Erwinia amylovora
реклама
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ВЕТЕРИНАРНОМУ И ФИТОСАНИТАРНОМУ НАДЗОРУ Федеральное государственное бюджетное учреждение «ВСЕРОССИЙСКИЙ ЦЕНТР КАРАНТИНА РАСТЕНИЙ» (ФГБУ «ВНИИКР») УТВЕРЖДАЮ Директор ФГБУ «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР») _______________ У.Ш. Магомедов «___» __________________ 2014 г. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА КЛАССИЧЕСКОЙ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ОЖОГА ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. В РАСТИТЕЛЬНОМ ЭКСТРАКТЕ (В СООТВЕТСТВИИ СО STÖGER ET AL., 2006) (отчет) Москва - 2014 г. Отчет по теме «Валидация метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006)» подготовлен младшим научным сотрудником лаборатории бактериологии и молекулярных методов бактериологии и К.П. Корневым, А.А. Кузнецовой, молекулярных младшим методов научным заведующим ФГБУ лабораторией «ВНИИКР» сотрудником к.б.н. лаборатории бактериологии и молекулярных методов И.Н. Писаревой, младшим научным сотрудником лаборатории С.И. Приходько, бактериологии младшим научным и молекулярных сотрудником методов лаборатории бактериологии и молекулярных методов И.М. Игнатьевой, младшим научным сотрудником лаборатории бактериологии и молекулярных методов М.Б. Баландиной. Материалы рассмотрены и одобрены ученым советом ФГБУ «ВНИИКР» (протокол № ____ от «______» _________ 2014 г.). Редактор – Т.В. Артемьева. 2 Оглавление Введение……………………………………………………………………….. 4 1. Материалы и методы исследований…………………………………… 7 1.1. Растительный материал……………………………………………..... 7 1.2. Получение стандартной базовой суспензии культуры Erwinia amylovora и инокуляция растительных экстрактов…..…….………. 7 1.2.1. Получение стандартной базовой суспензии……………………. 7 1.2.2. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности.….. 8 1.2.3. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности для определения селективности……………..……………………….……. 9 1.3. Изоляты и штаммы бактерий…………..……………………………. 10 1.4. Выделение ДНК из растительных экстрактов…………...…………. 11 1.5. Постановка классической ПЦР……………………….....................….. 11 2. Результаты тестирований и обсуждение……………………………..…. 2.1. Определение стандартной базовой суспензии 14 культуры E. amylovora……………………………………………..………………….. 14 2.2. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности………... 14 2.3. Аналитическая чувствительность…………..……………...………….. 15 2.4. Аналитическая специфичность…………………………...…………… 16 2.5. Селективность……………………………………………..……………. 21 2.6. Повторяемость…………………………………...……………………… 23 2.7. Воспроизводимость…………………………………………..………… 24 Выводы………………………………………………………...………………. 26 Заключение………………………………………………………….…………. 27 Список литературы……………………………………………….…………… 28 Приложение 1…………………………………………………..……………... 30 Приложение 2………………………………………………..………………... 44 3 Введение Разработка систем управления качеством (также называемых системами управления или системами качества) и аккредитация на соответствие Стандарту ISO/IEC 17025 стали проблемными вопросами для многих лабораторий в регионе ЕОКЗР. Традиционно аккредитация лабораторий основывается на фиксированной области аккредитации, что четко и однозначно определяет серию тестов, которые она охватывает (например, иммунофлуоресцентный тест на выявление Ralstonia solanacearum в клубнях картофеля). Однако в современных условиях, когда активно развиваются новые направления в диагностике, а также могут меняться запросы клиентов к конкретной лаборатории, фиксированная область аккредитации не позволяет с легкостью добавлять новые или модифицированные тесты в область деятельности лаборатории. Вследствие этого была разработана концепция гибкой области аккредитации. Гибкая аккредитация позволяет лаборатории выполнять определенные тесты и сообщать о результатах как об аккредитованных даже в том случае, если эти тесты четко не указаны в области деятельности лаборатории («Требования к гибкой аккредитации» EA-2/15, 2008). Опыт фитопатологических лабораторий показывает, что при гибкой области аккредитации лаборатория несет больше ответственности за подтверждение надежности и достоверности (валидности) тестов, их соответствия обстоятельствам использования и подтверждение того, что они проводятся компетентно и единообразно. Аккредитованная лаборатория должна использовать только те тесты, которые прошли валидацию (признаны надежными и достоверными). Возможно использование тестов, валидированных ранее другими лабораториями. В противном случае тесты должны пройти процедуру валидации в лаборатории, которая намеревается использовать данный тест. 4 Валидация проводится для предоставления объективных данных о том, что данный тест соответствует условиям использования. В сфере диагностики вредных организмов растений тест должен быть подходящим для проведения рутинной диагностики. Тест считается полностью валидным, когда предоставляются данные о следующих рабочих критериях: аналитическая чувствительность, аналитическая специфичность, воспроизводимость и повторяемость. В зависимости от области применения также может возникнуть необходимость в определении его селективности. Тесты, прошедшие валидацию и имеющие предоставленные рабочие критерии, считаются «стандартными тестами». Не все тесты, включенные в диагностические протоколы ЕОКЗР, являются валидированными; опрос, проведенный в 2008 и 2013 годах на предмет их использования (Petter & Suffert, 2010) показал, что тесты, представленные в Приложении 2, широко используются. Следовательно, эксперты-участники группы ЕОКЗР по диагностике считают, что эти тесты показывают соответствующий уровень повторяемости и воспроизводимости. Лаборатории, использующие данные тесты, должны по крайней мере получить данные по проверке аналитической чувствительности и аналитической специфичности. Валидация метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006) была проведена согласно схеме, описанной в Стандарте ЕОКЗР PM 7/98 (2) (рис. 1). В данном отчете приводятся результаты исследований по валидации метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006), c использованием различных коммерческих реагентов и оборудования, имеющихся в лаборатории бактериологии и молекулярных методов Испытательного экспертного центра (ИЭЦ) ФГБУ «ВНИИКР». 5 Определите организм Определите природный субстрат Определите тест Определите предполагаемые показатели рабочих характеристик Смотрите таблицы 4-9 Стандарта ЕОКЗР PM 7/98 (2) Определите основные ключи для валидации (например используемое оборудование) Составьте план проведения валидации Аналитическая специфичность/селективность* Требуемые значения получены Совершенствование путем корректировки теста Требуемые значения не получены Выберите новый тест Тест не может быть признан валидным Аналитическая чувствительность* Совершенствование путем корректировки теста Требуемые значения получены Требуемые значения не получены Выберите новый тест Тест не может быть признан валидным Повторяемость/воспроизводимость Совершенствование путем корректировки теста Требуемые значения получены Требуемые значения не получены Выберите новый тест Тест не может быть признан валидным Отчет о валидации Заявление о том, что тест успешно охватывает область действия * В зависимости от предполагаемого использования теста оценка аналитической чувствительности может проводиться до оценки специфичности и селективности Рис. 1. Процесс валидации 6 1. Материалы и методы исследований 1.1.Растительный материал Для валидации метода классической ПЦР с использованием диагностической системы к возбудителю ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. использовали смесь замороженных при 20 °С экстрактов вегетативных частей (ветвей) растений сем. Розовые (Rosáceae), свободных от возбудителя и искусственно инокулированных культурой Erwinia amylovora. Растительные экстракты получены согласно диагностическому протоколу ЕОКЗР PM 7/20 (2) (OEPP/EPPO Bulletin, 2013) и «Методическим рекомендациям по выявлению и идентификации Erwinia amylovora (СТО ВНИИКР 4.001-2010). 1.2. Получение стандартной базовой суспензии культуры Erwinia amylovora и инокуляция растительных экстрактов 1.2.1. Получение стандартной базовой суспензии Для получения стандартной базовой суспензии с концентрацией 107 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл петлю культуры возбудителя суспензировали в 1000 мкл 0,01 М стерильного фосфатно-солевого буфера1 (PBS) и готовили серию десятикратных разведений, последовательно перенося 100 мкл предыдущего разведения к 900 мкл PBS последующего. Далее проводили посев 100 мкл суспензии из каждого разведения в чашки Петри на питательную среду Levan2 для подсчета числа КОЕ. В результате получали суспензию с различным содержанием КОЕ патогена. Состав фосфатно-солевого буфера (PBS): Na2HPO4 х 12Н2О 2,9 г/л, КH2PO4 х 2Н2О 0,2 г/л, NaCl 8,0 г/л, KCl 0,2 г/л, дистиллированная вода 1 л, рН 7,2. 1 Состав питательной среды Levan: дрожжевой экстракт 2,0 г/л, пептон бактериологический 2,0 г/л, сахароза 50 г/л, NaCl 5,0 г/л, агар бактериологический 15,0 г/л, дистиллированная вода 1 л, рН 7-7,2. 2 7 1.2.2. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности В соответствии со Стандартом ЕОКЗР РМ 7/98 (2), для определения аналитической чувствительности используют 3 серии (повторности) экстрактов с уровнем зараженности 101-106 клеток целевого организма на миллилитр. Образцы с различным уровнем зараженности готовили по следующей схеме: 1. Готовили экстракт вегетативных частей в количестве, необходимом для оценки четырех методов выделения ДНК, смешивая протестированные ранее экстракты, хранившиеся при -20 °С. Экстракты были приготовлены согласно СТО ВНИИКР 4.001-2010. Для этого растительный материал встряхивали в 30 мл фосфатного3 буфера в течение 90 минут. Фильтровали через бумажный фильтр и центрифугировали 10 мин на 8000 об/мин при 5 °С. Удалили супернатант и ресуспендировали осадок каждого образца в 1 мл фосфатно-солевого буфера. 2. Приготовили 7 10-кратных разведений базовой суспензии с концентрацией 106-100 КОЕ/мл, объемом 1000 мкл каждый, в соответствии с п. 1.2.1. 3. В новые пробирки переносили 900 мкл растительного экстракта и добавляли 100 мкл бактериальной суспензии начиная с базовой, с концентрацией 107 КОЕ/мл и далее последовательно, заканчивая концентрацией 100 (табл. 2). Всего было приготовлено 3 серии (повторности) образцов из каждого из 10-кратных разведений. Далее каждый образец был разделен на субобразцы, объем которых составил 200 мкл. 4. В качестве отрицательного контроля использовали чистый экстракт, свободный от возбудителя ожога плодовых. Состав фосфатного буфера (PB): Na2HPO4 4,26 г/л, КH2PO4 2,72 г/л, дистиллированная вода 1 л, рН 7,0. 3 8 5. Оставшуюся базовую суспензию и 10-кратные разведения поместили в морозильную камеру при -20 оС для дальнейших испытаний. 1.2.3. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности для определения селективности Согласно Стандарту ЕОКЗР РМ 7/98 (2), для определения селективности необходимо оценить влияние природного субстрата, что применительно к бактериям означает оценку влияния экстрактов различных растений-хозяев исследований. и различных Определение сортов растений-хозяев селективности на качество осуществляется путем добавления различных концентраций бактериальной культуры в экстракты вегетативных частей здоровых растений (ветви) различных сортов сем. Розовые (Rosáceae). Для определения влияния природного субстрата в лаборатории бактериологии и молекулярных методов ИЭЦ использовали растительные экстракты различных растений-хозяев с пороговыми/пограничными положительными концентрациями возбудителя, согласно пункту 1.2.2, определенные в результате изучения аналитической чувствительности диагностической системы. В опыте использованы 18 экстрактов вегетативных частей растений-хозяев, полученных в результате проведения лабораторной экспертизы: груши (Prunus communis), яблони (Malus domestica), боярышника (Crataegus sanguinea), кизильника (Cotoneaster melanocarpa), рябины (Sorbus aucuparia), айвы (Cydonia oblonga), аронии черноплодной (Aronia melanocarpa), малины (Rubus idaeus), роз (Rosa rugosa), спиреи (Spirea japonica), черемухи (Padus racemosa), ирги (Amelanchier ovalis), лапчатки (Pentaphylloides fruticosa), пузыреплодника (Physocarpus opulifolius), земляники (Fragaria vesca), сливы (Prunus domestica), вишни (Cerasus vulgaris) и черешни (Cerasus avium). Были приготовлены 3 серии (повторности) экстрактов вегетативных частей растений, перечисленных выше, с концентрацией патогена 102, 103 и 104. 9 1.3.Изоляты и штаммы бактерий Для изучения аналитической чувствительности, повторяемости, воспроизводимости и селективности использовали референтный штамм E. amylovora 0172 (CFBP 1430) из бактериологической коллекции ФГБУ «ВНИИКР», полученный из Института аграрных исследований (Валенсия, Испания). Согласно Стандарту ЕОКЗР РМ 7/98, для определения аналитической специфичности испытуемой диагностической тест-системы необходимо провести анализ генетическое (во-первых) разнообразие, штаммов разное целевой бактерии, географическое учитывая происхождение и растений-хозяев и (во-вторых) ряда нецелевых бактерий, в частности, бактерий, которые могут присутствовать в образцах. Рекомендуется использовать суспензии клеток чистых культур в соотношении, приблизительно 106 КОЕ/мл. Также дополнительно результаты теста могут быть подтверждены компьютерным (in silico) сравнением последовательностей праймеров/зонда с последовательностями геномных библиотек. Для определения специфичности были использованы более 120 штаммов вида E. amylovora, выделенных при проведении экспертизы в лаборатории бактериологии и молекулярных методов ИЭЦ ФГБУ «ВНИИКР», штаммы видов E. billingae, E. tasmaniensis, E. piriflorinigrans, присутствие которых возможно в растительных экстрактах. Также для изучения специфичности была использована ДНК видов Erwinia pyrifoliae и Erwinia uzenensis, полученная в рамках рабочего блока 2 («оценка рабочих характеристик теста» Erwinia sp.), проекта Phytfire («Фитосанитарная диагностика, выявление в полевых условиях и эпидемиология Erwinia amylovora») Европейской организацией координирования фитосанитарных исследований EUPHRESCO II (http://www.euphresco.net). Кроме материала, описанного выше, для определения специфичности использовали более 80 10 штаммов нецелевых видов бактерий из коллекции ФГБУ «ВНИИКР», выделенных из различных растительных образцов при проведении бактериологической экспертизы, штаммы, полученные из лабораторий Ленинградского и Краснодарского референтных центров Россельхознадзора, а также приобретенные и полученные из европейских коллекций (Приложение 1). 1.4.Выделение ДНК из растительных экстрактов Выделение ДНК из растительных экстрактов проводили при помощи коммерческого набора «Проба-ГС» ООО «АгроДиагностика» для выделения ДНК из растительной ткани в соответствии с инструкций производителя. Метод основан на использовании для лизиса клеток гуанидин тиоционата (GuSCN) с последующей сорбцией ДНК на носителе: стеклянные бусы, диатомовая земля и т.д. После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она снимается элюирующим раствором. Выделение ДНК из чистых культур для определения аналитической специфичности диагностической системы проводили методом кипячения, для этого бактериальную культуру суспендировали в 200 мкл фосфатного буфера, далее микропробирки с образцами инкубировали 10 мин при 98 оС в твердотельном термостате, охлаждали 5 мин в морозильной камере, центрифугировали 3 мин при 7000 об/мин, проводили амплификацию. 1.5.Постановка классической ПЦР Для проведения классической ПЦР были использованы следующие праймеры, синтезированные в ООО Агентство «Химэксперт», разработанные на основе участка плазмиды pEA29 (Stöger et al., 2006): PEANT 1 5’ – TATCCCTAAAAACCTCAGTGC – 3 11 PEANT 2 5’ – GCAACCTTGTGCCCTTTA – 3 Основные исследования проводили в термоциклере VeritiTM (Applied Biosystems, США). При составлении реакционных смесей использовали готовые окрашенные 5х ПЦР-МастерМиксы (5x ScreenMix-HS) компании ЗАО «Евроген», состав смесей и условия проведения ПЦР представлены в таблице 1. Размер ампликона составляет 391 п.о. Окончательный объем реакционной смеси составлял 20 мкл. Таблица 1 Состав реакционных смесей и условия амплификации для постановки классической ПЦР Компоненты Объем (V), мкл Конечная концентрация 1x Включено в Master Mix Включено в Master Mix Включено в Master Mix 250 нМ 250 нМ 1x Включено в 10x ВК ЭФ Ультрачистая вода 11,0 5х ПЦР-буфер 4,0 MgCl2 (25 mM) Включено в Master Mix d-NTP (25 mM) Включено в Master Mix Taq-полимераза Включено в Master Mix Прямой праймер (10 рM/µl) 0,5 Обратный праймер (10 рM/µl) 0,5 ВК ЭФ (10х) 2,0 праймер Mus 714F (10 pmol/µl) Включено в 10x ВК ЭФ праймер Mus 714R (10 Включено в 10x ВК ЭФ Включено в 10x ВК ЭФ pmol/µl) плазмида Mus 714_6 (10 нг/µl) Включено в 10x ВК ЭФ Включено в 10x ВК ЭФ ДНК образца 2,0 Объем реакции 20,0 Условия амплификации классической ПЦР Температура, оС Время Количество циклов 96 15 мин 1 95 15 с 58 30 с 35 72 45 с 72 5 мин 1 В качестве внутреннего контроля, позволяющего оценить корректность постановки реакции и отсутствие ингибиторов, использовали систему внутреннего контроля на основе гена мыши, встроенного в вектор (Мазурин 12 и др., 2012). Внутренний контроль состоял из плазмидного вектора и праймеров, размер ампликона составляет 714 п.о.: Mus 714F 5’ – CTTCTGGCGTTTCAGAGACC – 3 Mus 714R 5’ – GGCTCCTCTTGTGCAGATTC – 3 В пробирке одновременно проходят две реакции – амплификация специфического фрагмента генома патогенного организма и ДНК внутреннего контроля. Количество матрицы для внутреннего контроля подобрано так, чтобы не ингибировать амплификацию специфического фрагмента, поэтому при высокой концентрации специфической матрицы синтез внутреннего контроля может отсутствовать. При испытании воспроизводимости амплификация проводилась разными специалистами в разные дни, на следующих термоциклерах: VeritiTM (Applied Biosystems, США), Mastercycler personal (Eppendorf, Германия), C1000 Touch (BioRad, США). Результаты реакции амплификации регистрировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием в гель-документирующей системе Molecular ImagerGel Doс XR (BioRad, США). Размер продукта ПЦР измеряли, используя маркеры молекулярного веса GeneRuler™ 100+ п.н. и Fast Ruler™ (Fermentas). При проведении электрофореза использовали камеры производства «Хеликон» (Россия), источник напряжения Эльф («ДНК-технология») со следующими параметрами: 115 В, 165 мА, 40 Вт. 13 2. Результаты тестирований и обсуждение 2.1. Определение стандартной базовой суспензии культуры E. amylovora Результаты постановки метода серийных разведений описанного в п. 1.2.1, представлены в таблице 2. Таблица 2 Получение стандартной базовой суспензии E. amylovora № разведения Колоний на чашке Петри КОЕ/мл КОЕ/мл растительного экстракта Концентрация копий мишени в субобразце (200 мкл) Минимальное количество копий мишени ДНК (2 мкл) 0 1 2 3 4 5 6 7 газон газон газон газон 602 66 9 - 107 106 105 104 103 102 101 100 - 6,0 х 106 6,0 х 105 6,0 х 104 6,0 х 103 6,6 х 102 9,0 х 101 9,0 х 100 - 1,2*106 1,2*105 1,2*104 1204 132 18 - - - - - ≈ 24,1 ≈ 2,6 ≈ 0,4 - Из таблицы 2 видно, что искомая базовая стандартная концентрация 107 КОЕ/мл была получена в нулевом разведении. 2.2. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности Результаты подготовки растительных экстрактов с различным уровнем зараженности представлены в таблице 2. Приведенные данные показывают, что концентрация патогена в растительных экстрактах составила 9,0*100, 9,0*101, 6,6*102, 6,0*103, 6,0*104, 6,0*105, 6,0*106 КОЕ/мл, соответственно, дальнейшая концентрация возбудителя в субобразцах (200 мкл) № 1-6 составила: 1,8*101, 1,3*102, 1,2*103, 1,2*104, 1,2*105, 1,2*106. Минимальное количество копий мишени в 2 мкл ДНК для постановки ПЦР составило ≈ 0,4*100, 2,6*101, 24,1*102, 1,2*103, 1,2*104, 1,2*105, 1,2*106. 14 2.3. Аналитическая чувствительность В соответствии со Стандартом ЕОКЗР РМ 7/98 (2), для определения аналитической чувствительности необходимо проанализировать как минимум 3 серии (повторности) образцов зараженных растительных экстрактов в соотношении 100-106 клеток целевого организма на миллилитр. Серии образцов зараженных растительных экстрактов подготовлены в соответствии с п. 1.2.2, результаты определения аналитической чувствительности представлены таблице 3. Таблица 3 Результаты определения чувствительности классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006) с использованием коммерческого набора «Проба-ГС» ООО «АгроДиагностика» Метод выделения/ Разведение (КОЕ/мл) 106 105 104 103 102 101 100 Квыделения Кчистая зона Из результатов, Серия Результат ВК Результат спец Результат ВК Результат спец Результат ВК Результат спец Результат ВК Результат спец Результат ВК Результат спец Результат ВК Результат спец Результат ВК Результат спец Результат ВК Результат спец Результат ВК Результат спец представленных «Проба-ГС» 1 2 3 + + + + + + + + + + + – + – + + + + + + + + + – + – + – + – + – + + + + + + + + + + + – + – в таблице 3, видно, что чувствительность метода с использованием коммерческого набор «Проба15 ГС» позволила выявить возбудителя ожога плодовых в концентрации 103 КОЕ/мл во всех трех сериях (100%), возбудителя в концентрации 102 КОЕ/мл в двух сериях из трех (66,66%). 2.4. Аналитическая специфичность Сведения о специфичности диагностической системы классического ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) в растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006) представлены в таблице 4. Полная информация о штаммах, использованных для определения аналитической специфичности, а также результаты классического ПЦР представлены в Приложении 1. Таблица 4 Результаты определения специфичности метода ПЦР «в реальном времени» для возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. (в соответствии с Stöger et al., 2006) Количество Реакция исследованных с системой штаммов Erwinia amylovora Тамбовская область 16 + Самарская область 12 + Волгоградская область 8 + Воронежская область 10 + Саратовская область 2 + Липецкая область 14 + Калининградская область 13 + Ставропольский край 8 + Белгородская область 1 + Пензенская область 9 + Кабардино-Балкарская Республика 5 + Карачаево-Черкесская Республика 1 + Всего 99 Штаммы Erwinia amylovora из зарубежных коллекций Республика Казахстан 18 + Республика Молдова 2 + Французская Республика 1 + Республика Польша 6 + Всего 27 Вид бактерии (штаммы/изоляты), происхождение 16 Erwinia sp. Erwinia billingiae Erwinia tasmaniensis Erwinia piriflorinigrans Erwinia uzenensis Erwinia pirifoliae Всего Ralstonia solanacearum Арабская Республика Египет Республика Индия Китайская Народная Республика Народная Республика Бангладеш Московская область Штаммы из зарубежных коллекций Всего Иные виды Ochrobacterium sp. Rahnella aquatilis Pseudomonas congelans Curobacterium flaccumfaciens pv. flacumfaciens Enterobacter amnigenus Ochrobactrum anthropi Artrobacter castelli Acidovorax citrulli Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Pectobacterium atrosepticum Pantoea stewartii subsp. stewartii Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Xilophilus ampelinus Dickeya sp. Xanthomonas fragaria Xanthomonas campestris pv. raphani Xanthomonas arboricola pv. pruni Всего 1 1 2 1 1 6 - 32 4 4 1 6 4 51 - 1 1 1 1 1 1 1 3 1 2 8 4 1 3 3 1 1 1 35 - Проведенный эксперимент выявил высокую специфичность системы Классической ПЦР к Erwinia amylovora. При тестировании штаммов данного вида специфичная реакция наблюдалась во всех случаях со 126 штаммами (приложение 1). Высокая специфичность ПЦР системы также была отмечена как по отношению к нецелевым видам, так и по отношению к другим видам рода Erwinia, поражающим растения сем. Розовые (Rosáceae) в азиатских странах (Erwinia pyrifoliae, Kim et al., 2001), Erwinia uzenensis (Matsuura et. al., 2012) и вызывающим некротизацию цветков в некоторых странах Европы 17 (Erwinia pyriflorinigrans, Lopez et al., 2011), а также видам, не являющимся фитопатогенами (Erwinia billingiae, Erwinia tasmaniensis). В эксперименте не было зарегистрировано ни одного случая ложноположительной либо ложноотрицательной реакции. Подтверждение специфичности последовательностей праймеров ‘in silico’ проводили путем сравнения последовательностей с геномными библиотеками. Сравнительный анализ последовательностей праймеров, разработанных на основе участка плазмиды pEA29 осуществляли с помощью базы данных Генбанка – пакета NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). На рисунках 2 и 3, приведены результаты сходства последовательностей прямого, обратного праймеров с полными и частичными геномами организмов, депонированных в данный ресурс. Во всех приведенных на рисунках результатах 100% покрытия и идентичности последовательностей праймеров было получено с более чем 30 геномами штаммов вида Erwinia amylovora (включая референтный штамм CFBP 1430), комплементарность праймеров к участкам генома каких-либо нецелевых организмов не выявлена. 18 Рис. 2. Результат сравнения прямого праймера для классической ПЦР (в соответствии с Stöger et al., 2006) с базой данных ГенБанка (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) Рис. 3. Результат сравнения обратного праймера для классической ПЦР (в соответствии с Stöger et al., 2006) с базой данных ГенБанка (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 20 2.5. Селективность При изучении селективности ДНК растительных экстрактов различных растений-хозяев возбудителя была выделена при помощи коммерческого набора «Проба-ГС» ООО «АгроДиагностика», метода, выбранного в результате определения чувствительности диагностической системы. Полученные результаты изучения селективности диагностической системы представлены в таблице 5. Таблица 5 Результаты определения селективности метода классического ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006) Экстракт вегетативных частей Результатсц Результатвк Результат Результатсц Результатвк Результат Результатсц Результатвк Результат Концентрация возбудителя, КОЕ/мл 103 102 Серия 104 Груши 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + – – – + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + – – – + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + – – – + + + + + + + + + + + + – – – – – + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + – – – + + + + + + + + + + + + – – – – – + + + Яблони Боярышника Кизильника Рябины Айвы Аронии черноплодной Малины + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Роз Спиреи Черемухи Ирги Лапчатки Пузыреплодника Земляники Сливы Вишни Черешни Квыделения Ctспец CtВК Результат Кчистая зона Ctспец CtВК Результат + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + – – – + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + – – – + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + – – – – – – – + + + – – – + + + + + + + – + + – – + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + – – – – – – – + + + – – – + + + + + + + – + + – – – + – – + – Как видно из проведенных опытов, состав суспензии в некоторых случаях влияет на прохождение реакции амплификации. Влияние растительного материала на результаты анализа образцов отмечено при тестировании экстрактов вегетативных частей груши, ирги. При концентрации возбудителя 103 КОЕ/мл ложноотрицательные результаты тестирования данных экстрактов получены в 100% случаев. Полученный результат, возможно, связан с веществами-ингибиторами, содержащимися в 22 растительном соке. При тестировании остальных образцов при данной концентрации ни одного ложноотрицательного случая не зарегистрировано. Слабый, но визуально регистрируемый результат, при концентрации возбудителя 102 КОЕ/мл, был получен практически во всех случаях, за исключением растительных экстрактов груши, черемухи, ирги, пузыреплодника. Положительный результат по внутреннему контролю зарегистрирован во всех без исключения тестовых образцах. 2.6. Повторяемость Согласно Стандарту ЕОКЗР РМ 7/98, для определения повторяемости необходимо проанализировать как минимум 3 серии (повторности) образцов растительных экстрактов с низким уровнем зараженности, если после трех серий не получены стабильные результаты, следует подготовить дополнительные серии и провести их анализ. В наших исследованиях были специально протестированы 6 серий образцов с концентрацией возбудителя 102, 103 (низкий уровень зараженности) и 104 КОЕ/мл (средний уровень зараженности), а также использованы данные, полученные при изучении чувствительности. Результаты определения повторяемости представлены в таблице 6. Таблица 6 Результаты определения повторяемости метода Классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006) Результатсп Результат + + + + + + + + + + + + + + + + + + К- (выделения ДНК) Ctспец Результат РезультатВК 1 2 3 Результатсп Результат Определения чувствительности п. 2.3 РезультатВК Результаты Результатсп 102 РезультатВК 103 Серия 104 + + + + + – – + + – 23 К- (Чистая зона) CtВК Результат Ctспец CtВК Результат 1 2 3 4 5 6 Определения повторяемости К- (Чистая зона) К- (Зона внесения ДНК) + – – + – + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + – – – – – – + + + + + + – – – – – – – + – – + – Ctспец CtВК Результат Ctспец CtВК Результат Итого + + + + + + 9 из 9 100% 9 из 9 100% 2 из 9 22,2 Повторяемость метода классического ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006) со средним и низким уровнем зараженности (104 и 103) составила 100%, с уровнем зараженности возбудителем в концентрации 102 КОЕ/мл повторяемость составила 22,2%. 2.7. Воспроизводимость Согласно Стандарту ЕОКЗР РМ 7/98, эксперимент по оценке воспроизводимости проводится по такой же методике, что и определение повторяемости, но другими операторами, в другие сроки и по возможности на другом оборудовании. В нашем эксперименте были специально протестированы 6 серий образцов с концентрацией возбудителя 102, 103 (низкий уровень зараженности) и 104 КОЕ/мл (средний уровень зараженности). Постановку классической ПЦР проводили 3 специалиста на оборудовании, указанном в п. 1.5, полученные результаты приведены в таблице 7. 24 Таблица 7 Результаты определения воспроизводимости метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006) К- (Чистая зона) К- (Зона внесения ДНК) 12 ноября, термоциклер Veriti (Applied Biosystems, США), специалист Писарева И.Н. К- (Чистая зона) К- (Зона внесения ДНК) 13 ноября, термоциклер Mastercycler personal (Eppendorf, Германия), специалист Баландина М.Б. К- (Чистая зона) К- (Зона внесения ДНК) Итого Результат ВК Результат СП Результат Результат ВК Результат СП Результат 1 2 3 4 5 6 Результат ВК Результат СП Результат Результат ВК Результат СП Результат 1 2 3 4 5 6 Результат РезультатВК РезультатСП Результат РезультатВК РезультатСП Результат 1 2 3 4 5 6 102 РезультатСП 14 ноября, термоциклер C1000 Touch Thermal Cycler (BioRad, США), специалист Кузнецова А.А. 103 РезультатВК Дата проведения, название прибора 104 Серия Серия/Разведение (кое/мл) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + – – + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + – – – – – – + + + + + + + + + + + + + – – + – – + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + – – + – – + + + + + + + + + + + + + + + + + + Результат ВК Результат СП Результат Результат ВК Результат СП Результат + + + + + + + + + + + + – – + + – – – – – – – – + – – + – – 18 из 18 100% 18 из 18 100% 9 из 18 50% 25 Воспроизводимость результатов теста оказалась абсолютной (100%) для образцов с зараженностью 103 и 104 КОЕ/мл и низкой (50%) для образцов с зараженностью 102 КОЕ/мл. Выводы 1. Аналитическая чувствительность метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006) составила не менее 102-103 КОЕ/мл. 2. Установлена высокая специфичность метода классической ПЦР к виду Erwinia amylovora. 3. Влияние природного субстрата отмечено при тестировании растительного экстракта груши, ирги. Предел детекции возбудителя в данных растительных экстрактах составляет 104 КОЕ/мл. При тестировании остальных растительных экстрактов, с концентрацией возбудителя 103 КОЕ/мл влияние природного субстрата на эффективность выявления не отмечено. Слабый, но визуально регистрируемый результат при концентрации возбудителя 102 КОЕ/мл был получен практически во всех случаях, за исключением растительных экстрактов груши, черемухи, ирги, пузыреплодника. 4. Проведенные испытания свидетельствуют о высокой повторяемости и воспроизводимости результатов при использовании данного метода. 26 Заключение Проведена валидация метода классической ПЦР с диагностической системой для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006), согласно Стандарту ЕОКЗР PM 7/98 (2) (OEPP/EPPO Bulletin 44 (2)). чувствительностью Метод и характеризуется специфичностью, высокой обладает аналитической селективностью по отношению к растительным экстрактам груши и ирги, обеспечивает высокий уровень повторяемости и воспроизводимости результатов и может быть рекомендован для проведения лабораторной экспертизы по выявлению и идентификации этого карантинного организма. 27 Список литературы 1. Европейская ассоциация по аккредитации/EA (2008) EA-2/15 «Требования для гибкой аккредитации», http://www.eurolab.org/docs/EA/EA2_15.pdf. 2. Мазурин Е.С. Контроль достоверности результатов фитосанитарной экспертизы при использовании молекулярных методов диагностики / Мазурин Е.С., Копина М.Б., Шероколава Н.А. // Вестник РУДН, серия Агрономия и животноводство. – 2012. – №3. – С. 31-38. 3. Стандарт ЕОКЗР PM 7/98 (2) «Специфические требования к лабораториям, ведущим подготовку к аккредитации деятельности в сфере диагностики вредных организмов растений». OEPP/EPPO Bulletin. – 2014. – V 44 (2). – P. 117-147. 4. Стандарт ISO/IEC 17025 «Общие требования к компетенции исследовательских и калибровочных лабораторий». – 2006. 5. СТО ВНИИКР 4.001-2010 Возбудитель ожога плодовых деревьев Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. Методы выявления и идентификации. – 2010. 6. Bereswill S. Sensitive and species-specific detection of Erwinia amylovora by polymerase chain reaction analysis / Bereswill S., Pahl A., Bellemann P., Zeller W. & Geider K. // Applied and Environmental Microbiology. – 1992. – V. 58. – P. 3522-3526. 7. Gottsberger R.A. Development and evaluation of a real-time PCR assay targeting chromosomal DNA of Erwinia amylovora / Gottsberger R.A. // Letters in Applied Microbiology. – 2010. – V. 51. – P. 285-292. 8. Kim W.S. Molecular detection and differentiation of Erwinia pyrifoliae and host range analysis of the Asian pear pathogen / Kim W.S., Jock S. // The American Phytopathological Society. – 2001. – P. 1183-1188. 9. Llop P. Development of a highly sensitive nested-PCR procedure using a single closed tube for detection of Erwinia amylovora in asymptomatic plant 28 material / Llop P., Bonaterra A., Penalver J. & Lopez M.M. // Applied and Environmental Microbiology. – 2000. – V 66, – P. 2071-2078. 10. Lopez M.M. Erwinia piriflorinigrans sp. nov., a novel pathogen that causes necrosis of pear blossoms / Lopez M.M., Roselló M., Llop P., Ferrer S., Christen R., Gardan L. // International journal syst. Evol. Microbiol. – 2011. – V. 61 (Pt 3). – P. 561-567. 11. Matsuura T. Erwinia uzenensis sp. nov., a novel pathogen that affects European pear trees (Pyrus communis L.) / Matsuura T., Mizuno A., Tsukamoto T., Shimizu Y., Saito N., Sato S., Kikuchi S., Uzuki T., Azegami K., Sawada H. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. – 2012. – V. 62. – P. 1799-1803. 12. Obradovic D. Detection of Erwinia amylovora by novel chromosomal polymerase chain reaction primers / Obradovic D., Balaz J. & Kevresan S. // Mikrobiologiia. – 2007. – V. 76. – P. 844-852. 13. Petter F. Survey on the use of tests mentioned in EPPO Diagnostic protocols / Petter F. & Suffert M. // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. – 2010. – V. 40. – P. 5-22. 14. Pirc M. Improved fire blight diagnostics using quantitative real-time PCR detection of Erwinia amylovora chromosomal DNA / Pirc M., Ravnikar M., Tomlinson J. & Dreo T. // Plant Pathology. – 2009. – V. 58. – P. 872-881. 15. PM 7/20 (2) Erwinia amylovora. OEPP/EPPO Bulletin. – 2013. – V. 43 (1). – P. 21-45. 16. Stoger A. A rapid and sensitive method for direct detection of Erwinia amylovora in symptomatic and asymptomatic plant tissues by polymerase chain reaction / Stoger A., Schaffer J. & Ruppitsch W. // Journal of Phytopathology. – 2006. – V. 154. – P. 469-473. 17. Taylor R.K. Detection of Erwinia amylovora in plant material using novel polymerase chain reaction (PCR) primers / Taylor R.K., Guilford P., Clark R.G., Hal C.N. & Forster R.L.S. // New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. – 2001. – V. 29. – P. 35-43. 29 Приложение 1 Информация о штаммах, использованных для определения аналитической специфичности № п/п Штамм, № Вид бактерии 1 0001 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 2 0002 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 3 0003 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 4 0004 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 5 0005 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 6 0006 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 7 0007 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 8 0008 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 9 0009 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 10 0010 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 11 0011 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Арабская Республика Египет, 662-и, 5п – 12 0012 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Арабская Республика Египет, 649-и – 13 0013 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Арабская Республика Египет – 14 0014 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Арабская Республика Египет, 1418/11-и, Rф661 – Происхождение Арабская Республика Египет, 542/1-и, R489 Арабская Республика Египет, 542/1-и, R490 Арабская Республика Египет, 638-и, 1п Арабская Республика Египет, 590-и, MR14 Арабская Республика Египет, 579-и, MR18 Арабская Республика Египет, 577-и, MR19 Арабская Республика Египет, 588-и, MR20 Арабская Республика Египет, 662-и, 3п Арабская Республика Египет, 662-и, 4п Арабская Республика Египет, 662-и, 5п Результат – – – – – – – – – – 30 Арабская Республика Египет, 940-и, R656 – 15 0015 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 16 0016 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Арабская Республика Египет, 943-и, R657 – 17 0017 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Арабская Республика Египет, 938-и, R653 – 18 0018 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Арабская Республика Египет, 949-и, R663 – 19 0019 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Арабская Республика Египет, R652 – 20 0020 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Арабская Республика Египет, 854-и, R622 – 21 0021 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Республика Индия, 5084 С-Петербургская МВЛ – 22 0022 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Республика Индия, 5609 С-Петербургская МВЛ – 23 0023 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Республика Индия, 6986 С-Петербургская МВЛ – 24 0024 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Республика Индия, 7088 С-Петербургская МВЛ – 25 0025 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Арабская Республика Египет, 1045-и, МR622 – 26 0026 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Арабская Республика Египет, МR42 – 27 0027 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Арабская Республика Египет, 1655/11-и, Rф866 – 28 0029 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Арабская Республика Египет, 11-и, Rф – 29 0030 Ralstonia solanacearum, филотип 1 КНР, 57п, Иркутский филиал – 31 КНР, 60п, Иркутский филиал – 30 0031 Ralstonia solanacearum, филотип 1 31 0032 Ralstonia solanacearum, филотип 1 КНР, 61п, Иркутский филиал – 32 0033 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Московская область, Озерский р-н, ЗАО «Озеры» – 33 0034 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Московская область, Озерский р-н, ЗАО «Озеры» – 34 0035 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Московская область, Озерский р-н, ЗАО «Озеры» – 35 0036 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Московская область, Озерский р-н, ЗАО «Озеры» – 36 0037 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 Московская область, Озерский р-н, ЗАО «Озеры» – 37 0038 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 38 0039 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 39 0040 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 40 0041 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 41 0042 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 42 43 0043 Ochrobactrum sp. 0044 Erwinia billingiae (культура изначально определена как Erwinia amylovora) Московская область, Озерский р-н, ЗАО «Озеры» Нами получен из NCPPB, FERA (Йорк, Великобритания). Перу, 1970 Нами получен из NCPPB, FERA (Йорк, Великобритания). Австралия, 1970 Hungary, Domaszek, isolated 11/1999, Nemeth J. Hungary, Domaszek, 11/1999, Kovacs N.A. Самарская обл., Волжский р-н, трасса Самара – Волгоград, поворот на Новокуйбышевск, заброшенные дачи у дороги. МЕ 958-2, 811-о Воронежская обл., г. Воронеж, ЗАО «Зареченский», кв. 9, 1985, 10 га – – – – – – – 32 49п (№ 87) 44 0045 45 0046 Curobacterium flaccumfaciens pv. flacumfaciens Pseudomonas congelans (штамм изначально определен как Pseudomonas syringae pv. syringae) Тамбовская обл., г. Уварово – AOBC PPSCD, Печ, Венгрия, Kovacs N.A., Hungary, 1976 – Калининградская обл., г. Светлый (территория теплопункта, рядом с судоходным каналом) 213-о Саратовская обл., г. Хвалынск, КПХ «Садов», МЕ 972, 812-о – 46 0047 Enterbacter amnigenus 47 0048 Ochrobactrum anthropi 48 0049 Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Московская область, Дмитровский р-н – 49 0050 Xilophilus ampelinus Нами получен из LSV Франция. France 2004 – 50 0051 Erwinia amylovora 51 0052 Erwinia amylovora 52 0053 Erwinia amylovora 53 0054 Erwinia amylovora 54 0055 Erwinia amylovora 55 0056 Erwinia amylovora Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИС им. Мичурина, опытный интенсивный сад, 5,5 га Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИС им. Мичурина, опытный интенсивный сад, 5,5 га Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИС им. Мичурина, опытный интенсивный сад, 5,5 га Тамбовская обл., г. Мичуринск, территория элеватора рядом с карантинным пунктом Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИГ и СПР им. Мичурина, коллекционнопроизводственный сад, 13 га Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИГ и СПР им. Мичурина, коллекционнопроизводственный сад, 10 – + + + + + + 33 56 0057 Erwinia amylovora 57 0058 Erwinia amylovora 58 0059 Erwinia amylovora 59 0060 Erwinia amylovora 60 0061 Erwinia amylovora 61 0062 Erwinia amylovora 62 0063 Erwinia amylovora 63 0064 Erwinia amylovora 64 0065 Erwinia amylovora 65 0066 Erwinia amylovora 66 0067 Erwinia amylovora 67 0068 Erwinia amylovora 68 0069 Erwinia amylovora га Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИГ и СПР им. Мичурина, коллекционнопроизводственный сад, 10 га Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИС им. Мичурина, поросль по краю бывшего опытного интенсивного сада Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИС им. Мичурина, поросль по краю бывшего опытного интенсивного сада Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИГ и СПР им. Мичурина, молодой сад, 7 га Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИГ и СПР им. Мичурина, коллекционный сад, 6 га Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИГ и СПР им. Мичурина, коллекционный сад, ряд 5, дерево 12, 6 га Тамбовская обл., г. Мичуринск Тамбовская обл., г. Мичуринск Тамбовская обл., г. Мичуринск Тамбовская обл., г. Мичуринск Воронежская обл., Острогожский р-н, лесополоса за территорией ООО «Острогожсксадопитомник» Воронежская обл., Аннинский р-н, ОАО «Новонадеждинское» кв. 1, 1999 г., 4 га Воронежская обл., Новоусманский р-н, ТНВ «Маликов и К», кв. 79, 1973 г. + + + + + + + + + + + + + 34 69 0070 Erwinia amylovora Воронежская обл., г. Воронеж, ул. Шишкова, д. 49 70 0071 Erwinia amylovora Воронежская обл., г. Воронеж, ул. Шишкова, напротив д. 49 + + – 71 0072 Erwinia amylovora Воронежская обл., г. Воронеж, ул. Шишкова, напротив д. 28а 72 0073 Artrobacter cаstelli Штамм изначально определен как вид Cmm - 73 0074 Erwinia amylovora 74 0075 Erwinia amylovora 75 0076 Erwinia amylovora 76 0077 Erwinia amylovora 77 0078 Erwinia tasmaniensis Воронежская обл., г. Воронеж, ул. Шишкова, напротив д. 28 Воронежская обл., Семилукский р-н, СНТ «Росинка», участок № 216, 0,15 га, 1990 год посадки Воронежская обл., г. Воронеж, ул. Шишкова, напротив д. 47, 0,5 га Саратовская обл., Хвалынский р-н, г. Хвалынск, дорога на Черемшаны, сад яблони Саратовская обл., Хвалынский р-н, г. Хвалынск, гора Богданиха Самарская обл., Сергиевский р-н Самарская обл., Приволжский р-н, ООО «Сад», кв. 7, 2012 г. + + + + + – 78 0079 Erwinia amylovora 79 0080 Erwinia amylovora 80 0081 Erwinia amylovora 81 0082 Erwinia amylovora Самарская обл. Приволжский р-н, ООО «Сад», кв. 7, 2012 г. + + + 82 0083 Erwinia amylovora Самарская обл. Приволжский р-н, ООО «Сад», кв. 31, 2012 г. 83 0084 Erwinia amylovora Самарская обл. Приволжский р-н, ООО «Сад», кв. 13, 2012 г. + + + 35 84 0085 Erwinia amylovora Самарская обл. Приволжский р-н, ООО «Сад», кв. 15, 2012 г. 85 0086 Erwinia amylovora Самарская обл. Приволжский р-н, ООО «Сад», кв. 15, 2012 г. Самарская обл. Приволжский р-н, ООО «Сад», кв. 15, 2012 г. Самарская обл., Сызранский р-н, ООО «Садовод», кв. 94, 1982 г., 10,7 га Самарская обл., Сызранский р-н, ООО «Садовод», кв. 97, 1987 г, 10,7 га Самарская обл., Сызранский р-н, ООО «Садовод», кв. 95, 1981 г, 10,7 га Самарская обл., Сызранский р-н + + 86 0087 Erwinia amylovora 87 0088 Erwinia amylovora 88 0089 Erwinia amylovora 89 0090 Erwinia amylovora 90 0091 Erwinia amylovora 91 0092 Acidovorax США – 92 0093 Acidovorax США – 93 0094 Acidovorax США – 94 0095 Erwinia amylovora Липецкая обл., СНТ «Заря 2», массив 1, линия 6 + 95 0096 Erwinia amylovora 96 0097 Erwinia amylovora 97 0098 Erwinia amylovora 98 0099 Erwinia amylovora 99 0100 Erwinia amylovora Липецкая обл., Тербунский р-н, ООО «Сельхозинвест» кв. 1, 10,5 га Липецкая обл., Тербунский р-н, ООО «Сельхозинвест» кв. 1, 10,5 га Липецкая обл., Тербунский р-н, ООО «Сельхозинвест» кв. 1, 10,5 га Липецкая обл., Тербунский р-н, ООО «Сельхозинвест» кв. 9, 10,5 га Липецкая обл., Тербунский р-н, ООО «Сельхозинвест» кв. 1, 10,5 га + + + + + + + + + + 36 Липецкая обл., Тербунский р-н, ООО «Сельхозинвест» кв. 1, 10,5 га Липецкая обл., Тербунский р-н, ООО «Сельхозинвест» кв. 1, 10,5 га Воронежская обл., Острогожский р-н, лесополоса за территорией ООО «Острогожсксадопитомник» Арабская Республика Египет, R 434/305-и 100 0101 Erwinia amylovora 101 0102 Erwinia amylovora 102 0103 Erwinia amylovora 103 0104 Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2 104 0105 Erwinia amilovora Калининградская обл. + 105 0106 Erwinia amilovora Калининградская обл. + 106 0107 Erwinia amilovora Калининградская обл. + + – 107 0108 Erwinia amylovora Калининградская обл., Багратионовский р-н, вдоль ж/д Мамоново – Польша 108 0109 Erwinia piriflorinigrans Калининградская обл., г. Балтийск, Балтийская коса Калининградская обл., Нестеровский р-н, пос. Пригородное, сад возле мехдвора (зернотока) + + + – 109 0110 Erwinia amylovora + 110 0111 Erwinia amylovora 111 0112 Erwinia amylovora Калининградская обл. + 112 0113 Erwinia piriflorinigrans - – 113 0114 Erwinia amylovora Калининградская обл. + 114 0115 Erwinia amylovora Калининградская обл. + 115 0116 Erwinia amylovora Калининградская обл. + 116 0117 Erwinia amylovora Калининградская обл. + 117 0118 Erwinia amylovora Калининградская обл. + + 37 0119 Erwinia amylovora Калининградская обл. + 119 0120 Pantoea stewartii subsp. stewartii Нами получен из AOBC PPSCD, Печ, Венгрия – 120 0121 Erwinia amylovora Ставропольский край + 121 0122 Erwinia amylovora Ставропольский край + 122 0123 Erwinia amylovora Ставропольский край + 123 0124 Xilophilus ampelinus Итальянская Республика, сорт Шардоне – 124 0125 Xilophilus ampelinus Итальянская Республика, сорт Каберне Совиньон – 125 0126 Erwinia amylovora Ставропольский край + 126 0127 Erwinia amylovora Ставропольский край + 127 0128 Erwinia amylovora Ставропольский край + 128 0129 Erwinia amylovora Ставропольский край 129 0130 Erwinia amylovora Ставропольский край + 130 0131 Ralstonia solanacearum Арабская Республика Египет, R786/13 + 131 0132 Ralstonia solanacearum Арабская Республика Египет, R786/13 – 132 0133 Ralstonia solanacearum Арабская Республика Египет, R786/13 – 133 0134 Ralstonia solanacearum Арабская Республика Египет, R786/13 – 134 0135 Ralstonia solanacearum Арабская Республика Египет, R786/13 – 135 0136 Ralstonia solanacearum КНР – 136 0137 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Московская область – 137 0138 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Московская область, R77/80-о – 138 0139 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus РФ, Московская обл., Раменский р-н, д. Заворово, R40, Н.В. – 139 0140 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Клубни картофеля с. Романо – 118 38 140 0141 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Типовой штамм – 141 0142 Pectobacterium atrosepticum Великобритания, типовой штамм – 142 0143 Pectobacterium atrosepticum - – 143 0144 Diсkeya sp. - – 144 0145 Diсkeya sp. - – 145 0146 Diсkeya sp. - – 146 0147 Xanthomonas fragariae NCPPB 1469 FERA (Йорк, Великобритания) – 147 0148 Xanthomonas campestris pv. raphani NCPPB 1946 FERA (Йорк, Великобритания) – 148 0149 Xanthomonas arboricola pv. pruni AOBC PPSCD, г. Печ, Венгрия – Белгородская обл., Прохоровский р-н, с. Редьковка + 149 0150 Erwinia amylovora 150 0151 Erwinia amylovora 151 0152 Erwinia amylovora 152 0153 Erwinia amylovora 153 0154 Erwinia amylovora 154 0155 Erwinia amylovora 155 0156 Erwinia amylovora 156 0157 Erwinia amylovora 157 0158 Erwinia amylovora Пензенская обл., Тамаринский р-н. Липецкая обл., ЛевТолстовский р-н, с-з им. Льва Толстого, ул. Черемушки, д. 16, кв. 1 Липецкая обл., ЛевТолстовский р-н, с-з им. Льва Толстого, ул. Черемушки, д. 16, кв. 1 Липецкая обл., ЛевТолстовский р-н, с-з им. Льва Толстого, ул. Черемушки, д. 16, кв. 1 Липецкая обл., ЛевТолстовский р-н., с-з им. Льва Толстого, ул. Черемушки, д. 16, кв. 1 Кабардино-Балкария, Баксанский р-н Кабардино-Балкария, с. Кенже, ОАО «Кенже» Кабардино-Балкария, Чегемский р-н, с-з Лечинкай, старый сад груши с посадкой 8 га + + + + + + + + 39 158 0159 Erwinia amylovora Кабардино-Балкария + 159 0160 Erwinia amylovora Кабардино-Балкария + 160 0161 Erwinia amylovora 161 0162 Erwinia amylovora 162 0163 Erwinia amylovora 163 0164 Erwinia amylovora 164 0165 Erwinia amylovora 165 0166 Erwinia amylovora 166 0167 Erwinia amylovora 167 0168 Erwinia amylovora 168 0169 Erwinia amylovora 169 0170 Erwinia amylovora 170 0171 Ralstonia solanacearum Республика Молдова Страшенский р-н, промышленный сад, 105,5 га Республика Молдова Страшенский р-н, промышленный сад, 105,5 га Карачаево-Черкесская Республика, Малокарачаевский р-н, п. Красный, старый сад груши конного завода Волгоградская обл., г. Краснослободск, ГНУ ВОС ВНИИР им. Вавилова, кв. 7, ряд 13 Волгоградская обл., г. Волгоград, дендрарий ВНИИАЛМИ Волгоградская обл., г. Краснослободск, ГНУ ВОС ВНИИР им. Вавилова, кв. 7, ряд 12 Волгоградская обл., г. Волгоград, ул. Чимбарова, 53 Волгоградская обл., г. Волгоград, дендрарий ВНИИАЛМИ Волгоградская обл., г. Краснослободск, ГНУ ВОС ВНИИР им. Вавилова, сад айвы Волгоградская обл., г. Краснослободск, ГНУ ВОС ВНИИР им. Вавилова, сад айвы Арабская Республика Египет, Карельский филиал 171 0172 Erwinia amylovora IVIA, Валенсия, Испания, нами получен из Bielefeld, France 172 0173 Erwinia amylovora Республика Польша, Новый Двор, Опытное цветоводческое + + + + + + + + + + – + + 40 предприятие Институт садоводства и цветоводства Арабская Республика Египет Республика Польша, г. Пасечно, питомник декоративных растений «Эмиль Хома» Республика Польша, г. Пасечно «Кордус» Республика Польша, г. Пасечно «Кордус» Республика Польша, г. Пасечно «Кордус» Республика Польша, Wojewodztwo Mazowieckie, питомник «Грабчевски» Республика Казахстан, Алматинская обл., Енбекшиказахский р-н, Байтерекский с/о, крестьянское х-во «Жарык», промышленный сад, 15 га – 173 0174 Ralstonia solanacearum 174 0175 Erwinia amylovora 175 0176 Erwinia amylovora 176 0177 Erwinia amylovora 177 0178 Erwinia amylovora 178 0179 Erwinia amylovora 179 0180 Erwinia amylovora 180 0181 Rahnella sp. Нидерланды – 181 0182 Erwinia amylovora Республика Киргизия + 182 0183 Erwinia amylovora Республика Киргизия + 183 0184 Erwinia amylovora Республика Киргизия + 184 0185 Erwinia amylovora Республика Киргизия + 185 0186 Erwinia amylovora Республика Киргизия + 186 0187 Erwinia amylovora Республика Киргизия + 187 0188 Erwinia amylovora Республика Киргизия + 188 0189 Erwinia amylovora Республика Киргизия + 189 0190 Erwinia amylovora Республика Киргизия + Erwinia amylovora Липецкая обл., ЛевТолстовский р-н, с/х им. Л. Толстого, ул. Механизаторов, д. 13, кв. 2, Волков А.И. + 190 0191 + + + + + + 41 191 0192 Erwinia amylovora Республика Киргизия + + 192 0193 Erwinia amylovora Липецкая обл., ЛевТолстовский р-н, с/х им. Л. Толстого, ул. Механизаторов, д. 13, кв. 2, Волков А.И. 193 0194 Erwinia amylovora Республика Казахстан, Алма-Атинская область + 194 0195 Erwinia amylovora Республика Казахстан, Алма-Атинская область + 195 0196 Erwinia amylovora Республика Казахстан, Алма-Атинская область + 196 0197 Erwinia amylovora Республика Казахстан, Алма-Атинская обл. + 197 0198 Erwinia amylovora Республика Казахстан, Алма-Атинская обл. + 198 0199 Erwinia amylovora Республика Казахстан, Алма-Атинская обл. + 199 0200 Erwinia amylovora Республика Казахстан, Алма-Атинская обл. + 200 0201 Краснодарский край – 201 0202 Краснодарский край – 202 0203 Краснодарский край – 203 0204 204 0205 205 0206 206 0207 207 0208 Erwinia amylovora 208 0209 Ralstonia solanacearum 209 0210 Erwinia amylovora 210 0211 Ralstonia solanacearum Pantoea stewartii subsp. stewartii Pantoea stewartii subsp. stewartii Pantoea stewartii subsp. stewartii Pantoea stewartii subsp. stewartii Pantoea stewartii subsp. stewartii Pantoea stewartii subsp. stewartii Pantoea stewartii subsp. stewartii Нами получен из Германии Нами получен из Германии ЮАР, ФГБУ «Краснодарская МВЛ» ЮАР, ФГБУ «Краснодарская МВЛ» г. Пенза, ул. Кирова, 25Д, территория Троицкого женского монастыря Народная Республика Бангладеш, ФГБУ «Ленинградская МВЛ» г. Пенза, ул. Кирова, 25Д, территория Троицкого женского монастыря Арабская Республика Египет, ФГБУ «Ленинградская МВЛ» – – _ _ + _ + _ 42 211 0212 Erwinia amylovora г. Пенза, ул. Кирова, 25Д, территория Троицкого женского монастыря 212 0213 Erwinia amylovora Пензенская обл., р.п. Тамала, ул. Пацаева, д. 23 + 213 0214 Erwinia amylovora Пензенская обл., р.п. Тамала, ул. 60 лет Октября + 214 0215 Erwinia amylovora 215 0216 Erwinia amylovora 216 0217 ДНК Erwinia pyrifoliae 217 0218 ДНК Erwinia uzenensis Пензенская обл., р.п. Тамала, пер. Березовый, д. 2 г. Пенза, ул. Кирова, 25Д, территория Троицкого женского монастыря Проект Phytfire (EUPHRESCO II) Проект Phytfire (EUPHRESCO II) + + + _ _ 43 Приложение 2 Тесты, не требующие дополнительной оценки повторяемости и воспроизводимости, касающиеся возбудителя бактериального ожога плодовых культур Erwinia amylovora (выдержка из Стандарта ЕОКЗР PM 7/20 (2)) Бессимптомные образцы Прямое выделение возбудителя (на среды CCT, King's B и Levan) Обогащение DASI ИФА Обогащение с последующей классической ПЦР Обогащение с последующей классической ПЦР в соответствии с Bereswill et al., 1992 Обогащение с последующим ПЦР-РВ в соответствии с Gottsberger, 2010 Обогащение с последующим ПЦР-РВ в соответствии с Pirc et al., 2009 Обогащение с последующим выделение возбудителя (на среды King's и CCT) Выделение возбудителя с последующей проверкой реакции агглютинации Выделение возбудителя с последующим секвенированием ДНК Выделение возбудителя с последующей постановкой реакцией сверхчувствительности Выделение возбудителя с последующей постановкой реакцией иммунофлуоресценции Выделение возбудителя с последующей постановкой теста на патогенность Образцы с симптомами Реакция агглютинации Биохимические тесты Прямое выделение возбудителя (на среды CCT, King's B и Levan) Методы секвенирования ДНК Обогащение DASI ИФА Обогащение с последующим выделение возбудителя (на среды King's и CCT) Профили жирных кислот Сверхчувствительная реакция Реакция иммунофлуоресценции Иммунохромотографический анализ Nested-ПЦР в соответствии с Llop et al., 2000 Тест на патогенность ПЦР в соответствии с Bereswill et al., 1992 ПЦР в соответствии с оптимизированным протоколом Obradovic et al., 2007 ПЦР в соответствии с Stoger et al., 2006 ПЦР в соответствии с Taylor et al., 2001 ПЦР-РВ в соответствии с Gottsberger, 2010 ПЦР-РВ в соответствии с Pirc et al., 2009 44
