков отторжения как минимум 27 дней. Трансплантаты включают популяции недифференцированных стволовых и прогениторных клеток, а также клеток с нейрональной и глиальной дифференцировкой. Это согласуется с многочисленными литературными данными (Friker et al., 1999; Vescovi et al., 1999; Rubio et al., 2000; Englund et al., 2002a; Jain et al., 2003a). В тоже время, терминально дифференцированных нейронов, которые окрашивались бы антителами против NeuN, в трансплантатах выявлено не было. Это с одной стороны показывает, что функциональной интеграции трансплантированных клеток в нейронную сеть хозяина на данном сроке переживания не происходило, а с другой – подтверждает выводы других исследователей о том, что клетки человека сохраняют свои собственные темпы дифференцировки после трансплантации в мозг крыс (Friker et al., 1999). Снижение пролиферативной активности клеток после трансплантации можно обосновать с позиций взаимодействия трансплантированных клеток с микроокружением тканей мозга хозяина. Факторы микроокружения дифференцированного мозга либо оказывают влияние на клеточный цикл, удлиняя его период, либо заставляют клетки выйти из клеточного цикла в фазу покоя. Результаты второй серии экспериментов показали, что существенной разницы в переживании трансплантированной культуры НСПК в мозгу нормальных и гипоксированных крыс не наблюдается. Однако в этом случае была выявлена значительная дегенерация трансплантатов у всех животных. Можно сравнить эти результаты с результатами экспериментов первой серии. Необходимо напомнить, что в первой серии была использована культура НСПК, выращенная в течение 65-ти дней по специальному протоколу с тремя митогенами: ФРФ-2, ЭФР и ЛИФ. Во второй серии экспериментов культуру НСПК человека растили 25 дней в среде с двумя митогенами: 24 ФРФ-2 и ЭФР. Не смотря на то, что при культивировании по обоим протоколам формируются нейросферы, на переживание и развитие трансплантатов, по-видимому, влияют способы сохранения клеток в культуре. В литературе отсутствуют какие-либо данные по этому вопросу. Однако результаты нескольких исследований культур НСПК in vitro явно показывают, что именно при выращивании клеток в среде с тремя митогенами (ФРФ-2, ЭФР, ЛИФ) достигаются наибольшие темпы роста клеточной популяции, и клетки такой популяции дифференцируются преимущественно в нейроны (Carpenter et al., 1999; Svendsen et al., 1999; Wright et al., 2003). Более того, ЛИФ необходим для длительного сохранения популяций НСПК в культуре. Исходя из данных настоящего исследования, можно предположить, что длительное культивирование с ЛИФ приводит к более успешному приживлению трансплантатов популяций НСПК в мозгу крыс. Трансплантация клеток ненейрального происхождения в головной мозг взрослых крыс. Анализ адгезивной культуры МСК человека дал следующие результаты. Все клетки на препаратах были иммунопозитивны к виментину. Среди них встречались единичные клетки, выявляемые антителами против нестина. Почти все клетки в исследованной культуре обнаруживают экспрессию фибронектина, за исключением единичных клеток. Интересно, что среди фибронектин-иммунопозитивных клеток можно выявить клетки, окрашивающиеся антителами против нестина. При окраске антителами против маркеров нейрональной и глиальной дифференцировки, βтубулину III и ГФКБ, клеток, иммунопозитивных к этим маркерам, выявлено не было. Таким образом, перед трансплантацией культура МСК человека не содержала клеток с нейрональной и глиальной дифференцировкой. Через 10 дней после трансплантации клетки из культуры МСК человека были выявлены с использованием антител против белка hNuc у всех животных, как в группе норма+трансплантация МСК (n=3), так и в группе гипоксия+трансплантация МСК (n=3) (Рис. 15A,C). Основная масса трансплантированных клеток располагалась, как правило, в стриатуме. В неокортексе и белом веществе обнаруживались единичные клетки. Миграции клеток по тканям мозга реципиента не наблюдалось. Во всех случаях клетки были окружены скоплением макрофагов. Через 20 дней после трансплантации единичные hNuc-иммунопозитивные клетки были выявлены у одной нормальной крысы (группа норма+трансплантация МСК; n=3) и у одной крысы с острой гипоксией (группа гипоксия+трансплантация МСК; n=3) (Рис. 15B,D). Здесь также обнаруживались значительные скопления макрофагов в области трансплантации. Таким образом, к 20-му дню происходила полная элиминация трансплантированных клеток. В случае 10-ти дней переживания внутри трансплантатов была выявлена положительная окраска антителами против виментина. Это показывает, что клетки сохраняют экспрессию этого белка после трансплантации. В тоже время виментин- 25 позитивные клетки обнаруживались вокруг трансплантатов, что свидетельствует о развитии глиальной реакции. Эти данные в дальнейшем были подтверждены при окраске антителами против ГФКБ (см. ниже). Положительной окраски на нестин человека, β-тубулин III и ГФКБ трансплантированные клетки не обнаруживали. Это свидетельствует об отсутствии дифференцировки клеток из культуры МСК человека в нейральном направлении после трансплантации. Помимо виментина клетки трансплантатов окрашивались на фибронектин. При двойной окраске антителами против hNuc и фибронектина было обнаружено, что область трансплантата почти целиком иммунопозитивна к фибронектину (Рис. 16). Гистологическая картина при такой окраске указывает на то, что в области трансплантатов развился мощный внеклеточный матрикс. По-видимому, этот матрикс приводит к сильному морфологическому изменению окружающих тканей, что находит подтверждение при простой гистологической окраске крезилвиолетом. Вокруг трансплантатов МСК была обнаружена выраженная глиальная реакция астроцитов хозяина (Рис. 17). Реактивный глиоз распространялся на значительное расстояние от трансплантатов. В этом случае на себя также обращает внимание измененная морфология окружающих тканей. Волокна реактивных астроцитов ориентировались радиально по направлению к трансплантатам. При окраске антителами против нейрофиламентов было обнаружено, что волокна нейронов хозяина глубоко врастали в область трансплантатов в разрывы между скоплениями макрофагов (Рис. 18). По-видимому, такому росту способствовал фибронектиновый внеклеточный матрикс. Анализ культуры МСК взрослого человека во многом подтверждает сделанные ранее наблюдения других исследовательских групп (Piersma et al., 1985; Li et al., 1995; Takahashi et al., 1995). В частности популяция МСК является достаточно гомогенной по маркерам к виментину и фибронектину. Единичные клетки в культуре окрашивались антителами против нестина. Похожие результаты получили Вислет-Гендебен с соавт. (Wislet-Gendebien et al., 2003). Ими было также продемонстрировано, что количество клеток, иммунопозитивных к нестину, увеличивается, если культуру МСК перевести на бессывороточную среду. В этих условиях клетки растут в виде свободно плавающих агрегатов. Однако, при помещении нестин-положительных агрегатов в условия среды, где они прикрепляются к подложке, клетки в них никогда не дифференцируются по нейральному пути. Таким образом, экспрессия нестина в культурах МСК отражает функциональное состояние клетки, нежели указывает на ее потенции к нейральной дифференцировке. При окраске антителами против β-тубулина III и ГФКБ, маркеров нейрональной и глиальной дифференцировки, клеток, иммунопозитивных к этим белкам, выявлено не было. Эти данные противоречат некоторым исследованиям, в которых авторы указывают, что в нативных культурах МСК встречаются клетки с нейральной дифференцировкой. В частности, Тондре c соавт. (Tondreau et al., 2004), используя методы проточной цитофлуориметрии, полимеразной цепной реакции и Вестерн блот 26 анализа, показали наличие белков-маркеров нейральной дифференцировки в клетках из культур МСК. Однако в настоящем исследовании условия иммуногистохимического окрашивания были аналогичны тем, в которых окрашивали культуры НСПК эмбрионального мозга человека. Поэтому отсутствие позитивной окраски на β-тубулин III и ГФКБ в культуре МСК человека можно считать достоверной. Анализ результатов трансплантации культуры МСК человека в целом свидетельствует о прогрессирующей резорбции трансплантатов, что противоречит результатам некоторых исследований (Azizi et al., 1998; Kopen et al., 1999), где было продемонстрировано длительное переживание клеток культур МСК после трансплантации в мозг. На процессы резорбции трансплантатов также указывают плотный слой макрофагов, окружающих трансплантат, и выраженная глиальная реакция. Аналогичные наблюдения сделали Kawaja и Gage (Kawaja and Gage, 1992) в похожем эксперименте с трансплантацией фибробластов кожи. Таким образом, в отличие от клеток популяций НСПК клетки культуры МСК не способны длительно переживать в мозгу после трансплантации. Причиной тому может являться иммунокомпетентность клеток культуры МСК. Кроме этого, в настоящей работе в области трансплантата была выявлена положительная окраска антителами против фибронектина, что было обнаружено также в других исследованиях по трансплантации культур МСК и фибробластов (Kawaja and Gage, 1992; Azizi et al., 1998). По-видимому, присутствие внеклеточного фибронектина оказывает сильное влияние на окружающие ткани мозга реципиента, что приводит к морфологическому изменению структуры нервной ткани в области трансплантатов и провоцирует формирование глиального рубца. В тоже время был обнаружен интересный факт, что волокна нейронов реципиента глубоко врастали в область трансплантатов. Аналогичные наблюдения сделали Ньюхабер с соавт. (Neuhuber et al., 2005). В этом случае при пересадке клеток культур МСК в травмированный спинной мозг авторы выявили активный рост поврежденных аксонов через область трансплантата. Автор выражает благодарность своим коллегам за помощь в подготовке экспериментального материала для настоящей диссертации: руководителю лаборатории клинической иммунологии Центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН академику РАМН профессору Сухих Геннадию Тихоновичу и его сотрудникам за подготовку культур НСПК эмбрионального мозга человека, руководителю лаборатории стромальной регуляции иммунитета Научноисследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН д.б.н. Чайлахяну Рубену Карповичу и его сотрудникам за подготовку культур МСК человека, руководителю лаборатории функциональной нейроморфологии Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН д.б.н. Лосевой Елене Владимировне и ее сотрудникам за проведение поведенческих тестов. Настоящая работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №02-04-48153, РФФИ №05-04-48031 и Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН. 27 ВЫВОДЫ. 1. В нейросферах происходит спонтанная дифференцировка клеток. 2. Нейросферы содержат клетки только нейрального ряда, часть из которых способна формировать розетко-подобные структуры. 3. Рост клеточной популяции в культуре обеспечивается за счет стволовых, прогениторных и глиальных клеток. 4. После трансплантации в мозг крыс клетки культур НСПК человека способны переживать не менее месяца без иммуносупрессии. 5. Переживание трансплантатов в большей степени зависит от условий предварительного культивирования, чем от факторов микроокружения мозга реципиента. 6. Трансплантаты культур НСПК человека повышают выживаемость собственных нейронов мозга крыс, перенесших действие острой гипоксии, что находит отражение в нормализации поведения животных. 7. Факторы микроокружения мозга не стимулируют нейральной дифференцировки клеток культуры МСК. 28 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. 1. Статьи. Александрова М.А., Ревищин А.В., Подгорный О.В., Полтавцева Р.А., Марей М.В., Корочкин Л.И., Сухих Г.Т., "Трансплантация культивированных стволовых клеток плода человека в мозг крыс, подвергшихся острой гипоксии", Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2004, т. 137, № 3, с. 296-300. 2. Подгорный О.В., Хейфец И.А., Александрова М.А., Лосева Е.В., Ревищин А.В., Полтавцева Р.А., Марей М.В., Корочкин Л.И., Сухих Г.Т., "Нормализация поведения крыс после гипоксии нейральными стволовыми клетками человека", Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2004, т. 137, № 4, с. 394398. 3. Александрова М.А., Подгорный О.В., Марей М.В., Полтавцева Р.А., Цитрин Е.Б., Гуляев Д.В., Черкасова Л.В., Ревищин А.В., Корочкин Л.И., Сухих Г.Т., «Характеристика нейральных стволовых клеток человека in vitro и при трансплантации в мозг крыс», Клеточные технологии в биологии и медицине, 2005, № 1, с. 13-19. 4. Подгорный О.В., Полтавцева Р.А., Марей М.В., Сухих Г.Т., Александрова М.А. «Формирование нейроэпителиальных структур в культуре нейральных стволовых клеток мозга человека», Клеточные технологии в биологии и медицине, 2005, № 3, с. 131-135. 5. Ревищин А.В., Александрова М.А., Подгорный О.В., Марей М.В., Полтавцева Р.А., Корочкин Л.И., Степанов Г.А., Сухих Г.Т., «Нейральные стволовые клетки плода человека в мозге крыс: влияние предварительного культивирования и трансплантации», Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2005, т. 139, № 2, с. 181-184. 6. Александрова М.А., Сухих Г.Т., Чайлахян Р.К., Подгорный О.В., Марей М.В., Полтавцева Р.А., Герасимов Ю.В. «Сравнительный анализ дифференцировки и поведения нейральных и мезенхимальных стволовых клеток человека in vitro и in vivo», Клеточные технологии в биологии и медицине, 2006, № 1, с. 44-52. Тезисы докладов 7. Александрова М.А., Подгорный О.В., Полтавцева Р.А., Ревищин А.В., Марей М.В., Корочкин Л.И., Сухих Г.Т., "Поведение и дифференцировка нейральных стволовых клеток человека в патологическом мозге крыс", Цитология, 2003, т. 45, № 9, 1-й съезд Общества клеточной биологии, с.842-843. 8. Александрова М.А., Подгорный О.В., Хейфец И.А., Полтавцева Р.А., Марей М.В., Ревищин А.В., Алексеева Т.Г., Лосева Е.В., Корочкин Л.И., Сухих Г.Т., "Трансплантация культивированных клеток мозга плода человека крысам, подвергнутым острой гипоксии. Поведенческие и гистологические исследования", II Московский международный Конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 2003, 10-14 ноября, с. 119-120. 9. Подгорный О.В., Ревищин А.В., Александрова М.А., Полтавцева Р.А., Марей М.В., Корочкин Л.И., Сухих Г.Т., "Образование розетко-подобных структур в нейросферах при культивировании фетальных клеток головного мозга человека in 29 vitro", тез. док.. II Московский международный Конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 2003, 10-14 ноября, с. 128-129. 10. Podgorny O.V., Aleksandrova M.A., Poltavtseva R.A., Revishchin A.V., Marey M.V., Heyfets I.A., Alekseeva T.G., Loseva E.V., Sukhikh G.T., "Transplantation of cultured human neural stem cells into rat brain after acute hypoxy", ISDN, Edinburgh, 2004, 4-7 August. 11. Александрова М.А., Подгорный О.В., Марей М.В., Полтавцева Р.А., Черкасова Л.В., Ревищин А.В., Сухих Г.Т., «Влияние методов культивирования нейральных стволовых клеток человека на их поведение после трансплантации в мозг крыс», Цитология, 2004, т. 46, № 10., с. 895-896. 12. Подгорный О.В., Александрова М.А., Марей М.В., Ревищин А.В., Полтавцева Р.А., Сухих Г.Т., «Экспрессия белков – маркеров нейральной дифференцировки в культурах стволовых клеток эмбрионального мозга человека», Цитология, 2004, т. 46, № 10., с. 935. 13. Подгорный О.В., Марей М.В., Александрова М.А., Ревищин А.В., Полтавцева Р.А., Сухих Г.Т., «Иммуногистохимическое исследование культур нейральных стволовых клеток эмбрионального мозга человека», VII Всероссийская конференция по патологии клетки, Сборник научных трудов, 2005, с. 96-97. 14. Марей М.В., Полтавцева Р.А., Подгорный О.В., Александрова М.А., Ревищин А.В., Сухих Г.Т., «Сравнительный анализ культур нейральных стволовых клеток человека при краткосрочном и длительном культивировании», VII Всероссийская конференция по патологии клетки, Сборник научных трудов, 2005, с. 78-79. 15. Александрова М.А., Подгорный О.В., Марей М.В., Чайлахян Р.К., Сухих Г.Т. «Анализ дифференцировки нейральных стволовых клеток и стромальных клеток костного мозга человека in vitro и in vivo», Конференция «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты», Москва, 2005, с. 12-13. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. ГФКБ – глиальный фибриллярный кислый белок ЛИФ – лейкоз ингибирующий фактор МСК – мезенхимные стволовые клетки. НСПК – нейральные стволовые/прогениторные клетки УРДИ – условный рефлекс двустороннего избегания ФРФ-2 – основной фактор роста фибробластов ФСТ – фетальная сыворотка теленка ЦНС – центральная нервная система ЭФР – эпидермальный фактор роста 30 31 32
