На правах рукописи СЭНДВИЧ-МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ HBsAg С ПОМОЩЬЮ рН-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ СОРБИРУЕМЫХ
реклама
На правах рукописи Яковлева Динора Абдуллаевна СЭНДВИЧ-МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ HBsAg С ПОМОЩЬЮ рН-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ СОРБИРУЕМЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" РАМН Научные руководители: доктор биологических наук Дмитриев Александр Дмитриевич доктор медицинских наук, профессор Лавров Вячеслав Федорович Официальные оппоненты: доктор биологических наук Борисова Татьяна Константиновна доктор медицинских наук, профессор Семенков Виктор Фадеевич Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Российская медицинская академия последипломного образования" Министерства здравоохранения и социального развития России. Защита состоится 15 марта 2012 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064 г. Москва, Малый Казенный пер., д.5а. Автореферат разослан «… »февраля 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук И.В. Яковлева 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Твердофазный иммунохимический сэндвич-метод определения антигенов белковой природы широко используется в различных областях биологии и медицины, в том числе для выявления маркеров вирусных инфекций [Егоров, 1991; Khan and Findlay, 2010]. Традиционная схема сэндвич-метода включает несколько стадий. Во-первых, на твердую фазу адсорбируют моноклональные антитела (МКА), специфичные в отношении одного из эпитопов тестируемого антигена (иммобилизованные антитела). Затем поверхность твердой фазы инкубируют со смесью определяемого антигена и меченых (детектирующих) антител. Иммобилизованные и меченые антитела направлены, как правило, к разным эпитопам определяемого антигена. В результате иммунной реакции на поверхности твердой фазы образуется трехслойный комплекс: [иммобилизованные антитела - антиген - меченые антитела], называемый сэндвичем. В таком иммунном комплексе концентрация определяемого антигена пропорциональна концентрации меченых антител, детектирующий агент которых (например, фермент) обеспечивает регистрируемый сигнал (окрашивание). Сэндвич-метод с использованием пары МКА к разным эпитопам антигена называют двухсайтным. Благодаря высокой чувствительности, специфичности и относительной простоте исполнения сэндвич-метод нашел широкое применение для скрининга образцов донорской крови на возможную зараженность вирусом гепатита В, а также для ранней диагностики этого заболевания [Лобзин с соавт., 2006]. Вместе с тем, чувствительность тест-систем, производимых ведущими компаниями, варьирует в пределах 0,036 - 0,408 МЕ/мл [H. 3 Scheiblauer et al., чувствительность 2009].1 Важнейшим сэндвич-метода, является фактором, определяющим концентрация активных антигенсвязывающих сайтов антител адсорбированных на поверхности твердой фазы. При прямой (пассивной) сорбции МКА на поверхность иммунных планшетов около 90 - 99 % антител может утерять способность связывать антиген в результате денатурации и неправильной ориентации молекул [Butler, 2004; Liu et al., 2010]. Для сохранения активности иммобилизуемых антител был предложен ряд подходов, предполагающих непрямую сорбцию МКА на поверхность твердой фазы (например, через стрептавидин-биотиновые мостики). Однако пассивная адсорбция попрежнему остается весьма распространенным способом иммобилизации антител в силу ее простоты и дешевизны. Таким образом, поиск новых методических приемов, позволяющих в максимальной степени сохранить антигенсвязывающую активность иммобилизуемых МКА и тем самым увеличить чувствительность тест-систем, является весьма актуальной задачей. Цель исследования: Конструирование иммуноферментного сэндвич-метода определения HВsAg, основанного на прямой сорбции МКА на поверхность иммунных планшетов и обладающего высокой аналитической чувствительностью; совершенствование метода путем увеличения антигенсвязывающей активности иммобилизуемых МКА путем их адсорбции при различных значениях рН (в том числе экстремально кислых рН). Задачи исследования: 1. Получить панель гибридомных клеточных линий – продуцентов высокоаффинных моноклональных антител к поверхностному антигену вируса гепатита В (HBsAg). 2. Отобрать высокоаффинные МКА, эффективно взаимодействующие с В упомянутых тест-системах используется метод ИФА и детектирующие антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена 1 4 HBsAg серотипов adw и ayw. 3. Подобрать пары МКА (иммобилизуемых и меченых), сочетание которых обеспечивает обеспечивающих высокую аналитическую чувствительность сэндвич-метода. 4. Проанализировать эффективность отобранных МКА в сэндвич-методе после иммобилизации сорбируемых антител на поверхность иммунных планшетов при кислых, нейтральных и щелочных значениях рН. 5. Подобрать условия сэндвич-метода, обеспечивающие обнаружение HBsAg в сыворотке крови больных, инфицированных вирусом гепатита В, в концентрациях 0,02 нг/мл (для n=5). Научная новизна исследования Получена гибридома (18С8) – продуцент уникальных МКА. Антигенсвязывающая активность МКА 18С8 увеличивается более чем в два раза при их адсорбции на поверхность иммунных планшетов в жестких условиях (рН 2,8), в сравнении с адсорбцией при нейтральном значении рН (7,5). Использование МКА 18С8 позволило сконструировать и внедрить в производство сэндвич-метод тестирования HBsAg в сыворотке крови, обеспечивающий минимальную достоверно определяемую концентрацию антигена (для n=5) на уровне 0,013 – 0,017 МЕ/мл. В дополнение к этому метод позволяет определять в сыворотке HBsAg серотипов: аyw2, аyw3varА, аyw3varB, аdr и аdw. Практическая значимость Получена высокочувствительная диагностическая тест-система с высокими аналитическими свойствами для выявления HBsAg в крови. Обнаруженный феномен увеличения антигенсвязывающей активности некоторых МКА при их адсорбции на поверхность иммунных планшетов в "жестких" условиях иммунохимии, в (рН 2,8) частности, может при быть полезен конструировании в практической сэндвич-методов, предназначенных для идентификации инфекционных агентов и других 5 имеющих диагностическое значение белков (гормонов, маркеров инфаркта миокарда, онкомаркёров и т.п.). Наряду с этим описанный феномен может использоваться в конкурентном анализе при создании диагностических систем для тестирования стероидных гормонов и других низкомолекулярных лигандов. Феномен заслуживает дальнейшего изучения, как с теоретической точки зрения, так и в практическом аспекте. Положения, выносимые на защиту 1. На основе полученной в работе панели МКА к HBsAg сконструирован сэндвич-метод определения HBsAg в сыворотке крови, обладающий высокой аналитической чувствительностью. Минимальная достоверно определяемая концентрация HBsAg в сыворотке крови для сконструированного метода составила 0,013 – 0,017 МЕ/мл 2. В ходе оптимизации адсорбции МКА на твердую фазу (полистироловые планшеты) были обнаружены антитела, биологическая активность которых сохранялась значительно лучше после иммобилизации при кислых значениях рН (2,8) по сравнению с сорбцией при рН 7,5 и 9,5. В случае МКА 18С8, обладавших наибольшей ацидофильностью, минимальная достоверно определяемая концентрация HBsAg уменьшалась в 7 – 10 раз. Использование МКА 18С8, адсорбированных при рН 2,8, позволило сконструировать вышеупомянутый сэндвич-метод. 3. Изменение рН адсорбции МКА не влияло на общую поверхностную концентрацию антител на поверхности иммунных планшетов. 4. Описанный в настоящей работе простой методический прием, который заключается в использовании буферных растворов с низким значением рН для адсорбции антител на полистироловую поверхность планшетов, может быть рекомендован для оптимизации как конкурентных, так и сэндвичметодов определения антигенов. Внедрение результатов работы в практику Материалы диссертации в 2011-12 гг. использовались в педагогическом процессе (лекциях и семинарских занятиях) кафедр вирусологии и 6 эпидемиологии ГБОУ ДПО "Российская медицинская академия последипломного образования" Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. Апробация работы Работа была доложена на международной конференции "Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями" (СанктПетербург, 2010 г.). По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, 2 из которых в журналах, рекомендуемых ВАК. Апробация диссертации состоялась 2 марта 2010 года на научной конференции отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Материалы Три препарата HBsAg: антиген, очищенный из крови, рекомбинантный HBsAg серотипа adw и рекомбинантный антиген серотипа ayw были любезно предоставлены НПО "Диагностические системы". В работе использовали иммунные планшеты фирмы “Nunс”, рекомбинантный стрептавидин и стрептавидин-пероксидазу НПО "Диагностические системы". Конъюгаты МКА и аффинных кроличьих антител к IgG мыши с пероксидазой хрена готовили в лаборатории периодатным методом [Nakane and Kawaoi, 1974]. Методы Получение гибридом. Гибридомы получали по методу Келлера и Мильштейна [Koller and Milstein, 1975], используя технику слияния, принятую в лаборатории [Massino et al., 1992]. Культуральную среду от каждой выросшей гибридомы тестировали на наличие антител к HBsAg твердофазным иммуноферментным методом (ИФА). Положительные гибридомы клонировали методом лимитирующих разведений, используя в качестве питающего слоя мышиные перитонеальные клетки. 7 Определение антигенсвязывающей активности антител. Для определения антигенсвязывающей активности антител иммунные планшеты насыщали HBsAg в течение ночи при комнатной температуре (1 мкг/мл в 0,05 М Na-фосфатном буфере рН 7,5; 100 мкл раствора на лунку). Прочие процедуры твердофазного ИФА описаны ранее [Nikulina et al., 2000]. Очистка антител. МКА очищали из асцитной жидкости с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе, как описано ранее [Massino et al., 1997]. Фракции пиков объединяли и определяли антигенсвязывающую активность антител, как описано выше. Определение концентрации антител. Концентрацию очищенных иммуноглобулинов определяли оптическим методом, полагая, что для см однопроцентного раствора мышиных антител А1280 =14 [Fasman, 1976]; для нм однопроцентного раствора очищенной пероксидазы 1 см А403 нм =22,75 и 1 см 1 см А280 нм =7,3 [Ishikawa et al., 1983]; для рекомбинантных HBsAg А280 нм =0,33. Приготовление конъюгатов. МКА конъюгировали с пероксидазой хрена периодатным методом [Nakane and Kawaoi, 1974]. После диализа к готовому раствору конъюгата добавляли раствор мертиолята (до 0,02%) и равный объем глицерина. Конъюгат хранили при -20. Подбор пар МКА, образующих сэндвич с HBsAg проводили, как описано ранее [Nikulina et al., 2000]. Оптимизация рН сорбции антител. Для оптимизации рН сорбции антител на поверхности иммунных планшетов готовили буферы со следующими значениями рН: 0,1 М трис-глициновый рН 2,8; 0,025 М Naфосфатный рН 7,5 и 0,05 М гидрокарбонатный рН 9,5. Антитела (3 мкг/мл) растворяли в указанных буферах и насыщали полоски иммунных планшетов (100 мкл антител на лунку) в течение ночи при комнатной температуре. Определение HBsAg в сыворотке крови. При определении HBsAg в сыворотке крови инкубационная смесь конечным объемом 200 мкл включала: 150 мкл неизвестного образца сыворотки крови (или 150 мкл стандарта, 8 разведенного в сыворотке крови, заведомо не содержащей HBsAg) и 50 мкл раствора конъюгата антител с пероксидазой хрена в ИФА-буфере, либо в разводящем растворе НПО "Диагностические системы" в концентрации 1,4 мкг/мл. Планшеты инкубировали при покачивании на шейкере 75 мин при 420, споласкивали 4-5 раз отмывающим буфером и проводили окрашивание с помощью тетраметилбензидина (ТМБ). Определение минимальной достоверно определяемой концентрации HBsAg в сыворотке крови. Минимальная достоверно определяемая концентрация рассчитывалась как превышение поглощения при тестируемой концентрации антигена над поглощением, даваемым нулевым стандартом 3 среднеквадратичных отклонения для n=5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Получение панели гибридом для конструирования сэндвич-метода и характеристика секретируемых антител После слияния спленоцитов иммунной мыши с миеломой X63Ag8.653 в культуральных супернатантах определяли активность МКА по их связыванию с иммобилизованным HВsAg. В результате шести слияний для дальнейшей работы было отобрано шесть клонов, антитела которых можно было обнаружить в твердофазном ИФА при разведении культуральных супернатантов в 2×104 - 4×104 раз. МКА, секретируемые этими гибридомами (после трехкратного клонирования), были очищены из асцитных жидкостей путем ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе. Чистоту очищенных МКА проверяли с помощью SDS-ПААГ электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле. Во всех очищенных препаратах МКА нашей панели выявляли два полипептида с молекулярными массами (23-25 кДа и 45-48 кДа), что соответствует мол. массе легких и тяжелых цепей IgG. Минорные полосы практически не обнаруживались. Таким образом, чистота полученных МКА превышала 95% (данные не приводятся). Антитела всех отобранных нами гибридом тестировали на связывание с различными иммобилизованными препаратами HВsAg (белком, очищенным 9 из крови и рекомбинантными HBsAg серотипов adw и ayw). Рис. 1 иллюстрирует связывание антител клона 18С8 (МКА 18С8) с иммобилизованным HBsAg. 1,6 очищенный из крови рекомбинантный, серотип ayw рекомбинантный, серотип adw Поглощение 1,2 0,8 y = 0,72x 0,4 y = 0,68x y = 0,63x 0 0 1 2 Антитела, нг/мл Рис. 1. Связывание МКА 18С8 с различными препаратами HBsAg, иммобилизованными на поверхность иммунных планшетов. □—□ – кривая связывания с HBsAg, очищенном из крови; ■—■ – кривая связывания с рекомбинантным HBsAg серотипа adw; ▲—▲ – кривая связывания с рекомбинантным HBsAg серотипа ayw. Планшеты насыщали указанным препаратом HBsAg и последовательно инкубировали с антителами и конъюгатом [кролик, анти-мышь]. Можно видеть, что коэффициенты кривых связывания МКА 18С8 с HBsAg из различных источников варьируют весьма незначительно: от 7,2×10-1 (для кривой связывания с HBsAg, очищенным из крови) до 6,3×10-1 (кривая связывания с рекомбинантным HBsAg серотипа adw). Таким образом, МКА 18С8 одинаково специфичны при связывании с HBsAg обоих тестированных серотипов и антигеном, очищенном из крови. Сходные результаты были получены для других МКА нашей панели (данные не приводятся). Кроме того, нами был определен изотип всех очищенных МКА (изотип антител приводится в Табл. 1). В иммуноблоттинге (после электрофореза в 12,5% ПААГ в присутствии 10 SDS) с рекомбинантным HBsAg серотипа adw, все МКА панели окрашивали полипептид, с мол. массой 24-26 кДа (Рис. 2), что совпадает с мол. массой рекомбинантного HBsAg и соответствует мол. массе S-белка нативного HBsAg (данные не приводятся). Таблица 1. Подбор пар моноклональных антител, образующих сэндвич с HBs-антигеном в твердофазном иммуноферментном методе Иммобилизованные антитела Детектирующие Антитела D5B4 D9B1 D13A6 F4F3 F9F2 18С8 D5B4 (IgG1) - + - + - - D9B1 (IgG2b) + - + + + - D13A6 (IgG1) - - - - - - F4F3 (IgG1) + + + - - + F9F2 (IgG2a) - + - - - + 18С8 (IgG1) - - - - - - Иммунные планшеты насыщали указанными антителами и инкубировали с HBsAg в присутствие антител, меченных пероксидазой хрена (детектирующих антител). Подбор пар моноклональных антител, образующих сэндвич с HBsAg Для подбора пар антител, образующих сэндвич с HBsAg, антитела каждого из клонов панели тестировались как иммобилизованные (антитела сорбировали при рН 7,5) и как детектирующие (конъюгированные с пероксидазой хрена). Важно отметить, что для всех пар тестируемых МКА концентрация иммобилизованных антител и концентрация детектирующих антител в инкубационной смеси были одинаковы. В качестве параметра, который характеризует эффективность тестируемой пары МКА, мы использовали коэффициенты калибровочных кривых (тангенс угла наклона линейного участка калибровочной кривой к оси концентраций в координатах: концентрация HBsAg/поглощение, Рис. 2). Коэффициент кривой прямо характеризует аналитическую чувствительность 11 метода (изменение регистрируемого сигнала на единицу изменения концентрации антигена). (1) F9B2 - D9B1 18C8 - F4F3 D5B4 - D5B4 F9B2 - F4F3 Поглощение 1,6 (2) y = 1,05x y = 0,59x 1,2 0,8 (3) 0,4 y = 0,22x (4) y = 0,08x 0 0 1 2 3 HBsAg, нг/мл Рис. 2. Калибровочные кривые в сэндвич-методе тестирования HВsантигена с различными парами иммобилизованных и детектирующих антител панели гибридом. кривая (1): пара F9B2 (иммобилизованные) – D9B1 (детектирующие); кривая (2): пара 18С8 (иммобилизованные) – F4F3 (детектирующие); кривая (3): пара D5B4 (иммобилизованные) – D5B4 (детектирующие); кривая (4): пара F9B2 (иммобилизованные) – F4F3 (детектирующие). Условия см. "Методы исследований". Чем выше коэффициент калибровочной кривой, тем более подходит данная пара иммобилизованных и меченых антител для конструирования эффективного сэндвич-метода. На Рис. 2 приведены итоги тестирования для нескольких пар антител нашей панели2. Можно видеть, что некоторые пары антител, например, пара [F9B2, иммобилизованные МКА, – D9B1, детектирующие МКА] дает эффективную калибровочную кривую (Рис. 2, Коэффициенты кривых от опыта к опыту могли несколько варьировать, однако в серии экспериментов без труда выявлялась "лидирующая" пара. 2 12 кривая 1, к=1,04). Сходные результаты получены с парой антител [18С8 , иммобилизованные МКА – F4F3, детектирующие МКА] (Рис. 2, кривая 2, к=0,59). Вместе с тем, пара антител [F9B2, иммобилизованные МКА, – F4F3, детектирующие МКА] практически не дает калибровочной кривой (Рис. 2, кривая 4, к=0,08). Кроме того, мы проанализировали эффективность "односайтных" сэндвич-методов, в которых МКА одного клона использовались в качестве иммобилизованных и детектирующих. Поскольку HBsAg представляет собой белковый агрегат [Block et al., 2007], можно было ожидать, что некоторые пары МКА будут образовывать сэндвич с HBsAg в таких условиях. Оказалось, что система, использующая МКА D5B4 в качестве иммобилизованных и детектирующих, позволяет получать удовлетворительную калибровочную кривую (Рис. 2, кривая 3, к=0,22). Однако остальные МКА давали значительно худшие кривые в "односайтных сэндвичах": коэффициенты кривых были меньше 0,22 (данные не приводятся). Сводные результаты по подбору пар МКА, образующих сэндвич с HВsAg, приведены в Табл. 1. Пары антител, дающие результативную калибровочную кривую, обозначены знаком (+). К ним отнесли пары МКА, дающие кривые связывания с коэффициентом выше порогового уровня 0,22 (характерного использующей для калибровочной МКА D5B4). кривой Из всех в "односайтной" возможных системе, сочетаний иммобилизованных и меченых антител нашей панели (таких сочетаний 36) только двенадцать пар давали удовлетворительную калибровочную кривую. Эти пары антител были отобраны для дальнейшей работы. Влияние рН адсорбции антител на параметры сэндвич-метода Известно, что в случае некоторых антител увеличение рН адсорбции на твердую фазу (до 9,5) может приводить к увеличению аналитической чувствительности анализа [Sponholtz, 1995]. Для всех пар МКА нашей панели, дающих эффективный сэндвич (k>0,6), было проанализировано, каким образом рН адсорбции антител влияет на результативность метода. 13 Строили калибровочные кривые, в которых МКА сорбировали при значениях рН равных 2,8; 7,5 и 9,5. Сводные данные по изменению коэффициентов калибровочных кривых в зависимости от рН адсорбции приведены на Рис. 3 (коэффициенты калибровочной кривой для рН сорбции 7,5 принят за 100%). 300 рН 2.8 250 рН 7.5 Коэффициент кривой (%) рН 9.5 200 150 100 50 0 18С8 1 18С8 18С8 F4F3 Иммобилизованные антитела F4F3 D5B4 D5B4 D9B1 D9B1 D9B1 D13A6 F9B2 F4F3 D9B1 Детектирующие антитела F9B2 F4F3 D9B1 D5B4 F4F3 D9B1 D5B4 F9B2 F4F3 Рис. 3. Влияние рН сорбции иммобилизуемых антител на коэффициент калибровочной кривой с различными парами иммобилизованных и детектирующих антител. Коэффициент кривой при рН 7,5 принят за 100%. При увеличении рН адсорбции МКА с 7,5 до 9,5 не удалось зарегистрировать существенных изменений коэффициентов калибровочных кривых. Следует отметить, что при иммобилизации МКА при нейтральных и щелочных рН ни одна пара антител (иммобилизованных и детектирующих) не давала лучшей калибровочной кривой, чем [F9B2, иммобилизованные МКА, - D9B1, детектирующие МКА] (Рис. 2, кривая 1). Вместе с тем, при уменьшении рН адсорбции с 7,5 до 2,8 наблюдались значительные изменения 14 аналитической чувствительности метода. Некоторые МКА (D9B1 и F9B2) после иммобилизации при кислых рН практически полностью инактивировались. В других случаях, после адсорбции МКА в кислых условиях коэффициенты калибровочных кривых уменьшались в 2-3 раза (см. данные для иммобилизованных МКА F4F3 и D5B4 на Рис. 3). Наибольший интерес представляет феномен повышения аналитической чувствительности сэндвич-метода в случае иммобилизации МКА 18С8 при рН 2,8 коэффициенты кривых увеличиваются в 1,8 – 2, 2 раза (см. пары [18С8, иммобилизованные МКА, – F9B2, детектирующие МКА] и [18C8, иммобилизованные МКА, – F4F3, детектирующие МКА] на Рис. 3). Следует также обратить внимание, что при адсорбции антител при рН 7,5 самой эффективной конфигурацией была пара [F9B2, иммобилизованные МКА. - D9B1, детектирующие МКА]. Коэффициент калибровочной кривой (к) в этом случае был 1,04 (Рис. 2, кривая 1). Однако уменьшение рН адсорбции МКА до 2,8 делало не менее эффективной пару [18С8, иммобилизованные МКА, - F4F3, меченые МКА]. Коэффициент калибровочной кривой (к) для указанной системы составлял 1,11 (Рис. 4, кривая 1, сравнить с кривой 2). Из теории сэндвич-метода следует, что чем выше концентрация активных антигенсвязывающих сайтов на поверхности твердой фазы, тем больше сдвинуто равновесие в сторону образования иммунного комплекса [иммобилизованные антитела - антиген - детектирующие антитела] и тем выше чувствительность анализа [Portsmann and Kiessig, 1992]. С другой стороны, известно, что при пассивной адсорбции на твердую фазу от 90 до 99% МКА утрачивают антигенсвязывающую активность [Butler, 2004]. Таким образом, феномен увеличения чувствительности метода после адсорбции МКА 18С8 при кислых рН может быть обусловлен концентрации активных антигенсвязывающих увеличением сайтов на поверхности планшетов. Можно предположить два различных механизма достижения указанного эффекта. Во-первых, возможно, при кислых рН к твердой фазе 15 прикрепляется гораздо больше МКА 18С8, чем при нейтральных или щелочных рН, причем кислые условия не приводят к снижению активности данных антител. (1) (2) 1,2 Поглощение 0,9 y = 1,11x y = 0,92x y = 0,63x (3) y = 0,43x (4) 0,6 18С8(рН 2,8) - F4F3 0,3 F9B2(pH 7,5) - D9B1 18C8(pH 7,5) - F4F3 F9B2(pH 2,8) - D9B1 0 0 0,5 1 1,5 HBsAg, нг/мл Рис. 4. Калибровочные кривые в сэндвич-методе тестирования HBsAg при различных рН сорбции иммобилизуемых антител. кривая (1): пара 18С8 (иммобилизованные при рН 2,8) – F4F3 (детектирующие); кривая (2): пара F9B2 (иммобилизованные при рН 7,5) – D9B1 (детектирующие); кривая (3): пара 18С8 (иммобилизованные при рН 7,5) – F4F3 (детектирующие); кривая (4): пара F9B2 (иммобилизованные при рН 2,8) – D9B1 (детектирующие); Второе предположение состоит в том, что при адсорбции в кислых условиях к твердой фазе прикрепляется столько же (или даже меньше) молекул МКА 18С8 (по сравнению с нейтральным и щелочным рН), однако низкие значения рН адсорбции способствуют лучшему сохранению биологической активности указанных антител. Для выяснения причин наблюдаемого эффекта, мы проанализировали, во-первых, каким образом рН адсорбции влияет на количество МКА 18С8 на твердой фазе, и, во-вторых, в какой мере МКА 18С8 сохраняют 16 биологическую активность после их адсорбции при кислых рН. Для определения относительного количества антител, которые прикрепляются к твердой фазе при различных рН, биотинилированные МКА 18С8 адсорбировали при двух значениях рН: 7,5 и 2,8. В качестве параметра, который характеризует относительное количество МКА, связавшихся с твердой фазой, мы использовали коэффициенты кривых связывания стрептавидин-пероксидазы с иммобилизованными биотинилированными МКА. Этот параметр прямо коррелирует с количеством МКА, иммобилизованных на твердой фазе. Из данных, представленных на Рис. 5 а, следует, что кривые связывания стрептавидин-пероксидазы с биотинилированными МКА 18С8, адсорбированными при рН 2,8 и рН 7,5, практически совпадают. 0,8 1 y = 0,05x Поглощение сорбция при рН 7,5 сорбция при рН 2,8 0,8 0,6 y = 0,0802x y = 0,03x 0,6 y = 0,0781x 0,4 0,4 0,2 0,2 сорбция при рН 2,8 сорбция при рН 7,5 0 0 0 0 3 6 9 Стрептавидин - пероксидаза, нг/мл 10 20 HBsAg - пероксидаза, нг/мл а б Рис. 5. Свойства антител клона 18С8 иммобилизованных на поверхность иммунных планшетов при нейтральных и кислых рН. а – связывание стрептавидин-пероксидазы с биотинилированными антителами, иммобилизованными при рН 7,5 и при рН 2,8; б – связывание HBs-антигена, меченого пероксидазой хрена, с антителами, иммобилизованными при рН 7,5 и при рН 2,8. 17 Можно заключить, что при нейтральных и кислых рН на поверхность иммунных планшетов иммобилизуется одинаковое количество молекул антител. В следующем эксперименте мы оценивали относительное количество активных антигенсвязывающих сайтов при адсорбции МКА 18С8 при нейтральных и кислых рН. Для этого анализировали связывание HВsAg, меченого пероксидазой хрена, с МКА 18С8, иммобилизованными при упомянутых рН. Данные, представленные на Рис. 5 б свидетельствуют, что коэффициент кривой связывания меченого антигена с МКА 18С8, иммобилизованными при рН 2,8 (к=5,3×10-2, сплошная линия), в два раза больше коэффициента кривой связывания с МКА, адсорбированными при рН 7,5 (к=2,610-2, пунктирная линия). Следовательно, с МКА, адсорбированными при рН 2,8, связывается в два раза больше меченого HBsAg, чем с антителами, иммобилизованными при рН 7,5. Таким образом, улучшение параметров сэндвич-метода после адсорбции МКА 18С8 при кислых рН сопряжено с лучшим сохранением их биологической активности, хотя к твердой фазе при нейтральных и кислых рН прикрепляется одинаковое количество антител. Оптимизация концентрации иммобилизованных антител и времени инкубации В следующей серии экспериментов мы оптимизировали концентрацию МКА 18С8 при их иммобилизации на твердую фазу при рН 2,8, а также время инкубации в сэндвич-методе. Для определения оптимальной концентрации МКА при иммобилизации на твердую фазу антитела сорбировали на поверхность иммунных планшетов в концентрациях 1, 3, 4 и 6 мкг/мл в течение ночи при комнатной температуре и, после иммобилизации строили калибровочные кривые с детектирующими 18 МКА F4F3, мечеными пероксидазой хрена. Данные, представленные на Рис. 6 а, свидетельствуют, что увеличение концентрации сорбируемых антител с 1 до 3 мкг/мл приводит к существенному улучшению параметров калибровочной кривой: коэффициент кривой возрастает с 0,35 до 1,29 (см. Рис. 6 ,а, сравнить кривые 1 и 4). (1) (2) (1) 1,8 Поглощение 3 мкг/мл 6 мкг/мл 4 мкг/мл 1 мкг/мл 1,2 1 90 минут 75 минут 60 минут 30 минут (2) (3) 0,8 y = 0,93x y = 0,82x (3) 0,6 y = 1,29x y = 1,14x y = 1,05x 0,6 y = 0,52x 0,4 (4) (4) 0,2 y = 0,25x y = 0,35x 0 0 0 0,5 1 0 0,5 1 HBsAg, нг/мл HbsAg, нг/мл а б Рис. 6. Оптимизация концентрации сорбируемых антител (а) и времени инкубации (б) в сэндвич-методе тестирования HBsAg c парой антител [18С8 , иммобилизованные МКА, - F4F3, детектирующие МКА]. а) МКА 18С8 сорбировали на иммунные планшеты при рН 2,8 в концентрациях 1, 3, 4 и 6 мкг/мл. б) калибровочные кривые при различных временах инкубации (температура 420, покачивание на шейкере). Дальнейшее увеличение концентрации сорбируемых антител до 4 и 6 мкг/мл не приводит к улучшению параметров калибровочной кривой: коэффициенты 19 кривых (1), (2) и (3) весьма близки (варьируют от 1,29 до 1,05). Таким образом, концентрация 3 мкг/мл, при которой достигается лучший результат, является оптимальной для сорбции МКА 18С8 при рН 2,8. Оптимизацию времени инкубации в сэндвич-методе при 42о иллюстрирует Рис. 6 б. Увеличение времени инкубации с 30 до 75 минут приводит к увеличению коэффициента калибровочной кривой с 0,25 до 0,82 (см. кривые 4 и 2). Дальнейшее увеличение времени инкубации до 90 минут не влияет существенным образом на параметры калибровочной кривой (коэффициент кривой возрастает всего на 13% - с 0,82 до 0,92) (см. кривые 2 и 1 на Рис. 6, б). Таким образом, оптимальное время инкубации равно 75 - 90 минутам. Отметим, здесь приведены кривые, полученные при покачивании иммунных планшетов на шейкере. Если планшеты инкубировать без покачивания, то оптимальное время инкубации увеличивается с 75 до 120 минут (данные не приводятся). Доказательства иммунологической тождественности рекомбинантных HBsAg и иммунореактивного HBsAg из сыворотки крови больных, инфицированных вирусом гепатита В В следующем эксперименте оценивали иммунологическую тождественность трех препаратов очищенных HВsAg (антиген, выделенный из крови, и рекомбинантные антигены субтипов adw и ayw). Очищенные рекомбинантные белки HBsAg и антиген, очищенный из крови, использовали для приготовления стандартов при построении калибровочных кривых. В качестве неизвестного образца использовали смесь сывороток больных, инфицированных вирусом гепатита В, стандартам) сывороткой, свободной от которую разводили (кратно HBsAg. Полученные данные представлены на Рис. 7. Можно видеть, что коэффициенты всех четырех кривых очень близки: варьируют от 0,8 для рекомбинантного антигена субтипа adw до 1,07 для антигена, очищенного из крови (отклонение от среднего не превышает 15%), что является весьма удовлетворительным 20 результатом для экспериментов подобного рода. В своей совокупности, эти данные свидетельствует, что в сконструированном нами сэндвич-методе препараты HBs-антигенов серотипов adw и ayw, антиген, выделенный из крови и образец смеси сывороток больных, инфицированных вирусом гепатита В, воспринимаются как идентичные субстанции. Таким образом, сконструированный нами сэндвич-метод одинаково хорошо определяют HBsAg серотипов adw и ayw в сыворотках больных, инфицированных вирусом гепатита В. Кроме того, каждый из упомянутых очищенных препаратов можно использовать для приготовления стандартов при построении калибровочных кривых. 1,2 Поглощение очищенный из крови серотип ayw 0,9 инфекционная сыворотка серотип adw 0,6 y = 1,07x y = 0,95x 0,3 y = 0,89x y = 0,79x 0 0 0,3 0,6 0,9 1,2 HBsAg, нг/мл Рис. 7. Калибровочные кривые в сэндвич-методе тестирования HBsAg c различными препаратами HВsAg □—□ HBsAg очищенный из крови; ■—■ очищенный рекомбинантный HBsAg серотипа ayw; ∆—∆ смесь сывороток больных гепатитом В; ▲—▲ очищенный рекомбинантный HBsAg серотипа adw. 21 Минимальная достоверно определяемая концентрация HBsAg Для сэндвич-метода с использованием пары антител [18С8, иммобилизованные МКА, - F4F3, меченые МКА], определяли минимальную достоверно определяемую концентрацию антигена. Эту величину вычисляли для двух условий сорбции МКА 18С8 (при рН 7,5 и при рН 2,8), используя три независимо полученных препарата меченых антител (конъюгатов МКА F4F3 с пероксидазой, всего три препарата). В качестве стандарта использовали отраслевой стандарт НПО "Диагностические системы". Минимальная достоверно определяемая концентрация для n=5 (превышение поглощения при тестируемой концентрации над поглощением, даваемым нулевым стандартом 3 среднеквадратичных отклонения) при рН 7,5 сорбции для трех препаратов конъюгата составляла: 0,1, 0,17 и 0,11 нМЕ/мл. Для рН сорбции 2,8 этот параметр (для тех же препаратов конъюгата) равнялся 0,014, 0,017 и 0,013 МЕ/мл. Таким образом, очень простой методический прием – адсорбция антител при рН 2,8, позволил увеличить минимальную достоверно определяемую концентрацию антигена практически на порядок. Определение концентрации HBsAg в образцах сывороток больных, инфицированных вирусом гепатита В В следующих экспериментах оценивалось, насколько эффективно сконструированный нами сэндвич-метод позволяет определять HBsAg в образцах сывороток крови больных, инфицированных вирусом гепатита В. Было проанализировано 212 образцов сывороток, заведомо содержащих HВsAg. Во всех образах наличие HBsAg было подтверждено сконструированным нами сэндвич-методом (данные не приводятся). HBsAg анализировался также в панели образцов, которая содержала различные субтипы антигена. Панель (МБС, г. Новосибирск) включала 18 образцов, два из которых не содержали HBsAg (отрицательные образцы) и 16 образцов содержали HBsAg различных субтипов (концентрация HBsAg в образцах панели дается производителем). Результаты анализа приводятся в Табл. 2. Можно видеть, что наличие (или отсутствие в отрицательных 22 образцах) HBsAg, заявляемое производителем, было полностью подтверждено результатами нашего анализа. В большинстве образцов (например, в № 1, 5, 6 и 12) наблюдалось хорошее соответствие между концентрацией, указанной производителем, и концентрацией, которая определялась нами. - Вместе с тем, в некоторых образцах панели (№ 4, 9, 10 и 16) уровень антигена, определяемый нами, существенно отличался от указанного производителем. В целом, можно заключить, что сконструированный нами сэндвич-метод позволил весьма эффективно определить HBsAg (или констатировать его отсутствие) в образцах сертифицированной панели, включавшей HBsAg следующих субтипов: аyw2, аyw3varB, аyw3varА, и аdr. Таблица 2. Определение в HBsAg сертифицированных сывороток* № сыворотки панели Субтип HВsAg Концентрация, декларируемая производителем, нг/мл Определяемая концентрация (среднее, n=2) 1 аyw2 <0,1 0,03 2 аyw2 0,1-0,15 0,05 3 аyw2 0,2-0,3 0,12 4 аyw2 <0,1 0,89 5 аyw2 0,1-0,2 0,12 6 аyw2 0,2-0,5 0,44 7 Отр 0 0 8 аyw3varB <0,1 0,03 9 аyw3varB 0,15-0,25 0,06 10 аyw3varB 0,5 0,14 11 Отр 0 0 12 аyw3varА <0,1 0,03 23 образцах 13 аyw3varА 0,1-0,2 0,08 14 аyw3varА 0,25-0,35 0,18 15 Отр 0 0 16 аdr 0,1-0,15 0,03 17 аdr 0,2-0,3 0,18 18 аdr 0,3-0,5 0,21 * Использовали панель сывороток крови, содержащих и не содержащих HBsAg, производства МБС, г. Новосибирск. ВЫВОДЫ 1. Получена панель гибридомных клеточных линий – продуцентов высокоаффинных моноклональных антител (МКА) к поверхностному антигену вируса гепатита В (HBsAg). 2. Подобрана пара иммобилизуемых и детектирующих моноклональных антител (МКА 18С8 и F4F3, соответственно), использование которых при конструировании нового варианта сэндвич-метода определения HBsAg позволяет достичь высокой чувствительности анализа. 3. Показано, что при рН 2,8, рН 7,5 и рН 9,5 на поверхность полистироловых планшетов сорбируется одинаковое количество МКА 18С8, но адсорбция при рН 2,8 приводит к двукратному увеличению их антигенсвязывающей активности (в сравнении с адсорбцией при рН 7,5) и позволяет в 7-10 раз уменьшить минимальную достоверно определяемую концентрацию HBsAg, доведя её до 0,013 – 0,017 нг/мл. 4. В сконструированном сэндвич-методе белки HBsAg, выделенного из крови, рекомбинантные белки HBsAg субтипов adw и ayw и HBsAg смеси сывороток больных гепатитом В воспринимаются как идентичные субстанции. 5. Анализ панели сертифицированных сывороток больных гепатитом В с использованием сконструированного варианта сэндвич-метода позволяет определять HBsAg серотипов аyw2, аyw3varА, аyw3varB, аdr и аdw. 24 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Яковлева Д.А. Сэндвич-метод тестирования HBsAg вируса гепатита В и пути увеличения его чувствительности /Яковлева Д.А., Дмитриев А.Д., Шарипова И.Н., Лавров В.Ф. // В сборнике: "Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных заболеваний" (выпуск 9). – Москва. - 2009.Стр. 360-366. 2. Яковлева иммобилизованных Д.А. Использование моноклональных антител рН-чувствительных для оптимизации иммуноферментного сэндвич-метода определения поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) / Яковлева Д.А., Дмитриев А.Д., Дмитриев Д.А., Массино Ю.С., Павлова Е.В., Пыренкова И.Ю., Смирнова М.Б., Сегал О.Л., Тараканова Ю.Н., Уланова Т.И., Фартушная О.Н., Шарипова И.Н., Коляскина Г.И., Лавров В.Ф. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. – 2010. - № 2. - Стр. 85-89. 3. Яковлева иммобилизованных Д.А. Использование моноклональных антител рН-чувствительных для оптимизации иммуноферментного сэндвич-метода определения поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) / Яковлева Д.А., Дмитриев А.Д., В.Ф. Лавров В.Ф. // Тезисы докладов международной конференции "Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями". - Спб., 2010.- С. 4. Фартушная О.В. Влияние рН сорбции антител на их антигенсвязывающую активность / Фартушная О.В., Тараканова Ю.Н., Яковлева Д.А., Дмитриев А.Д., Лавров В.Ф. // Сборник "Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных заболеваний" (выпуск 10). – Москва. – 2011. - Стр. 531-533. 5. Яковлева Д.А. Повышение биологической активности иммобилизованных антител в иммуноферментных сэндвич-методах путем адсорбции при низких значениях рН / Яковлева Д.А., Тараканова Ю.Н., 25 Дмитриев А.Д., Массино Ю.С., Смирнова М.Б., Сегал О.Л., Фартушная О.В., Коляскина Г.И., Лавров В.Ф., Дмитриев Д.А. // Журнал «Эпидемиология и вакцинопрофилактика» (выпуск 6). – Москва. – 2011. – Стр. 84-89. 26
