Конференция X гемосорбция ИПГ Жандосов

ЭЛИМИНАЦИЯ АЛЬБУМИН-СВЯЗАННЫХ
УРЕМИЧЕСКИХ ТОКСИНОВ И ИНТЕРЛЕЙКИНОВ
УГЛЕРОДНЫМИ НАНОСОРБЕНТАМИ
ИЗ ПЛАЗМЫ В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Ж.М. Жандосовa, З.А. Мансуров a, А.Ж. Байменовa, Д.М. Уразаеваa,
C. H. Howellb, S.V. Mikhalovskyb,с
a
Институт Проблем Горения, ул. Богенбай батыра 172, Алматы, Казахстан
b
University of Brighton, School of Pharmacy and Biomedical Science
c
Назарбаев Университет, пр. Кабанбай батыра 53, Астана, Казахстан
E-mail: jandosovj@gmail.com
Введение
Рисовая шелуха (РШ) является широко распространенной биомассой. Ежегодно во
всем мире производится более 600 млн. тонн данного вида растительного сырья. Создание
функциональных адсорбентов на её основе является экономически привлекательным, и
одновременно решает проблемы утилизации растительных отходов [1]. В частности,
адсорбенты на основе бросового сырья являются изделиями с высокой добавленной
стоимостью. Очистка крови путем гемодиализа является малоэффективным методом
элиминации высокотоксичных уремических токсинов, а именно - белковых конъюгатов
индоксилсульфата (IS) и пара-крезилсульфата (PCS), также как и воспалительных
цитокинов, в частности интерлейкинов IL6 и IL8. Хроническая болезнь почек (ХБП)
является дорогостоящим и все более распространенным заболеванием, связанным с
повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний [2-4]. Альбумин-связанные
уремические токсины (IS, PCS) накапливаются в организме и индуцируют состояние
длительного воспаления и окислительной нагрузки, ведущеее к дальнейшим нарушениям
сердечно-сосудистой, почечной и костной физиологии [5, 6]. Роль уремических токсинов,
наряду
с
воспалительными
цитокинами,
в
патофизиологии
хронического
прогрессирующего заболевания почек хорошо описана в литературе [7, 8]. Сорбционная
терапия, сочетающая применение углеродных наносорбентов (УН) с упорядоченной
пористостью, может быть использована для эффективной элиминации таких молекул,
которые плохо удаляются современной терапией гемодиализа и, таким образом может
предотвратить плохой прогноз пациентов с ХПБ.
Экспериментальная часть
Синтез углеродных материалов
Углеродные наноматериалы были синтезированы из рисовой РШ химическим
путем, который включал в себя помол смеси из РШ и K2CO3 в шаровой мельнице при двух
различных соотношениях (прибл. 22,2 и 27,8 г/моль), и последующую активацию в
инертной атмосфере в течение 0,5 и 2 ч при 950 °С для получения комбинации четырех
адсорбентов CRH-K2CO3 #1,3 и CRH-K2CO3 # 2,4 соответственно. Мезопористый
адсорбент “Mast TE 7” был получен компанией “Mast Carbon International”
(Великобритания).
Метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)
Исследования проводились на сканирующем электронном микроскопе SEM
(Zeiss NTS) с ускоряющем напряжением 5 кВ. Для исследований, гранулы CRH-K2CO3
закрепляли на держателе образцов. Предварительно на поверхность образцов в
специальной вакуумной установке Quorum (Q150TES) наносили тонкий проводящий слой
платины толщиной 4 нм для устранения эффектов зарядки.
Метод ртутной порометрии (МРП)
Пористую структуру образцов активированных углеродных материалов изучали
методом ртутной порометрии на порозиметре «PoreMaster 33/60» (Quantachrome
Instruments, Великобритания). Далее проводилась обработка данных порограмм (расчет
изотерм и определение объемов пор) с использованием программы «Quantachrome».
Метод низкотемпературной адсорбции азота
Информацию о микропористой и мезопористой текстуре (область от 17 до 3000 Ǻ)
образцов получали методом низкотемпературной адсорбции азота на анализаторе
Autosorb-1 (Quantachrome, Великобритания) после предварительной тренировки образцов,
проводимой при 200С в течение 3 часов. Далее проводили измерения изотерм адсорбции
азота при температуре жидкого азота 77К в диапазоне относительных давлений от 0,005
до 0,991. Далее проводили обработку данных (расчет изотерм, определение удельной
поверхности и объемов пор с использованием методов БЭТ и QSDFT) с использованием
программы «Quantachrome».
Адсорбционные исследования УН по метиленовому голубому.
Для проведения сорбционных исследований в статических условиях, готовились
исходные растворы метиленового голубого (МГ) с концентрациями 1000; 1500; 2000;
2500; 3000; 3500 и 4000 мг/л. Навески 0,1±0,001 г предварительно высушенного и
растертого в агатовой ступке УН переносили в стеклянную емкость вместимостью 100 мл,
добавляли 25 мл раствора МГ, накрывали чашкой Петри и перемешивали в течение 20
минут на магнитной мешалке. Суспензию переносили в пробирки и центрифугировали в
течение 15 минут, отбирали 5 мл осветлённого раствора для измерения оптической
плотности на фотоэлектроколориметре с использованием синего светофильтра, в кюветах
с расстоянием между рабочими гранями 10 мм. В качестве раствора сравнения
использовали дистиллированную воду. В случае если оптическая плотность раствора
составляла больше, чем 0,8 оптических единиц, то, для соблюдения закона БугераЛамберта-Бера раствор разбавляли в 10 раз дистиллированной водой. По значению
оптической плотности, используя градуировочный график, определяли остаточную
концентрацию МГ в растворе.
Адсорбционную способность УН по МГ (qе) вычисляли по формуле:
qе= 0,025(С0 – kСе)/m
(1)
где С0 – концентрация исходного раствора красителя (мг/л); Се – концентрация
раствора после сорбции (мг/л); k – коэффициент разбавления; m - масса УН (г). По
результатам экспериментов, в координатах Ce/qe-Ce построены изотермы адсорбции
Лангмюра в линеаризованной форме, имеющей следующий вид:
Ce
qe

1
qmax K 1

Ce
qmax
(2)
Значения сорбционной емкости (qmax)- емкости монослоя МГ рассчитывали графически.
Методика определения йодного числа
В данной работе йодное число (IN) определялось в соответствии со стандартом
ASTM D4607-94. При этом определяется количество йода в мг, которое может
адсорбироваться 1 г активированного угля. Методика определения йодного числа
основана на использование сорбционной модели Фрейндлиха, согласно следующим
уравнением:
1
𝑞 = 𝐾 ∙ 𝐶𝑛
(3)
где C – равновесная концентрация йодного раствора, К – константа Фрейндлиха,
1/n – адсорбционный показатель
Зависимость логарифма удельной адсорбции по йоду от логарифма равновесной
концентрации йода графически выражается прямой линией, отсекающей на оси ординат
отрезок, равный logК:
1
𝑙𝑜𝑔𝑞 = 𝑙𝑜𝑔𝐾 + 𝑛 𝑙𝑜𝑔𝐶
(4)
Используя тангенс угла наклона, вычисляют адсорбционный показатель (tgα = 1/n). При
условной концентрации 2,5 г/л (0,02 моль/л) рассчитывают йодное число. Методика
измерения включает в себе следующие этапы: обработка образца активированного угля
10 мл 5% HCl, упаривание от НСl, приливание 25 мл 0,1 н раствор йода к испытуемому
образцу, вакуумирование, перемешивание, центрифугирование, титрование 0,1 н
раствором тиосульфата натрия, используя крахмал в качестве индикатора йода.
Адсорбцию йода вычисляют согласно формуле:
𝐼
𝑞=
2 )∙𝑉
(𝐶0 −𝐶равн
𝑚АУ
(4)
где q – количество йода (мг), адсорбированного на 1г АУ, 𝐶0 – начальная концентрация
𝐼2
йодного раствора (приблизительно 12, 69 г/л), 𝐶равн
–равновесная концентрация р-ра йода
(найденная путем титрования р-ром Na2S2O3), г/л, 𝑉 – объем йодного раствора (25 мл),
𝑚АУ - масса активированного угля, г.
Исследование адсорбции уремических токсинов и воспалительных цитокинов
Для проведения адсорбционных исследований брали 3 навески испытуемого
сорбента по 0,02 г для каждого периода инкубации (5, 30, 60 мин). Навески помещали в
пробирки Эппендорфа, предварительно уравновешивали 800 мкл натрий-фосфатного
буфера путем перемешивания в шейкер-инкубаторе при 37 °С в течение 2 часов.
Пробирки центрифугировали при 8000 об/мин в течение 3 минут, после чего
надосадочную жидкость удаляли. Готовили раствор человеческой плазмы с PCS (1 мМ),
IS (0,5 мМ), и инкубировали в шейкер-инкубаторе при 37 °С в течение 1 часа. После
инкубации, 750 μл плазмы, зараженной токсинами приливали к сорбентам и
контрольному образцу, и инкубировали в шейкер-инкубаторе при 37 °С в течение 5, 30 и
60 минут. По прошествии каждого периода инкубации, надосадочную жидкость отделяли
от сорбентов путем центрифугирования, помещали в пробирки Эппендорфа и хранили
при температуре -80 °С в морозильнике.
ВЭЖХ анализ уремических токсинов PCS и IS
Высокоэффективную
жидкостную
хромотографию
проб
проводили
с
использованием колонки Fortis, Waters 717 Plus Autosampler (при 15 °С), печи Perkin
Elmer Series 200 и LC насоса (при 25 °С), флуоресцентного детектора Varian Prostar
модели 360 и интерфейса РЕ Nelson 900 Series. Метод ВЭЖХ был описан де Лоором [9] с
использованием конкурентноспособного связывания альбумина октаноатом натрия для
измерения общего количества PCS и IS находящихся в плазме.
Иммуноферментный анализ IL6 и IL8
Для проведения иммуноферментного анализа (ИФА), использовали 96 ячеечный
микропланшет (ряды (А-Н) х (1-12)). Для сенсибилизации поверхности, в каждую ячейку
добавили по 100 мкл раствора (0,05 мл иммобилизованных антител, разбавленных в 12,5
мл буфера) использую ряды (А-Н)х(1-12) для стандартов и количество повторов (n=2) для
каждого экспериментального образца. Микропланшет покрыли парафильмом и поместили
на ночь в холодильник. Далее микропланшет промывали буфером (10 таблеток PBS
растворенных в 1 л дистиллированной воды с добавлением 500 мкл “Tween 20”) 3 раза,
заполнили 200 мкл разбавителя и оставили при комнатной температуре на 1 ч, после чего
снова промыли буфером 3 раза. Приготовленные растворы IL6 и IL8 добавили по 100 мкл
в 1 и 2 столбцы ячеек, затем разбавили в следующих столбцах таким образом, чтобы
концентрация раствора предыдущего образца была в два раза больше. Далее в ячейки
добавили по 100 мкл разбавленных экспериментальных образцов. После 2 ч инкубации
промывали PBS-буфером 5 раз. После этого добавили 100 мкл раствора обнаруживающих
антител меченных ферментом (авидин-HRP реагент), затем инкубировали в течение 1 ч
при комнатной температуре. Пластину промывали 7 раз PBS-буфером в течение 30
секунд. Добавили 100 мкл раствора субстрата (ТМБ) в каждую ячейку. Выдерживали в
темноте при комнатной температуре в течение 10-30 минут, затем добавили 50 мкл
закрепителя (2н H2SO4) в каждую ячейку. Измерили оптическую плотность при длине
волны 450 нм в приборе (ELISA microplate reader).
Результаты и обсуждение
СЭМ Изображения образца CRH-K2CO3 #3 показаны на Рисунке 1. Морфология
поверхности CRH-K2CO3 #3 образца характеризуется развитой структурой, имеющие
макро- и нанопористость (рис 1а – макропористая губка, рис 1б – перегородка).
(а)
(б)
Рисунок 1 – СЭМ-снимки образца CRH K2CO3 #3:
а -увеличение x20 000; б -увеличение x100 0000;
Из снимков, приведенных на рисунке 1 (а, б) видно, что текстура активированных
образцов сохранила исходную морфологию рисовой шелухи, несмотря на жесткую
химическую обработку. На рисунке 1 б видна развитая пористая поверхность образца,
содержащая наноразмерные элементы- поры
Текстурные характеристики K2CO3 активированных образцов рисовой шелухи,
полученных путем исследования методом низкотемпературной адсорбции азота
приведены в таблице 1. Образцы активированные в течение 0,5 ч (CRH-K2CO3 #1 и 3)
имеют более высокую удельную поверхности, по сравнению с образцами,
активированными в течение 2 часов.
Таблица 1 – Результаты адсорбции азота для образцов CRH-K2CO3
Образец
CRH-K2CO3 #1
CRH- K2CO3 #2
CRH- K2CO3 #3
CRH- K2CO3 #4
SБЭT
м2/г
1655
691
1272
552
SDFT
м2/г
1182
480
1178
366
VDFT
см3/г
1.6
1.2
1.0
0.6
Dпор
нм
4.0
4.0
0.6
3.3
Сравнительные данные полученные с использование различных адсорбционных
методов показаны в Таблице 2. Значения йодного числа близки к данным удельной
поверхности по БЭТ. Кроме того, большие объемы мезопор полученные методом ртутной
порометрии и большие площади поверхности по БЭТ, соответствуют максимальной
адсорбционной способности по МГ согласно модели Лангмюра.
Таблица 2 – SБЭТ, йодное число, емкость монослоя метиленового голубого и
объем мезопор по данным ртутной порометрии для образцов CRH-K2CO3
Образец
SБЭT
м2/г
CRH-K2CO3 #1
CRH- K2CO3 #2
CRH- K2CO3 #3
CRH- K2CO3 #4
1655
691
1272
552
Йодное
число
мг/г
1438
1545
-
МГ qmax
мг/г
578
259
621
272
МРП
Vмезо
см3/г
0.39
0.15
0.44
0.32
Данные ртутной порометрии для образцов из рисовой шелухи, активированной
K2CO3, полученных в Институте проблем горения были проанализированны програмным
обеспечением “Quantachrome” и предоставлены на Рисунке 2.
Рисунок 2 – Распределение пор по размерам образцов CRH-K2CO3 согласно
данным ртутной порометрии
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1 23
IS concentration remaining µM
PCS concentration remaining µM
Элиминация PCS и IS в предварительных экспериментах по кинетике адсорбции
согласно результатам ВЭЖХ анализа представлены на рисунке 3. Образцы CRH-K2CO3
#1-4 показали наибольший потенциал для элиминации токсинов. Степень сорбции
образцов CRH-K2CO3 #1 и #3 составила порядка ~ 90% PCS и ~100% IS, по сравнению со
степенью элиминации токсинов сорбентом MAST ТЕ7 (~ 50 и 57%, соответственно).
700
600
500
400
300
200
100
1
2
3
0
(а)
(б)
Рисунок 3 – Остаточные концентрации (а) PCS и (б) IS в плазме после инкубации с
углеродными образцами, в течение 5 минут (1), 30 минут (2) и 60 минут (3).
На рисунке 4 представлены молекулярные модели, вес и размер воспалительных
цитокинов IL6 и IL8.
IL6: 26kDa (5x5x12нм)
IL8: 8kDa (4x4x9нм)
Рисунок 4 – Модельные изображения интерлейкинов IL6 и IL8
Примером неконкурентного формата ИФА является «сэндвич»-метод (рис. 5). К
носителю с иммобилизованными антителами (1) добавляют раствор, содержащий
анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе
образуется комплекс антиген-антитело (2). Затем носитель отмывают от несвязавшихся
компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела (3). После
вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют
ферментативную
активность носителя, которая пропорциональна начальной
концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического
иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами
иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого
распространения названия «сэндвич» метод (4). Ферментативная реакция (цветная
реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного
неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до
окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования (5).
Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител.
Результат оценивается спектрофотометрически и позволяют судить о концентрации
антигена в растворе (интерлейкины IL6 и IL8) .
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Рисунок 5 – Схема иммуноферментного анализа
600
500
400
300
200
100
0
1
23
IL-8 concentration (pg/ml)
IL6 concentration (pg/ml)
На рисунке 6 представлены остаточные концентрации IL6 и IL8 по результатам
предварительных экспериментах по кинетике адсорбции, согласно данным ИФА.
1400
1200
1000
800
600
2
1
3
400
200
0
(а)
(б)
Рисунок 6 – Остаточные концентрации IL6 (а) и IL8 (б) в плазме после инкубации с
образцами сорбентов в течение 5 минут (1), 30 минут (2) и 60 минут (3).
Образцы CRH-K2CO3 #1-4 показали перспективу использования в процессах
элиминации токсинов из человеческой плазмы. Степень сорбции образцов CRH-K2CO3 #2
и 4 составила 35-40% для IL6, а образцы CRH-K2CO3 #2 и 4 показали 100 % элиминацию
IL8, в то время как образец MAST ТЕ7 показал меньшую степень сорбции токсинов.
Заключение
В ходе работы были получены углеродные материалы синтезированные из
растительного сырья. Их характеристики были изучены с помощью ряда физикохимических методов исследования: низкотемпературная адсорбция азота, ртутная
порометрия, СЭМ, сорбция метиленового голубого. Полученные данные показали, что:
1. Образцы CRH K2CO3 #1,3 обладают наибольшей удельной поверхностью, равной
1655 м2/г и 1272 м2/г соответственно.
2. Ряд образцов CRH K2CO3 #1-4 показали наибольший объем мезопор: 0,15-0,44 см3/г.
3. Согласно ВЭЖХ анализу, степень сорбции образцов CRH-K2CO3 #1 и 3 составляет
~90% PCS и ~100% IS.
4. Данные ИФА показали, что образцы CRH-K2CO3 #1-4 способны удалять 35-40% IL6,
и 100 % IL8.
Согласно проведенным исследованиям, полученные углеродные материалы
представляют потенциал в качестве составного компонента сорбентов для очистки крови
путемгемоперфузии.
Литература
1. Z.A. Mansurov, M.K. Gilmanov, in: Sorbents: Properties, Materials and Applications,
Edited Thomas P. Willis, Nova Science Publishers Inc., NY (2009), Chapter 3, pp. 217-284.
2. Steenkamp R, Castledine C, Feest T, Fogarty D. UK RRT Prevalence in 2009: national
and centre-specific analyses. The UK renal registry 13th annual report. 2010;35-60.
3. Stenvinkel P. Chronic kidney disease: a public health priority and harbinger of
premature cardiovascular disease JnInt Med 2010; 1365: 2796
4. Glorieux G, Cohen G, Jankowski J, Vanholder R. Platelet/Leukocyte Activation,
Inflammation, and Uremia. Seminars in Dialysis 2009; 22(4):423-427.
5. Fujii H, Nakai K, Fukagawa M. Role of Oxidative Stress and IndoxylSulfate in
Progression of Cardiovascular Disease in Chronic Kidney Disease.Therapeutic Apheresis and
Dialysis 2011;15(2):125–12
6. Jourde-Chiche N, Dou L,Cerini C, Dignat-George F,Vanholder R, Brunet P. ProteinBound Toxins—Update 2009.Seminars in Dialysis 2009; 22(4) :334–339.
7. Carrero JJ, Park S-H ,Axelsson J, Lindholm B, Stenvinkel P. Cytokines,
Atherogenesis, and Hypercatabolism in Chronic Kidney Disease: A Dreadful Triad.Seminars in
Dialysis. 2009; 22(4):381–386.
8. Himmelfarb J. Uraemic toxicity, oxidative stress and haemodialysis as renal
replacement therapy. Seminars in Dialysis.2009; 22(6) :636–643.
9. De Loor H, Meijers B, Meyer T, Bammens B, Verbeke K, Dehaen W, Evenepoel P.
Sodium octanoate to reverse indoxyl sulphate and p-cresylsufate albumin binding in uremic and
normal serum during sample preparation followed by fluorescence liquid chromatography.
Journal of Chromatography A, 1216 (2009):4684-4688.