ME E-0900 Инсулин ИФА Набор реагентов для ИФА для количественного определения Инсулина в сыворотке и плазме. Только для in vitro диагностики. Инсулин – это главный гормон, отвечающий за контроль метаболизма глюкозы. Он синтезируется в β-клетках островков Лангерганса в виде прекурсора, проинсулина, который затем преобразуется в С-пептид и Инсулин. С-пептид и Инсулин затем секретируются в эквимолярных количествах в систему циркуляции. Зрелая молекула инсулина состоит из двух полипептидных цепей, А цепь и В цепь (21 и 30 аминокислот соответственно). Цепи связаны между собой дисульфидными мостиками. Существуют также дисульфидные мостики внутри А цепи. Секреция инсулина зависит от концентрации глюкозы в крови, и этот гормон имеет ряд важных метаболических свойств. Основной функцией инсулина является контроль поглощения и утилизации глюкозы в периферических тканях с помощью транспортера глюкозы. Эта и другая гипогликемическая активность, такая как ингибирование печеночного глюконеогенеза и гликогенолиза, нейтрализуют действие гипергликемических гормонов, таких как глюкагон, адреналин, гормон роста и кортизол. Концентрация инсулина значительно снижается при инсулинозависимом сахарном диабете (ИЗСД) и некоторых других условиях, таких как гипофизарный нанизм. Уровень инсулина повышается при инсулиннезависимом сахарном диабете (ИНСД), ожирении, инсулиномы и некоторые эндокринные дисфункции, такие как синдром Кушинга и акромегалия. Принцип теста: Набор Инсулин ИФА основан на методе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на принципе сэндвича. Образцы пациента, стандарты и контроли подкислены и нейтрализуются непосредственно перед анализом. Лунки покрыты моноклональными антителами к антигенам, расположенным на молекуле Инсулина. Аликвоты образцов пациента, содержащие эндогенный инсулин, инкубируются в лунках с ферментным конъюгатом (анти-Инсулин антитела – Биотин). После инкубации несвязавшийся конъюгат вымывается. Во время второго этапа инкубации ферментный Стрептовидин-пероксидазный комплекс связывается в биотин-анти-Инсулин антителами. Лунки промываются и инкубируются с ферментным комплексом (Стрептавидин-HRP-комплекс). Количество связавшегося HRP комплекса пропорционально концентрации Инсулина в образце. После добавления раствора субстрата интенсивность цвета раствора пропорциональна концентрации Инсулина в образце. Состав набора: 96 Микротитровальный планшет 12х8 (96 лунок), разборный; лунки покрыты моноклональными анти-Инсулин антителами. Нулевой стандарт, 1 флакон, 3 мл, готов к использованию 0 мкМЕ/мл Стандарты (1-5): пять флаконов, по 1 мл, готовы к использованию. концентрации: 6.25 - 12.5 – 25 - 50 и 100 мкМЕ/мл Стандарты откалиброваны согласно рекомендациям ВОЗ, NIBSC: 66/304. Enzyme Conjugate, Ферментный конъюгат 1 флакон, 5 мл, готов к использованию; мышиные моноклональные антитела конъюгированные с биотином Enzyme Complex Ферментный комплекс 1 флакон, 7 мл, готов к использованию. стрептавидин-HRP комплекс Substrate Solution Раствор субстрата 1 флакон, 14 мл, готов к использованию; тетраметилбензидин (ТМБ). Stop Solution Стоп-раствор 1 флакон, 14 мл, готов к использованию, содержит 0,5 М серной кислоты Избегайте контакта со Стоп-раствором. Это может вызвать раздражение кожи и ожоги. Wash Solution Промывочный раствор 1 флакон, 30 мл (40X концентрированный), см. "Подготовка реагентов". Оборудование и материалы необходимые, но не входящие в комплект - Микропланшетный анализатор (450±10) - Откалиброванные переменные прецизионные микропипетки - Абсорбирующая бумага - Дистиллированная вода Хранение и стабильность набора: При хранении при температуре 2-8 ° С закрытые реагенты сохраняют активность до истечения срока годности. Не используйте реагенты после этой даты. Открытые реагенты должны храниться при температуре 2-8 ° С. Микротитровальный планшет должен храниться при температуре 2-8 ° С в плотно закрытом фольгированном пакете. Подготовка реагентов: Перед использованием все реагенты и необходимое количество стрипов должны быть комнатной температуры. Промывочный раствор: Добавьте к 30 мл концентрата промывочного раствора 1170 мл деионизированной воды, до конечного объёма 1 200 мл. Разведенный промывочный раствор стабилен 2 недели при комнатной температуре. Образцы: Используется сыворотка или плазма (только гепарин- или цитрат-плазма) Не используйте гемолизированные, желтушные и липемические образцы. Хранение: Образцы должны храниться закрытыми при температуре 2-8° С до 5 дней. Возможно более длительное хранение однократно замороженных образцов при – 20 ° С. Размораживание должно проводиться непосредственно перед исследованием. Разведение образцов: Если при анализе установлено, что образец содержит более высокую концентрацию, чем стандарты, то образцы можно разбавить Стандарт 0 и провести повторное исследование, как описано в процедуре анализа. При расчете результата должен учитываться фактор разведения Пример: a) разведение 1:10: 10 мкл Образца + 90 мкл Стандарт 0 (тщательно перемешать) b) разведение 1:100: 10 мкл разведения а) + 90 мкл Стандарт 0 (тщательно перемешать) Процедура анализа: Перед применением все реагенты должны быть комнатной температуры. Стандарты, контроли и образцы должны исследоваться в дублях. Как только процедура анализа была начата, она должна быть завершена без перерыва. 1. Закрепите необходимое количество стрипов на штативе. 2. Добавьте по 25 мкл стандартов, контролей и образцов в соответствующие лунки новыми одноразовыми наконечниками. 3. Добавьте по 25 мкл ферментного конъюгата в каждую лунку. Тщательно перемешайте в течение 10 секунд. Важно добиться полного смешивания на этом этапе. 4. Инкубируйте 30 минут при комнатной температуре в закрытом планшете. 5. Резко вытряхните содержимое лунок. Промойте каждую лунку 3 раза разведенным промывочным раствором (по 400 мкл на лунку). Для удаления остатков жидкости резко переверните планшет и прижмите к абсорбирующей бумаге. Важно: чувствительность и точность данного анализа зависит от правильного выполнения процедуры промывки. 6. Добавьте по 50 мкл Ферментного комплекса в каждую лунку. 7. Инкубируйте 60 минут при комнатной температуре. 8. Резко вытряхните содержимое лунок. Промойте каждую лунку 3 раза разведенным промывочным раствором (по 400 мкл на лунку). Для удаления остатков жидкости резко переверните планшет и прижмите к абсорбирующей бумаге. 9. Добавьте по 50 мкл Субстрата в каждую лунку 10. Инкубируйте 15 минут при комнатной температуре. 11. Для остановки ферментной реакции добавьте по 50 мкл Стоп-раствора в каждую лунку. 12. Измерьте ОП на микропланшетном анализаторе при 450±10 нм в течение 10 минут после добавления стоп-раствора. Расчет результатов: 1. рассчитайте среднюю оптическую плотность каждого стандарта, контроля и неизвестного 2. Нарисуйте калибровочную кривою на логарифмической бумаге со средней оптической плотности на Y-оси и концентрацией калибратора на X-оси. Если для анализа используется программное обеспечение, то рекомендуется кривая на 4-параметра. 3. Рассчитайте значение неизвестных при помощи калибровочной кривой. 4. Если концентрация образца выше стандартов, то образец должен быть разведен. При расчете результата необходимо учитывать фактор разведения. Пример типичной стандартной кривой: (не используйте для расчета) Стандарт Стандарт 0 (0 мкМЕ/мл) Стандарт 1 (6,25 мкМЕ/мл) Стандарт 2 (12,5 мкМЕ/мл) Стандарт 3 (25 мкМЕ/мл) Стандарт 4 (50 мкМЕ/мл) Стандарт 5 (100 мкМЕ/мл) ОП (450 нм) 0.03 0.07 0.14 0.35 0.88 2.05 Ожидаемые нормальные значения: Настоятельно рекомендуется, чтобы каждая лаборатория определяла свои границы нормальных и аномальных значений. 2 – 25 мкМЕ/мл Диапазон: 0 – 100 мкМЕ/мл Чувствительность: 1,76 мкМЕ/мл