Пероральный прием Agaricus blazei (Штамм H1) - подавление опухолевого роста при саркоме

Пероральный прием Agaricus blazei
(Штамм H1) - подавление опухолевого
роста при саркоме
Yun-Lyul LEE1), Heui-Jin KIM2), Ми-Sook LEE3), Ji-Min KIM4), Jin-Soo HAN5), Euk-Ki HONG6), Myung-пел
KWON7), и Минуту-Jae LEE8),
1) Депертамент Физиологии Медицинского колледжа, Университета Hallym, Chunchun, 2) Департамент
лабораторной науки о животных, Медицинский колледж, Сеульский Национальный Университет, Сеул, 3)
Депертамент патологи Медицинского колледжа Сеульского Национального Университета, Сеул, 4)
Исследовательский центр Yuhan,Корпорация Yuhan, Аньян, Kyunggido, 5) Биологический исследовательский
Центр,Hoe-Eun Институт, Gyeongigi, 6) Департамент Лабораторной, Экологической и Биологической
Разработки,Колледж Eengineering, 7) Отдел Ветеринарии, Ветеринарный научный Центр, Kangwon
Национальный Университет, Chunchun, и 8) Депертамент лабораторных научных Исследований, Самсунг
Биомедицинский Научно-исследовательский институт, Сеул, Корея
Резюме: Agaricus blazei (вид H1) был проверен на антираковое воздействие, на
опухолевой модели саркомы 180 (S180) и были исследованы изменяющиеся образцы
подмножеств спленоцитов. Горячую вытяжку гриба вводили перорально ICR мышам и
KSN голым мышам, которым делались прививки S180. Рост S180 в рассмотренных
группах был значительно ингибирован A.blazei. Все T- клетки значительно
увеличились во всех рассмотренных группах по сравнению с контрольными, даже у
KSN голых мышей. Изменения спленоцитов различались у групп ICR мышей и KSN
голых мышей. Эта опухолевая модель S180, оказалось неэффективной в
экранировании антиопухолевой активности базидиомицетов, и позволила сравнить
иммунологические клеточные изменения у разных пород мышей.
Введение
Agaricus blazei (агарик бразильский), новый лечебный гриб, в течение долгого времени
использовался в качестве лекарственного больными раком. Так же сообщали, о его
антимутационных, бактерицидных и антиопухолевых свойствах. Его антираковые свойства
основываются на восстановлении или усилении реакции иммунной системы, а также на
усилении охранных свойств организма носителя путем повышения клеточного иммунитета.
Саркома 180 (S180) – это прививаемая мышам опухоль, одна из наиболее часто
используемых линий клеток в исследованиях, связанных с антиопухолевым воздействием,
проводимых in vivo. Также сообщалось, что полисахариды, извлеченные из базидиомицетов,
усиленно тормозят рост S180, введенного мышам подкожно, стимулируя защитные
механизмы хозяина.
До настоящего времени, исследования связанные с Agaricus blazei главным образом
подразумевали химический анализ. Внутрибрюшинное введение обычно применялось в
опытах, когда прививки S180 делались для того, чтобы изучать влияние естественных
продуктов in vivo, включая A. blazei. Используя информацию, полученную из данных
исследований, мы изучили антиопухолевое воздействие при пероральном введении A. Blazei.
Мы использовали модель in vivo. На основании клинических испытаний были исследованы
детальные изменения спленоцитов.
Материалы и Методы
Подготовка экстрагирования Agaricus blazei (вид H1) в горячей воде.
Горячие вытяжки A. blazei (штамм H1) были получены из Лаборатории Экологической
и Биологической Разработки, Национальный Университет Кангвона, и проведены
следующим образом: высушенный A. blazei был раздроблен, и полученный порошок был
разведён дистиллированной водой при температуре 90°C в течение 12 часов. После
выделения нерастворимого остатка через фильтр Advantec #2, в полученный раствор были,
добавлены 3 части холодного этанола для выделения осадка. Осадок был растворен в воде и
диализирован в течение 2 дней. Коричневый порошок, полученный после сушки
сублимацией супернатанта – использовался для исследований.
Опухоль
Саркома 180 (S180) поставлялась Корейским Банком Линий Клеток (KCLB), Научноисследовательский
онкологический
институт,
Сеул,
Корея,
и
содержалась
6
внутрибрюшинными переносами в мышах ICR (5 x 10 клеток/голова); куплены от
Biogenetics, Корея in vivo.
Пробы Sulforhodamine (SRB)
После предварительного отбора S180 в 5 x 103 клетка/well в 180 μl, A.blazei был
добавлен в размере 20 μl/well в концентрациях, показанных в Таблице 1, и содержался там в
течение 48 часов. Плавающий на поверхности осадок был втянут воздухом, помещен в
холодный раствор (50 μl/well) 50 % трихлоруксусной кислоты (TCA) при температуре 4°C на
1 час, и затем высушен. После окрашивания 0.4 % раствором,SRB в 1%-ой уксусной кислоте
(100 μ1) в течение 30 минут, оптическая плотность (OD) составила 540 нитрометанов.
Моделирование прививки S180
Пятинедельные самцы ICR и атимическая KSN голая мышь были куплены от SLC Inc,
Япония. Всем мышам в этом исследовании были сделаны прививки S180 в спинную области
(п/к 1 x 105 ячеек/мышей), и после 7 дней (нулевой день) мыши с раковыми образованиями
более чем 5 мм в диаметре были разделены на 3 группы, для формирования похожих
усредненных групп относительно размера опухоли. Каждой группе мышей каждой породы
ежедневно давали перорально A. blazei следующим образом: 0 мг/кг (контрольная), 100 мг/кг,
и 300 мг/кг в нормальном соляном растворе. Масса тела и употребление пищи каждый день
записывались. В дни 10-й, 17-й, и 24-й, шестью мышами в группе жертвовалось для
проведения цервикальной дислокации, и затем органы и опухоли были удалены, взвешены, и
использовались для поточной цитометрии.
Таблица 1. Норма подавления роста опухоли при использовании горячей вытяжки A. Blazei.
Саркома
180
A. blazei
conс.
5x
105
1 х 106
1 х 107
Контрольная (0)
-
-
-
3
3.6
3.9
2.4
10
4.4
3.2
2.8
30
9.2
10.8
7.3
100
17.3
19.3
14.0
1 000
32.0
30.5
26.3
Концентрация клеток составила 5 x 105, 1 x 106, 1 x 107/well, и значение (n=6/группа/проба).
Анализ антиопухолевого воздействия
Диаметр опухоли измерялся каждый день кронциркулем. Объем опухоли и
процентное подавление были определены, следующей формулой [11]: объем опухоли (cm3) =
4/3π (а2b)/2, где а – короткий диаметр (mm2) и b - длинный диаметр (mm2); подавление рака
(%) = (1-T/C) x 100 %, где T - среднее значение для рассмотренных групп и С, - средние
значение контрольных групп.
Исследования лимфоцитов селезёнки
Все шесть селезенок из каждой группы были пропущены через петлю из
нержавеющей стали, и затем были разложены красные кровяные клетки (RBCs). После
трехразового промывания сбалансированным соляным раствором Хэнка (HBSS) спленоциты
(1 x 106/мл) были помещены в Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 с 10%-ой
эмбриональной бычьей сывороткой (FBS), и раздвоено окрашены на льду в течение 30 минут
каждым моноклональным антителом (mAb). После трехразовой промывки, клетки были
помещены и зафиксированы в 0.5 мл 1%-ого формалина в холодной PBS, измерены с
помощью FACScan поточной цитометрии (Beckton Dickinson, США), и исследованы с
помощью CELLQuest (ver. 1.2).
Все моноклональные антитела были куплены в Serotec Ltd., и были следующими:
антимышь хомячья TCRαβ (клон Х57-597), антимышь мыши антиген NK1.1 (клон PK136), и
антимышь крысы CD3 (клон KT3), CD8 α (клон KT15), TNFα (клон MP6-XT22), CD4 (клон
KT174), CD25 (клон PC61.5.3), и CD40 (клон 3/23).
Показатели Селезенки
Вес селезенок пожертвованных мышей был измерен, и результат был выражены как
масса органа на массу тела единицы, названный показателем селезенки (масса тела мг/г).
Статистические Исследования
Все величины в этом исследовании представлены как средняя величина ± S.D. Метод
Дункана и дисперсионный анализ (ANOVA) использовались для определения критериев
значимости. Вероятности меньшие чем 5 % (P <0.05) считались существенными.
Результаты
Горячая вытяжка-экстракт A. blazei подавляет саркому 180 (S180) в зависимости от доз
in vivo и в пробах SRB (Таблица 1). Антиопухолевое воздействие A. blazei на S180
подытожены на рис. 1. Размер опухоли уменьшился, и коэффициент подавления со временем
увеличился во всех рассмотренных группах по сравнению с контрольными, и стал более
очевидным в течение дней 17 - 24. Подавление роста опухоли было намного больше в мышах
ICR чем в мышах KSN. Размер опухоли в мышах KSN был сопоставим с контрольной
группой до 17 дня. Размер опухоли на 24 день в группе 100 мг/кг каждой породы был меньше
чем в группе 300 мг/кг.
В мышах ICR, Показатель селезенки (S.I) не увеличился по сравнению с нормальными
мышами, за исключением контрольной группы (1.5196 ± 1.5529). Однако, все мыши KSN
показали существенный рост или тенденцию к росту S.I. (P <0.05) (Таблица 2).
Все T (CD+) клетки, непрерывно росли во всех рассмотренных группах мышей KSN, и
активизированные T клетки также росли (Таблица 3). Все величины в рассмотренных
группах достигли максимума на 17 день и затем немного уменьшились, но в контрольных
группах они спонтанно увеличились. Процент CD3 и обоюдно положительных клеток CD25
во всех рассмотренных группах был выше, чем те же величины в контрольных группах обеих
пород. Подобная тенденция наблюдалась в положительных клетках CD4, с максимальным
ростом в группе мышей 100 мг/кг ICR (17 день) и KSN (24 день). Во всех подопытных
группах мышей KSN наблюдался рост CD8 положительных клеток, однако, в мышах ICR, он
не был существенным. CD3 положительные клетки и TCR α/β рецепторы положительных
клеток были повышенными на 17 день в группах мышей ICR 100 мг/кг.
Рис. 1. Изменение объема опухоли (cm3) вызванное горячей вытяжкой A. blazei
Исследования на подкожно внедренной Саркоме 180
в мышах ICR и KSN (n=6/группа).
Обсуждение
A. blazei, даваемый перорально, тормозит рост опухоли. Антиопухолевое воздействие
штамма H1 увеличивалось в KSN голых мышах, подобно, как и Ito Iwade 101 штамма. Он
эффективно подавляет рост опухоли у мышей и крыс [8]. Мы вводили A. blazei, в целом, что
не было изучено прежде [1, 2, 5].
Таблица 2. Показатель селезенки (S.I).
Штамм
Дни
ICR
KSN
10
17
24
10
17
24
(+) Контрольная
0.5104 ±
0.1743
0.6784 ±
0.2101
1.5196±1.5
529
0.7221 ±
0.3096
1.668
±0.5786 **
1.9287
±0.9843 **
100 мг/кг
0.4433 ±
0.0963**
0.5575 ±
0.0548
0.4225 ±
0.0768
0.7406 ±
0.2770*
1.8173 ±
0.4521 **
1.5707 ±
0.6080**
300 мг/кг
0.4551±0.09
50*
0.6804 ±
0.2441
0.4564 ±
0.0657
1.0622 ±
0.1898 **
1.9276 ±
0.2343 **
1.8719 ±
0.4380*
S.I. измерялся как вес селезенки/масса тела (мг/г). Каждая величина представлена как средняя ± S.D. (n=6). S.I.
нормальных мышей был следующий: мыши ICR, 0.7703 ± 0.4453, мыши KSN 0.3883 ± 0.0242.
* и ** означает P <0.05 и P <0.01 по сравнению с нормальными мышами, соответственно.
Таблица 3. Воздействие на селезёночный CD3, CD4, CD8, CD40, и положительные
клетки NKR после прививок саркомы 180
Процент позитивных клеток
Лечение
День
CD3 +
Все Т
клетки
CD3
+/25+
CD4 +
Th
клетки
CD4
+/8+
CD8 +
Тс
клетки
CD40 +
В клетки
8.26+0.4
0
16.05+0.
72
TCR α/β
Мыши ICR
13.23 ±
5.21
Нормальные
(+) Контрольная
100 мг/кг
2.97+0.5
2
10
8.71 ±
4.84a
0.52 ±
0.45
11.86 ±
7.41
3.36 ±
0.55
12.69 ±
6.50
33.25 ±
22.85
0.23 ±
0.09a
17
39.32 ±
16.76
1.96 ±
0.62
19.29 ±
8.16
6.55 ±
5.41
20.87 ±
15.50
44.11 ±
13.19
1.97 ±
1.97
24
25.74 ±
14.61
1.86 ±
0.61
18.96 ±
11.80
0.87 ±
0.33
9.08 ±
2.93
43.13 ±
16.17
22.63 ±
12.68
10
26.25 ±
6.45b
1.02 ±
0.37b
15.60 ±
7.96
2.66 ±
0.30
12.22 ±
3.78
52.41 ±
21.87
0.32 ±
0.14a
300 мг/кг
17
5.61 ±
1.99b
2.30 ±
0.26
28.02 ±
7.91b
2.88 ±
3.94
9.83 ±
4.71
49.74 ±
1.59b
4.39 ±
10.52
24
33.66 ±
1.26
1.70 ±
0.35b
24.43 ±
2.10b
1.04 ±
0.28
12.04 ±
1.91
55.79 ±
4.83
30.63 ±
1.96
10
27.01 ±
1.36c
1.60 ±
0.30c
19.31 ±
3.31
3.47 ±
1.13
11.61 ±
1.15b
69.42 ±
4.20
0.02 ±
0.02b
17
9.93 ±
5.81b
1.99 ±
0.46
22.36 ±
4.31b
2.32 ±
2.28
10.57 ±
1.98b
52.47 ±
5.90
0.52 ±
0.61
24
6.54 ±
3.61a
1.99 ±
0.42b
25.93 ±
4.19b
2.73 ±
2.50
12.21 ±
1.35
49.54 ±
3.67
25.20 ±
3.88
1.29 ±
0.43
0.51 ±
0.09
1.76 ±
0.26
2.80 ±
0.20
20.74 ±
13.52
80.36 ±
2.27
0.50 ±
0.18
10
0.67 ±
0.04
0.35 ±
0.83
2.72 ±
0.29
1.60 ±
0.27
6.73 ±
0.78
66.41 ±
4.07
0.29 ±
0.10a
17
3.91 ±
0.75
0.24 ±
0.05
1.03 ±
0.19
0.70 ±
0.19
8.71 ±
1.92
48.20 ±
3.43
0.79 ±
0.80a
24
8.05 ±
1.35
0.98 ±
0.22
1.19 ±
0.14
2.30 ±
0.17
19.74 ±
3.18
62.21 ±
1.26
1.04 ±
0.65
10
3.35 ±
0.86b
1.30 ±
0.46b
3.69 ±
1.15
4.33 ±
1.17b
18.32 ±
11.94
59.24 ±
5.22
1.98 ±
1.34b
17
3.28 ±
0.58b
0.21 ±
0.12
1.01 ±
0.29b
0.52 ±
0.08
7.42 ±
2.51
48.24 ±
5.95
1.76 ±
0.67b
24
10.29 ±
2.07
2.16 ±
1.04b
1.41 ±
0.31b
2.64 ±
1.24
18.09 ±
3.55
58.33 ±
3.10
4.49 ±
1.23
1.46 ±
1.06 ±
4.44 ±
0.76
3.61 ±
8.88 ±
53.49 ±
3.64
1.01 ±
Мыши KSN
Нормальные
(+) Контрольная
100 мг/кг
300 мг/кг
10
0.41c
0.38b
17
3.51 ±
0.70b
0.25 ±
0.08
24
7.20 ±
1.53
1.52 ±
0.28b
0.73b
0.41b
0.53b
1.31 ±
0.56b
0.64 ±
0.37
8.06 ±
0.41b
51.18 ±
3.80a
0.24 ±
0.07a
1.13 ±
0.46b
1.94 ±
0.64
15.69 ±
2.65
51.01 ±
6.88
4.08 ±
2.35
Каждая величина представлена как среднее значение ±S.D. (n=6/группа). N/T означает 'не проверенный'. abc
разные верхние индексы в одной и той же колонке значительно отличаются при α = 0.05 уровня в
Множественном тесте Дункана
Было предположено, что полисахариды съедобных грибов должны быть вовлечены в
активацию различных иммунокомпетентных клеток, таких как макрофаги, нейтрофилы, T
клетки и NK клетки [3, 12]. Клетки NK - одни из первых действуют в случае реакции
иммунной системы, и они широко распространены у голых мышей. Существенное
увеличение количества NK клеток было отмечено после введения A. blazei. Таким образом,
мы полагаем, что эффект подавления рака был подобным у мышей ICR и KSN в течение
первых 7 дней. Кроме того, увеличение относительного веса селезенки (Таблица 2)
указывает, что A. blazei воздействовал на иммунологические клетки. Антиопухолевое
воздействие A. blazei было продемонстрировано на мышах ICR in vitro и in vivo. Случаи
орального введения мышам Swiss/NIH были описаны Ито и др. [7], используя метод
прививки SI80. Однако, данное исследование показало более эффективное подавление роста
рака с использованием той же самой линии клеток. В настоящем исследовании штамм H1
был проверен в целом, а не как функциональные вещества, и обнаружил свое антиопухолевое
воздействие при оральном применении, подобное тому, которое наблюдается у людей. Мы
полагаем, что необходимо исследовать компоненты экстракта, чтобы определить причину
данного эффекта.
Процент подавления рака со временем уменьшился в мышах KSN, даже при том, что
рост клеток T наблюдался в обеих группах мышей ICR и KSN. Процент роста иммуноцитов в
мышах KSN был выше, чем в мышах ICR, поэтому реакции иммунной системы на
количество и последовательность могут быть важными при подавлении рака. Было сделано
предположение, что механизм антиопухолевого воздействия полисахаридов является
следствием повышения защиты носителя путем активации роста клеточного иммунитета [4,
11]. Таким образом , T-клетки демонстрируют возможность воздействия на раковые
новообразования благодаря A. blazei и другим полисахаридам, однако, другие клетки
иммунной системы также увеличивались и систематически подавляли SI80. Даже притом,
что голые мыши долго использовались для общих исследований из-за их генетической
иммунной недостаточности, KSN голые мыши не обеспечивают достаточных показателей
для различения воздействия активных иммунологических клеточных подмножеств и
подавляющего опухоли механизма A. blazei. Поэтому, возможно имеет смысл провести
дополнительные исследования на другие иммунодефицитных животных, типа тех, которые
испытывают нехватку В и Т клеток.
В заключение предложено, что горячая вытяжка A. blazei (штамм H1) может вызывать
антиопухолевую активность, стимулируя иммуноциты, так как содержит рабочие вещества.
Даже при том, что рост клеток опухоли in vitro не был полностью подавлен, было отмечено
антираковое воздействие in vivo. Это показало разницу эффективности воздействия между
шаммами [1, 3, 4, 7, 11] на моделях S180. Таким образом, для определения антиопухолевого
воздействия A. blazei или других полисахаридов на естественных продуктах, более
эффективной является модель с использованием прививки, чем исследование in vitro. Однако,
мы должны знать, какое вещество в A. blazei ингибирует клетки. Кроме того, более детальное
исследование его специфики по отношению к органам или разновидностям может быть
ценным в рамках разъяснения его способа действия, и мы предлагаем изучить его
антиопухолевую активность на различных органах.
Благодарности
Это исследование было поддержано Академией Научного Университета Hallym, Корея
(2000-5-2).