Изучение микроклонального размножения растений вида Streptocarpus hybrida
реклама
Департамент образования администрации г. Перми МБОУ «Лицей №1» г. Перми Биология Изучение микроклонального размножения растений вида Streptocarpus hybrida Выполнила: Ступникова Алена Сергеевна, 203γ Научный руководитель: Кандидат биологических наук, Елтышева Ирина Валерьевна Научный консультант: Заведующий отделом Учебного ботанического сада, Черткова Марина Анатольевна Пермь 2015 1 Оглавление Введение Глава 1. Обзор литературы 3 4 §1. Характеристика растений рода Streptocarpus Lindl 4 §2. Сорта растений рода Streptocarpus 4 §3. Способы размножения растений рода Streptocarpus 5 §4. Микроклональное размножение растений рода Streptocarpus 6 §5. Практическое значение метода микроклонального размножения декоративных растений 6 Глава 2. Объекты и методы исследований §1. Сорта, использованные в ходе исследования §2. Описание этапов работы 7 7 7 Глава 3. Результаты исследований 10 §1. Выход стерильной культуры 10 §2. Индукция развития побегов §3. Перевод из культуры in vitro в культуру in vivo 12 13 Выводы 15 Список литературы 16 Приложение 17 2 Введение Стрептокарпус – одно из комнатных растений, некогда забытых, а теперь вновь входящих в моду. Стрептокарпусы замечательны своими цветкамиколокольчиками разнообразных расцветок, а также продолжительным цветением. В последние несколько десятков лет были выведены гибриды с цветками необыкновенной красоты, обладающих разнообразием цветовых оттенков и формы цветка[8]. В связи с нарастающими темпами моды на стрептокарпусы встает вопрос об их быстром размножении. На помощь приходят методы биотехнологии, культуры растительных клеток и тканей. Методы микроклонального размножения растений могут быть использованы в промышленном цветоводстве, сельском хозяйстве, а также для сохранения редких и исчезающих видов растений. Метод позволяет решить ряд технических проблем, таких как массовое размножение оздоровленных растений (чистых линий, избавленных от нежелательных мутаций), получение сортовых линий. Цель работы: изучить особенности микроклонального развития растений рода Streptocarpus Lindl. Задачи: 1. Подобрать оптимальный вариант стерилизации исходного посадочного материала; 2. Изучить особенности микроклонального размножения различных сортов Streptocarpus hybrida; 3. Выработать рекомендации по дальнейшему укоренению в условиях in vivo, и выращиванию микроклонального размноженных растений рода Streptocarpus. 4. Использовать выработанные рекомендации для восстановления коллекции растений рода Streptocarpus в ботаническом саду ПГНИУ г. Пермь. 3 Глава 1. Обзор литературы §1. Характеристика растений рода Streptocarpus Streptocarpus - представитель большого семейства геснериевые, ближайший родственник сенполии. Название рода стрептокарпус (Streptocarpus) происходит от греч. streptos - «скрученный» и karpos - «плод». Двух- или трехстворчатые плоды имеют форму спирали или длинной скрученной коробочки. За эту необычную форму плода растение назвали «стрептокарпус», что означает «скрученная коробочка» или «скрученный плод». На сегодняшний день насчитывается около 130 природных видов стрептокарпусов, произрастающих преимущественно во влажных тропических лесах Азии и Африки. В зависимости от вида растения, его представители бывают как многолетними, так и однолетними, как травянистые растения, так и кустарники. 1. 2. 3. 4. 5. 6. §2. Сорта растений рода Streptocarpus Streptocarpus caulescens Vatke (рис.1, приложение) Растение с прямым высоким (до 60 см) стеблем с супротивными листьями. Цветки светло-синие, наклоненные вниз, напоминают цветки сенполии. Цветение обильное. Streptocarpus dunnii Mast. (рис.2, приложение) Растение с единственным широким листом, который растет на протяжение всей жизни цветка. Цветы светлые, оранжево-красные, производятся на основании листа на стебле длиной около 300 мм. Streptocarpus parviflorus Hook.f. (рис.3, приложение) Миниатюрный стрептокарпус. Розеточная форма. Лист узкий жесткий в среднем 10-12 см в длину и 2,5-3,5 см в ширину. Цветы 1-1.5 см в форме граммофона. Streptocarpus rexii Lindl (рис.4, приложение) Травянистое растение с розеткой продолговатых листьев. Листья с зубчатым краем, опушенные, зеленого цвета. Цветки на высоких цветоносах около 2,5 см в диаметре. Венчик цветка воронковидной формы, пятилепестной, светло-лилового цвета с пурпурными полосками. Streptocarpus saxorum Engl (рис.5, приложение) Растение имеет свисающие суккулентные стебли длиной до 45 см, эллиптические мелкие мясистые листья (длиной от 2,5 до 3 см). Цветки располагаются на длинных (до 7,5 см) цветоносах, выходящих из пазух листьев. Окраска цветков белая со светло-фиолетовыми краями и белым зевом. Streptocarpus wendlandii hort. Dammann (рис.6, приложение) Растение имеет один довольно крупный лист - длиной 35-40 см. Цветки на длинных (до 60 см) цветоносах появляются из пазухи этого листа и собраны в многоцветковые соцветия. На одном растении может быть до 10 цветоносов и более. 4 §3. Способы размножения растений рода Streprocarpus Размножение листом: Срезанный лист разрезают вдоль, удаляют центральную жилку, и срезанной частью вдавливают во влажный грунт, по составу аналогичный тому, который применяется для посева семян. Через некоторое время из каждой боковой жилки разовьется вегетативный клон. Лист отделяют от розетки, лезвием подрезают черешок, подсушивают срез и сажают в небольшой горшок вертикально. Черенок накрывают полиэтиленовым пакетом и ставят в теплое место. Через 1–1,5 месяца появляется всход. Лист лезвием нарезают на полоски длиной около 5 см перпендикулярно средней жилке так, чтобы каждая часть имела отрезок средней жилки (которая выполнит роль черешка) и два крыла. Промежуточные части высаживают основанием черенка в неглубокие канавки, слегка уплотняя землю вокруг. Емкость с посаженными черенками обрабатывают фунгицидом для предупреждения заболеваний и ставят в теплое и влажное место или накрывают пленкой. Следует ежедневно проветривать растения. Через 5–8 недель появляются всходы. Верхний и нижний края листа при размножении не используют. Центральную жилку надрезают в нескольких местах с интервалом 2–3 см надрезами длиной 2 см с нижней стороны листа и этой же стороной укладывают горизонтально на умеренно влажный и рыхлый субстрат. Емкость с листом накрывают стеклом и ставят на светлое, но не солнечное место. С появлением деток начинают приоткрывать стекло, постепенно закаливая растения. Отсаженные достаточно крупные розетки на первое время прикрывают пленкой, затем её снимают. Семенное размножение: Посев семян рода Streprocarpus производится по поверхности почвы, после чего грунт прижимают гладкой деревянной дощечкой. Затем почву нужно увлажнить погружением посевной емкости в воду. Далее посевные емкости накрывают покровным стеклом или слоем полиэтилена и помещают в светлое место. Первые всходы могут появиться через неделю. Streptocarpus – неприхотливое растение, нужно только соблюдать те условия выращивания, в которых он нуждается. Всего их три: Невысокая температура воздуха; Размещение в светлом месте, но не на солнечном свету; Осторожный полив, чтобы вода не попадала в центр розетки. 5 §4. Микроклональное размножение растений рода Streptocarpus Микроклональное размножение растений — один из способов вегетативного размножения в условиях «in vitro». Преимущества микроклонального размножения: получение генетически однородного посадочного материала; сокращение продолжительности селекционного процесса; ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития; возможность проведения работ в течение всего года; возможность автоматизации процесса выращивания; значительно более высокие коэффициенты размножения; миниатюризация процесса, приводящая к экономии площадей, занятых маточными и размножаемыми растениями; размножение и укоренение тех растений, которые совсем не размножаются или плохо размножаются обычными способами. Три основные модели микроразмножения растений: 1. получение каллуса с последующей индукцией органогенеза или соматического эмбриоидогенеза; 2. индукция развития побегов или соматических эмбриоидов непосредственно из ткани экспланта; 3. пролиферация пазушных побегов. Процесс микроклонального размножения зависит от условий культивирования: регулируемого освещения, фотопериода, контролируемой температуры, без резких перепадов низкой и высокой температуры, относительной влажности воздуха, соответствующей питательной среды. Этапы микроклонального размножения растений: 1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры. 2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов. 3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растенийрегенерантов при пониженной температуре 4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле. §5. Практическое значение метода микроклонального размножения декоративных растений 1. Размножение и закрепление ценных генотипов и мутантных линий 2. Тестирование растений на устойчивость к болезням для дальнейшего размножения наиболее устойчивых растений 3. Получение полиплоидных форм 4. Размножение растений с низкой жизнеспособностью семян 6 Глава 2. Объекты и методы исследований Исследование культуры in vitro Streptocarpus hybrida проводили в лаборатории биотехнологии растений Учебного ботанического сада ПГНИУ в период с октября 2014 г. по январь 2015г. §1. Сорта Streptocarpus hybrida, использовавшиеся в ходе исследования 1. Big Yolk (рис.7, приложение) 2. Hototogisu (рис.8, приложение) 3. Ришелье (рис.9, приложение) 4. Renia (рис.10, приложение) 5. Valor (рис.11, приложение) 6. Samba (рис.12, приложение) §2. Описание этапов работы Схемы стерилизации биоматериала представлены в таблице 1. В качестве первичных эксплантов использовали участки листьев. Перед высадкой на питательную среду места срезов у первичных эксплантов обновляли. Простерилизованный материал по разным схемам и экспланты, полученные при последующих пассажах, высаживали в пробирки на наиболее часто используемую для культуры растительных тканей твердую питательную среду с минеральной основой по Т. Murashige и F. Skoog (МС) (табл.2), витаминами по Р.Г. Бутенко[1], 3% сахарозой, 0,7% агар-агаром. При подготовке питательной среды агар-агар растворяли при нагревании, далее добавляли остальные ингредиенты (рис. 1). Рис.1. Подготовка питательной среды 7 Таблица 1 Схема I II III IV V VI VII VIII IX Схемы стерилизации растений Streptocarpus hybrida Описание 20 мин проточная вода, 40 мин мыльный р-р, 10 сек 70% этанол, 10 мин 7% NaOCl (белизна), 2х кратная промывка в стерильной дистиллированной воде. 20 мин проточная вода, 20 мин мыльный р-р, 20 мин проточная вода, 10 мин 7% NaOCl (белизна), 30 сек промывка в стерильной дистиллированной воде, 30 сек 70% этанол, 2х кратная промывка в стерильной дистиллированной воде. 10 мин проточная вода, 40 мин мыльный р-р, 10 сек 70% этанол, 10 мин 7% лизоформин, 3х кратная промывка в стерильной дистиллированной воде. 20 мин проточная вода, 20 мин мыльный р-р, 20 мин проточная вода, 10 мин 7% лизоформин, 30 сек промывка в стерильной дистиллированной воде, 30 сек 70% этанол, 3х кратная промывка в стерильной дистиллированной воде. 20 мин мыльный р-р, 10 мин проточная вода, 10 мин 7% NaOCl (белизна), 10 мин проточная вода, 1 с 70% этанол, 3х кратная промывка в стерильной дистиллированной воде. 20 мин мыльный р-р, 10 мин проточная вода, 10 мин 3,5% NaOCl (белизна), 10 мин проточная вода, 1 с 70% этанол, 3х кратная промывка в стерильной дистиллированной воде. 20 мин мыльный р-р, 10 мин проточная вода, 1 с 70% этанол, 15 мин 7% NaOCl (белизна), 5х кратная промывка в стерильной дистиллированной воде. 20 мин мыльный р-р, 10 мин проточная вода, 1 с 70% этанол, 15 мин 3,5% NaOCl (белизна), 5х кратная промывка в стерильной дистиллированной воде. 20 мин мыльный р-р, 10 мин проточная вода, 10 мин 3,5% NaOCl (белизна), 10 мин проточная вода, 2 с 70% этанол, 5х кратная промывка в стерильной дистиллированной воде. 8 Таблица 2 Состав питательной среды по Т. Murashige и F. Skoog (МС) Название соли Концентрация Макросоли (г/л) KNO3 38 NH4NO3 33 KH2PO4 3,4 MgSO4× 7H2O 7,4 CaCl2 ×2H2O 8,8 Микросоли (мг/100мл) Na2MoO4×2H2O 25 CuSO4 ×5H2O 2,5 H3BO3 620 MnSO4 ×5H2O 2410 ZnSO4 ×7H2O 2230 KI 83 CoCl2× 6H2O 2,5 FeSO4 557 Na2-ЭДТА 745 Питательные среды стерилизовали паром при температуре +120̊С под давлением 1,1 атмосферы в течение 30 минут (рис. 2). Стерилизацию культуральных сосудов, инструментов и оборудования осуществляли согласно общепринятым методикам [1]. Процесс высадки эксплантов на питательную среду производили в ламинарбоксе в соответствии с правилами работы со стерильным материалом [1] (рис. 3). Через 10-14 дней после очередного пассажа выбраковывали материал, имеющий признаки инфицирования. Одновременно вычисляли отношение числа стерильных объектов к общему числу подвергнутых стерилизации. Кроме того учитывали жизнеспособность стерильного материала определением процента стерильных объектов с признаками регенерации. Пересадку растений на новую питательную среду осуществляли каждый месяц. 9 Рис. 2. Стерилизация питательной среды в автоклаве Рис. 3. Высадка эксплантов на питательную среду В исследованиях мы опробовали 2 способа перевода эксплантов из стерильных условий в нестерильные. 1 способ: в качестве промежуточного этапа использовали перлит. Вспученный перлит — сыпучий, пористый, рыхлый, легкий, долговечный материал, биологически стоек (не подвержен разложению и гниению под действием микроорганизмов). Перлит является экологически чистым и стерильным материалом, не токсичен, не содержит тяжелых металлов. 2 способ: без применения перлита растения из стерильных условий сразу переносили в почву. Глава 3.Результаты исследований §1. Выход стерильной культуры Определяющую роль на начальном этапе микроклонального размножения играет схема стерилизации культуры. Результаты изучения влияния схемы стерилизации на выживание эксплантов представлены в таблице 3. 10 Таблица 3 Влияние схемы стерилизации на выживание эксплантов Сорт Схема Результат (% выживших эксплантов) стерилизации Big Yolk I Ни один из эксплантов не выжил (грибковая инфекция, бактериальное заражение). Вероятнее II всего, исходный посадочный материал нес внутреннюю инфекцию и стерилизация, проведенная нами, не дала положительного результата. Hototogisu III Ни один из эксплантов не выжил (жесткая стерилизация) IV VI 25% VIII 50% IX 95,7% Ришелье III Ни один из эксплантов не выжил (слишком жесткая стерилизация) IV IX 28,6% Valor V 33% VII 43% IX 25% Renia IX 13,3% Можно сделать вывод, что применение для стерилизации схем III, IV (обработка 7%-ным раствором лизоформина в сочетании с 70%-ным раствором этанола в течение 10-30 с) губительно для эксплантов (рис. 4). Применение схемы стерилизации I,II (7% раствор белизны) является недостаточным для стерилизации опушенных листьев стрептокарпуса (рис. 5, 6). Рис. 4 Рис. 5 Рис. 6 Рис.4-6. Внешний вид биоматериала после стерилизации по схемам I,II,III,IV 11 Таким образом, наилучшей мы считаем схему стерилизации под номером IX, которая обладает хорошей стерилизующей способностью, а также не слишком сильно воздействует на живые ткани экспланта. А именно, 20 мин мыльный р-р, 10 мин проточная вода, 10 мин 3,5% NaOCl (белизна), 10 мин проточная вода, 2 с 70% этанол, 5- кратная промывка в стерильной дистиллированной воде. §2. Индукция развития побегов у различных сортов Streptocarpus hybrida Выяснено, что не все сорта Streptocarpus hybrida одинаково реагируют на введение в культуру in vitro. Данные о среднем количестве индуцированных побегов на эксплант представлены в таблице 4. В наших опытах лучшие результаты по регенерации были получены при использовании в качестве эксплантов листьев стрептокарпуса сортов Hototogisu и Valor. Однако впоследствии почти все экспланты сорта Valor погибли, в то время как экспланты сорта Hototogisu продолжили развиваться. Стоит также отметить, что все экспланты сортов Ришелье и Renia через некоторое время погибли от бактериального и грибкового заражения, несмотря на то, что они до этого все же дали несколько побегов. Этапы развития эксплантов сорта Hototogisu представлены на рисунках 7-11. Таблица 4 Среднее количество индуцированных побегов на эксплант Сорт Среднее значение количества побегов, шт/эксплант Valor 21,6 Renia 6,7 Ришелье 3,5 Hototogisu 16,1 Рис. 7 Рис. 8 Рис. 9 12 Рис.10 Рис.11 Рис. 7-11. Этапы развития эксплантов сорта Hototogisu §3. Перевод из культуры in vitro в культуру in vivo Укоренение растений in vitro и высадка в грунт, как известно, является третьим и заключительным этапом микроразмножения растений [2, 91]. По результатам исследования, стрептокарпус сорта Samba, переведенный из условий in vitro (рис. 12) в промежуточную среду (перлит) (рис.13), хорошо укоренился и чувствовал себя намного лучше (рис.14), чем аналогичный посаженный сразу в почву (рис. 15). Рис.12 Рис.13 13 Рис.14 Рис.12. Рост стрептокарпуса сорта Samba in vitro Рис. 15 Рис.13. Рост стрептокарпуса сорта Samba в перлите Рис. 14. Рост стрептокарпуса в грунте после пересадки с перлита Рис. 15. Рост стрептокарпуса в грунте после пересадки из пробирки 14 1. 2. 3. 4. Выводы: В ходе исследования микроклонального размножения растений рода Streptocarpus было испробовано несколько разных способов стерилизации. Наибольшая выживаемость эксплантов была получена при использовании следующего способа стерилизации: 20 мин мыльный р-р, 10 мин проточная вода, 10 мин 3,5% NaOCl(белизна), 10 мин проточная вода, 2 с 70% этанол, 5-кратная промывка в стерильной дистиллированной воде. Было замечено, что выживаемость эксплантов зависит также от сорта. Наилучшим образом показали себя сорта Streptocarpus hybrida Hototogisu и Valor. Выяснено, что при переводе культуры из стерильных условий в нестерильную почву использование промежуточного этапа (рост на перлите) является благоприятным для растений стрептокарпуса гибридного. Выработанные рекомендации были использованы для восстановления коллекции растений рода Streptocarpus в ботаническом саду ПГНИУ г. Пермь. 15 Список литературы 1. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. С. 3–20. 2. Высоцкий, В.А. Клональное микроразмножение растений // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. С. 91-102.. 3. Иванина Л.И «Семейство геснериевых». Л. 1967. 126 с. 4. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Кушнир Г.П. Технология микроклонального размножения растений. Киев: Наукова думка, 1992. 47 с. 5. Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. «Клональное микроразмножение растений». М.: Наука, 1983. 96 с. 6. Лекомцева (Власова) М.С. Микроклональное размножение некоторых комнатных растений. Перм. гос. нац. иссл. ун-т. – Пермь, 2013. С. 18–21. 7. Сорокина И.К. Основы биотехнологии растений. Культура клеток и тканей: Учебное пособие. Cаратов: рекомендовано к изданию УМК биологического факультета СГУ им. Н.Г.Чернышевского. 2002. 34с. 8. http://myflo.ru/index/streptokarpus_uhod_razmnojenie_streptokarpus_iz_semian/ 0-66 9. http://www.biotechnolog.ru/pcell/pcell6_1.htm 10. http://biofile.ru/bio/16215.html 11. http://practice.biotechnolog.ru/recept1.htm 12. http://domfialki.ru/ 16 Приложение Рис.1-6. Некоторые виды рода Streptocarpus Рис.1 Streptocarpus caulescens Vatke Рис.3 Streptocarpus parviflorus Hook.f. Рис.5 Streptocarpus saxorum Engl Рис.2 Streptocarpus dunnii Mast. Рис.4 Streptocarpus rexii Lindl Рис.6 Streptocarpus wendlandii hort. Dammann 17 Рис.7-12. Сорта Streptocarpus, использованные в ходе исследования Рис.7 Big Yolk Рис.9 Ришелье Рис.11 Valor Рис.8 Hototogisu Рис.10 Renia Рис.12 Samba 18
