Статья, подготовленная к печати

Статья, подготовленная к печати.
Молекулярная и клеточная биология как фундамент медицины
Г.П. Георгиев
Часто задается вопрос, для чего нужна фундаментальная наука и, в
частности, молекулярная и клеточная биология (МКБ). Если говорить о
фундаментальной науке вообще, то, прежде всего, следует вспомнить, что
без развитой фундаментальной физики мы не создали бы ядерное оружие и
сегодня были бы в положении Югославии или Ирака, если не в гораздо
худшем, ибо наши природные ресурсы есть, кому прибрать к рукам.
Теперь об МКБ. Простейший довод: вряд ли передовые западные
страны тратили бы на эти области науки около половины всего научного
бюджета, если бы они не играли ключевой роли в нынешнем развитии науки
и инноваций, прежде всего, в области медицины.
Но отойдем от финансовой стороны и остановимся на научных реалиях
МКБ. Некоторые считают, что с расшифровкой генома человека и других
организмов МКБ закончилась, по крайней мере, фундаментальная МКБ.
Однако почти каждый год МКБ преподносит неожиданные и
непредсказуемые результаты, часто полностью меняющие наши
представления о предмете. Так, например, несколько лет назад было открыто
ранее неизвестное семейство маленьких РНК, состоящих из пары десятков
звеньев-нуклеотидов. Неожиданно оказалось, что они играют огромную
роль в жизни клетки, участвуя в регуляции экспрессии многих генов. Более
того, нарушения их образования могут быть связаны с развитием ряда
заболеваний, в том числе, онкологических. Используя малые РНК можно
легко подавлять активность того или иного гена, с участком которого эта
РНК имеет одинаковую структуру. Метод нашел широчайшее применение
для выяснения функции генов, для которых определение структуры генома
мало, что дает.
В России ближе всего к открытию малых РНК и их роли, у его истоков
стояли в конце 90-х гг. ученые Института молекулярной генетики РАН
(ИМГ), Института цитологии РАН и Института биологии развития РАН, но
убогое финансирование не позволило им поставить решающие опыты,
напрямую подтверждающие роль малых РНК в регуляции. Очередная
Нобелевская премия прошла у нас мимо носа.
Сегодня исследования малых РНК начинают широко применять для
диагностики и терапии рака, в том числе, в Институте химической биологии
и фундаментальной медицины СО РАН, где с помощью химических
модификаций сильно повышают их эффективность.
Как это, так и другие описанные ниже исследования ведутся в России в
рамках программы «МКБ» Президиума РАН, начатой в 2003 г. При этом я в
большей степени останавливаюсь на примерах из работ, проводимых в
Институте биологии гена РАН (ИБГ).
Одним из центральных вопросов фундаментальной МКБ является
выяснение механизма регуляции активности генов. Давно известно, что
основная роль в регуляции работы генов, т.е. в синтезе на их матрицах мРНК
(матричных РНК), на которых затем синтезируются белки, принадлежит
регуляторным элементам генома (специальные короткие отрезки ДНК) и
регуляторным белкам, взаимодействующим с этими элементами.
Известен целый ряд регуляторных элементов, выполняющих разные
функции в зависимости от того, с какими регуляторными белками они
взаимодействуют. Не вдаваясь в детали, отмечу, что для одного из классов
таких важных регуляторных элементов, именуемых инсуляторами, в ИБГ
были открыты совершенно новые функции, что привело к пересмотру
устоявшихся в мировой литературе представлений относительно участия
инсуляторов в контроле генетической активности. Функции инсуляторов
оказались гораздо более широкими и разнообразными, чем это ранее
предполагалось. В результате, естественно, расширились и возможности их
практического использования для генной инженерии.
Далее, в том же институте совместно с Институтом молекулярной
биологии РАН (ИМБ) были открыты новые белки – регуляторы активности
генов, которым принадлежит важнейшая роль в контроле и в сопряжении
отдельных этапов экспрессии генов: синтеза мРНК, ее транспорта к ядерной
мембране, переноса в цитоплазму, где и осуществляется образование
кодируемых генами белков.
Уже эти примеры показывают, что до окончательного понимания
процессов жизни и их регуляции мы все еще далеки, нас ждет много
неожиданностей и что российские ученые находятся в ряде областей на
самых передовых рубежах мировой науки.
Данные работы – чисто фундаментальные, выясняющие, как устроена
машина синтеза РНК и ее регуляция. Однако на базе понимания регуляции
работы генов строятся важные области социально ориентированной науки,
во-первых, производство лекарственных белков человека в культурах клеток
или в трансгенных животных и, во-вторых, генная терапия. Здесь, особенно
на втором направлении, мы еще находимся в самом начале пути, и основные
достижения принадлежат будущему.
Именно благодаря развитым фундаментальным исследованиям по
регуляции активности генов в ИБГ удалось впервые в России осуществить
получение трансгенных коз, продуцирующих в молоке лекарственный белок
лактоферрин человека (ЛФЧ). В лаборатории, работающей над проблемами
регуляции экспрессии генов, были созданы генные конструкции, содержащие
ген ЛФЧ и целый набор регуляторных элементов, отвечающих за активный
синтез ЛФЧ именно в молочных железах. В другой лаборатории эту
конструкцию ввели в оплодотворенные яйцеклетки коз, что привело к
получению первичных трансгенных животных, т.е. животных, у которых
данная конструкция внедрилась в геном. На их основе создано небольшое
пока стадо коз-продуцентов, дающих молоко, содержащее в среднем 3 г.
ЛФЧ на 1 л. молока. Таким образом, чисто фундаментальные работы
привели к практически важному результату – получению недорогого и
безопасного источника сильного антимикробного, стимулирующего
иммунитет белка человека. Его применение очень широко – защита от
инфекций недоношенных и находящихся на искусственном вскармливании
детей, борьба с больничными инфекциями, терапия ряда вирусных
заболеваний и многое другое.
Важно, что это удачное начало открывает путь для получения в России
и других лекарственных белков человека. Число нужных для медицины
белков человека уже перевалило за сотню и продолжает непрерывно расти.
Надо лишь понять, где целесообразнее, получать каждый из требуемых
белков, в молоке или в культуре клеток. Кстати, в институте уже
разработаны новые более эффективные конструкции и для культур клеток.
Важным направлением МКБ является изучение генов,
контролирующих клеточные функции. В ИБГ в ходе поиска генов,
влияющих на метастазирование, был открыт ген tag7 и кодируемый им белок
Tag7. Последний неожиданно оказался защитным противораковым белком.
Заранее предсказать это было невозможно. Как оказалось, Tag7 обладает
рядом противоопухолевых активностей.
Далее последовало изучение фундаментальной проблемы клеточных
войн, происходящих в организме, одной из важных проблем МКБ. Известно,
что в редких случаях происходит самоизлечение от рака. Очевидно, что
здесь играют роль защитные клетки организма. Работы в этом направлении
ведутся давно, и было показано, что важную роль в уничтожении раковых
клеток играют так называемые натуральные киллеры (врожденный
иммунитет) и цитотоксические Т лимфоциты (приобретенный иммунитет).
Однако после открытия белка Tag7 оказалось, что число участников
войны против опухолей больше. В ИБГ были выявлено два новых семейства
Т лимфоцитов, участвующих в войне против опухолевых клеток. Клетки
одного из них убивает раковые клетки, секретируя комплекс Tag7 с другим
белком (БТШ-70). Выделяемый комплекс токсичен для многих опухолевых
клеток. Клетки другого семейства Т лимфоцитов связываются с помощью
белка Tag7 с опухолевыми клетками и убивают их контактным способом.
Таким образом, белок Tag7 оказался сильным белковым оружием в войне
лимфоцитов с клетками опухолей. Кроме того, совсем недавно показано,
что, если Tag7 вырабатывается опухолевыми клетками, то к ним активно
устремляются натуральные киллеры, убивающие эти опухолевые клетки.
Из фундаментальных работ, результаты которых нельзя было заранее
предсказать, вышла на свет новая идея ориентированных исследований –
создание вакцин на основе инактивированных опухолевых клеток,
продуцирующих белок Tag7. Из взятых у пациентов фрагментов опухолей
получали клеточные культуры и встраивали в их геном конструкции,
продуцирующие белок Tag7. Полученные таким образом вакцины вводили
пациентам с тем же типом опухоли. На доклинических опытах на мышах
были получены очень обнадеживающие результаты.
Один из видов вакцины, а их сейчас приготовлено несколько разных
типов, был проверен в клинических испытаниях на безнадежных больных, на
которых до этого испробовали без успеха разные типы терапии. У четверти
больных происходили временная остановка роста опухоли или ее частичное
разрушение. Полного излечения на столь позднем этапе болезни удалось
добиться лишь в единичных случаях. Испытания не были доведены до конца
из-за появления новых правил, что пока полностью затормозило дальнейшую
работу в клинике. Правда, за это время были разработаны и проверены на
животных более эффективные типы вакцин, и поняты причины того, почему
к вакцинотерапии чувствительна только часть опухолей.
Я не думаю, что один тип терапии может до конца излечить от
опухоли. Опухолевые клетки обладают неприятной способностью
ускользать от терапевтических воздействий благодаря своей высокой
изменчивости вследствие многочисленных мутаций, т.е. изменений в геноме.
Обычные клетки с поврежденной ДНК кончают жизнь самоубийством,
путем, так называемого, апоптоза. В опухолевых клетках механизм апоптоза
нарушен, и мутанты дают потомство. Среди них изредка встречаются
клетки, устойчивые к проводимому лечению. Они успешно размножаются, и
опухоль прогрессирует.
Поэтому следует стремиться к разработке разных типов терапии с
использованием разных технологий и направленных на различные мишени.
При одновременном применении нескольких разных терапевтических
подходов вероятность приобретения устойчивости к терапии должна стать
ничтожной. Трудно представить, что в одной и той же опухолевой клетке
произойдут одновременно несколько независимых «защитных» мутаций.
Один из новых подходов к терапии рака также возник на основе
фундаментальных исследований. Проводилось изучение механизмов
транспорта макромолекул в клетке. На основании полученных данных
возникла идея доставлять лекарственные препараты направленно в ядра
опухолевых клеток, ДНК которых является для них основной мишенью. Для
этого были созданы так называемые модульные нанотранспортеры (МНТ).
Наиболее эффективные результаты были получены на примере доставки
источников излучений, действующих на очень коротких дистанциях,
меньших, чем радиус клеточного ядра. ДНК, находящаяся в ядре, как раз и
является основной мишенью для убийства клетки с помощью излучений.
Вместе с тем, находящийся вне ядра такой излучатель практически не
повреждает клетку.
МНТ – это искусственные белки, получаемые генно-инженерным
путем. Они содержат независимые друг от друга блоки – модули,
соединенные между собою короткими мостиками. Один из модулей
связывает излучатель, другой находит раковую клетку определенного типа,
третий переносит всю конструкцию в цитоплазму, а четвертый – в ядро
раковой клетки. В результате излучатель оказывается рядом с мишенью,
ДНК, и убивает клетку. Модули можно заменять, настраивая их на тот или
иной тип опухоли или на связывание определенного излучателя.
При использовании излучателей кислородных радикалов, связанных с
МНТ, их деструктивная активность по отношению к опухолевым клеткам
растет в тысячи раз по сравнению с излучателем в свободном состоянии.
При работе с излучателями Оже-электронов эта разница составляет уже
десятки тысяч раз. Решается главная проблема лучевой терапии –
избирательное уничтожение опухолевых клеток при отсутствии повреждения
нормальных. Эта оригинальная технология, разработанная в ИБГ совместно
с МГУ, проходит доклинические испытания и готовится к клиническим
испытаниям в России и в США.
В Институте биоорганической химии РАН (ИБХ) создана система
избирательной доставки токсинов к опухолевым клеткам с помощью
комплекса барназа-барстар, а также разработано введение в клетки генов,
кодирующих токсины, под контролем регуляторных элементов, активных
только в опухолевых клетках. Эти технологии не перекрываются по
механизму с описанными выше технологиями, и поэтому комбинации,
основанные на их одновременном применении, могут оказаться весьма
эффективными. Развитие работ по новым методам терапии опухолей
тормозятся дороговизной самих работ, но особенно доклинических и
клинических испытаний и их неизбежной длительностью. Фирмы же не
интересуются работами, результаты которых не несут немедленной выгоды.
По моим расчетам, при нынешних правилах проведения испытаний
комбинированная терапия, о которой идет речь, даст свои результаты
примерно лет через 10, но при условии адекватного финансирования.
Онкология – далеко не единственная область для практических
выходов МКБ в медицину. Нельзя не отметить важных работ, ведущихся в
основном в лабораториях ИБХ, по аутоиммунным заболеваниям. При этом
клетки, выполняющие обычно защитные функции в организме, начинают
атаку против определенных нормальных клеток. Получено много
оригинальных фундаментальных данных о свойствах этих клеток, и
намечены новые пути для терапии.
Сейчас огромный интерес вызывает заместительная терапия при
помощи стволовых клеток, например для лечения инфарктов миокарда и
поражений нервной системы. Разработан ряд методов получения стволовых
клеток: из эмбрионов, из различных тканей, из обычных соматических клеток
путем введения в них нескольких генетических конструкций. Однако
механизм дифференцировки стволовых клеток в разные типы клеток еще
далек от полного понимания, и здесь активно развиваются серьезные
фундаментальные работы.
Одновременно с этим, при практическом использовании стволовых
клеток очень важно избежать возникновения из них опухолей. Такая работа
с успехом ведется в Институте цитологии РАН. В стволовые клетки
вводится ген-убийца под такими регуляторными элементами, которые
позволяют ему работать только в стволовых клетках. Он кодирует фермент
тимидинкиназу, которая сама по себе вреда клетке не приносит, но при
добавлении тоже безвредного вещества ганцикловира, превращает последний
в токсин, убивающий клетку. После того, как стволовые клетки прошли этап
дифференцировки, ген-убийца перестает работать. Оставшиеся
недифференцированными клетки, могущие привести к развитию опухоли,
продолжают вырабатывать фермент. Если теперь добавить к клеткам
ганцикловир, то избирательно уничтожаются только оставшиеся
недифференцированные стволовые клетки, в которых ген-убийца продолжает
работать. Вероятность возникновения рака из трансплантата резко
снижается. Этот подход должен приблизить широкое использование
стволовых клеток в практической медицине.
Целый ряд исследований в области МКБ посвящен фундаментальным
вопросам развития нервной системы и нейродегенеративным заболеваниям, в
частности, самому распространенному среди них – болезни Альцгеймера. В
фундаментальных работах ИМБ установлены ее молекулярные механизмы:
образование из «здорового» белка бета-амилоида «больной» формы,
содержащей одну измененную (изомеризованную) аминокислоту. Вокруг
таких «больных» молекул формируются токсичные для нервных клеток
крупные агрегаты нормального бета-амилоида. В эксперименте введение
животному в кровь «больных» молекул приводит к развитию заболевания.
На основании этого исследования предложен метод ранней
диагностики болезни. Далее разработан и апробирован на животных метод
лечения, основанный на разрушении токсичных агрегатов белком БТШ-70.
Последний вводится в полость носа и проникает в клетки мозга, оказывая
терапевтическое действие.
Среди внедренных в медицинскую практику достижений МКБ является
создание в ИМГ препарата семакс, который обладает широким спектром
действия, в частности, для лечения инсультов.
В Институте биохимии РАН велось исследование функций генов
туберкулезной палочки. Было установлено, что три гена вырабатывают
белки, которые определяют переход возбудителя туберкулеза из дремлющего
состояния в активное. Инактивация этих трех генов не вела к утрате
жизнеспособности бактерий, но препятствовало развитию болезни. Отсюда
возникла идея использовать штаммы туберкулеза, лишенные упомянутых
генов, как живую вакцину против туберкулеза. В опытах на животных эта
идея себя полностью оправдала.
Говоря о туберкулезе, нельзя не упомянуть уже внедренную в
медицинскую практику разработанные в ИМБ тест-системы на основе
биочипов, которые позволяют идентифицировать более 50 мутаций,
связанных с разными формами микобактерий туберкулеза, в частности
устойчивыми к терапии антибиотиками.
Разрабатываются оригинальные методы борьбы с различными
вирусными инфекциями, в частности, против столь опасной как СПИД: в
ИМБ для этого успешно используются на животных моделях новые
химические соединения и вакцины, полученные на базе модифицированной
ДНК вируса, так называемые ДНК-вакцины.
Огромное значение имеют социально ориентированные исследования в
области МКБ, направленные на поиск генов, определяющих возникновение
болезней или вызывающих предрасположение к ним. Это касается и
онкологических, и сердечнососудистых и неврологических и многих других
социально значимых болезней. В мировой науке накоплен очень большой
материал, но до составления полного списка «вредных» генов, т.е генов,
содержащих мутации, ведущие к болезням, еще далеко. Работа должна
продолжаться, причем она активно ведется и в России, часто в
сотрудничестве с зарубежными лабораториями в составе консорциумов.
Следует упомянуть работы ИМБ, ИМГ и других.
Если такие мутации открыты, то их последующее выявление не
представляет труда в рамках разработанных в ИМБ технологий выявления у
людей мутаций в подозреваемых генах. В ряде случаев выявление вредного
гена позволяет устранить патологию с помощью лекарственных белков
человека, в других – вести тщательное наблюдение за таким человеком,
чтобы начать лечение при первых симптомах болезни. Идеальным решением
явилась бы генная терапия, т.е. замена измененного гена на нормальный.
Эта, одна из важнейших, задач МКБ пока еще не решена, хотя имеется ряд
интересных идей и активно ведется экспериментальная работа. Вопрос
несомненно, будет решен, но когда – точно предсказать невозможно.
Из изложенного видно, что в исследованиях по МКБ, проводимых в
России наработано много подходов для терапии социально значимых
заболеваний. Разумеется, в короткой статье можно охватить лишь
небольшую часть всех достижений. К сожалению, в большинстве случаев не
решена проблема перехода от опытов на животных к постели больного, т.е. к
клиническим испытаниям.
Резюмируя, отмечу, что в чисто фундаментальной МКБ, достигшей за
неполных 60 лет феноменальных успехов, остается еще множество
нерешенных вопросов, на пути решения которых могут возникнуть самые
непредвиденные результаты и открыты новые закономерности жизни.
Естественно, при этом будут появляться и новые практические приложения,
прежде всего, в медицине.
Что же касается социально ориентированной МКБ, то здесь, наряду с
крупными достижениями, имеется еще более широкое поле поиска новых
решений практических задач. Особенно сложным является генная терапия,
направленная на устранение тех многочисленных генетических дефектов,
которыми обременено современное человечество. От развития МКБ в
значительной мере зависит будущее медицины, а, в конечном итоге, здоровье
нации.
Было бы очень важно объединить усилия ученых РАН, Минздрава,
РАМН, медицинских институтов и университетов в исследованиях по МКБ,
возможно, путем создания государственной программы «МКБ и медицина».
При ее создании следует использовать огромный опыт, накопленный
программой Президиума РАН «МКБ». В частности, важно взять на
вооружение принятые в ней правила проведения конкурса и отчетности,
которые обеспечивают объективный отбор сильнейших, поддержку
талантливой молодежи и максимальную научную отдачу.