На правах рукописи ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ И МАРКЕРЫ АПОПТОЗА ПРИ

На правах рукописи
Эрдни-Горяева Наталья Эдуардовна
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ
НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ И МАРКЕРЫ АПОПТОЗА ПРИ
САХАРНОМ ДИАБЕТЕ I ТИПА У ДЕТЕЙ
14.01.08– педиатрия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Ставрополь – 2013
1
Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего профессионального образования «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения
Российской Федерации
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор
Барычева Людмила Юрьевна
Официальные оппоненты:
Федько Наталья Александровна доктор медицинских наук, профессор,
государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ставропольский государственный медицинский
университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой поликлинической педиатрии
Биленко Николай Петрович доктор медицинских наук, профессор,
государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор
кафедры факультетской педиатрии
Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего профессионального образования «СевероОсетинская государственная медицинская академия» Министерства
здравоохранения Российской Федерации
Защита состоится «25 ноября» 2013 г. в 11.30 часов на заседании диссертационного совета Д 208.098.01 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (355017, г. Ставрополь, ул. Мира, 310).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского
государственного медицинского университета.
Автореферат разослан «24» октября 2013 г.
Ученый секретарь
диссертационного
совета, д.м.н.
Калмыкова Ангелина Станиславовна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Сахарный диабет в XXI веке развивается по самым неутешительным прогнозам. Быстрый рост заболеваемости, серьезные осложнения, высокая инвалидность и смертность определяют его
острейшую медико-социальную значимость (Дедов И.И., 2006, Rickhem P.L.,
2002).
Прогноз заболевания у детей определяется, преимущественно, развитием хронических диабетических осложнений, приводящих к ранней инвалидизации, сокращению ожидаемой продолжительности жизни больных, снижению ее качества (Шадричев Ф.Е., 2008, Дедов И.И., 2008, Болотова Н.В.,
Компаниец О.В., 2010).
По современным представлениям сахарный диабет I типа является результатом клеточно-опосредованной деструкции β-клеток поджелудочной
железы, приводящей к абсолютной инсулиновой недостаточности (Никонова
Т.В., 2012, Тюкавкина С.Ю., 2013, Ocana M.G., 2008).
Ведущими звеньями в патогенезе аутоиммунных поражений являются
дисрегуляция иммунитета и программированной гибели клеток (Маянский
А.Н., 2002, 2005). Основными в развитии сахарного диабета становятся
нарушения процессов инициации и реализации апоптоза (Пекарева Е.В.,
2009, 2010, Rutter G.A., 2008).
Важную роль в развитии сахарного диабета играют полиморфноядерные лейкоциты (Aburawi E. et. al., 2004, Nurun A.H.M., 2005, Adeghate E.,
Schattner P., Dunn E., 2006, Awadhesh K.A., 2013).
Установлено участие нейтрофилов в разрушении β-клеток поджелудочной железы, патогенезе микроваскулярных и нефротических повреждений (Ahmed I., Goldstein B., 2006), формировании инсулино-резистентности
(Alba-Loureiro T.C. et. al., 2006).
У больных сахарным диабетом выявляются дефектный хемотаксис,
низкая бактерицидная активность нейтрофильных гранулоцитов, аномальная
продукция супероксида, лейкотриенов, секреция лизосомальных ферментов,
а также изменение базального уровня внутриклеточного кальция (Altannavch
T.S., 2004, Alba-Loureiro T.C. et. al., 2006, 2007, Awadhesh, K.A., 2011).
Нейтрофилы являются основными клетками врожденного иммунитета
и выполняют главенствующую роль в антибактериальной защите. Нарушение их функциональной компетенции становится основой низкой резистентности пациента с СДI, его подверженности инфекционным заболеваниям
(Aburawi E. et. al., 2004, Adeghate E., Schattner P., Dunn E., 2006, Alves C.,
Oliveira A.C., Brites C., 2008, Awadhesh K.A. et. al., 2013).
Несмотря на очевидную значимость проблемы роль апоптоза лейкоцитарных клеток при сахарном диабете I типа у детей окончательно не установлена. Дискутируется участие нейтрофильных гранулоцитов в возникновении
и развитии заболевания.
В течение 10 лет на территории Ставропольского края не проводились
исследования, посвященные распространенности сахарного диабета у детей,
3
характеристике его клинического течения с оценкой структуры и сроков развития осложнений.
Цель исследования. Выявление особенностей клинического течения,
патогенетической роли апоптоза иммунокомпетентных клеток и функциональных нарушений нейтрофильных гранулоцитов при сахарном диабете I
типа у детей
Задачи исследования:
1.Выявить распространенность сахарного диабета I типа у детей в
Ставропольском крае.
2. Оценить клинические особенности и сроки развития осложнений при
сахарном диабете I типа у детей в зависимости от возраста и стажа заболевания.
2.Определить экспрессию маркеров апоптоза CD95, CD95L, Bсl2 на
лимфоцитах и нейтрофильных гранулоцитах периферической крови при сахарном диабете I типа у детей.
3.Оценить функциональную активность полиморфноядерных лейкоцитов при сахарном диабете I типа у детей с оценкой показателей фагоцитоза,
миелопероксидазы, лизосомальных катионных белков, активных радикалов
кислорода.
4.Провести сравнительную характеристику клинических и иммунологических показателей в зависимости от возраста и длительности заболевания.
Научная новизна исследования. Впервые представлены данные о распространенности сахарного диабета I типа у детей Ставропольского края.
Впервые показаны клинические особенности, характер и сроки развития
осложнений в зависимости от возраста и длительности заболевания.
Впервые исследован апоптоз лимфоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов у детей с сахарным диабетом в зависимости от возраста и стажа заболевания.
Впервые установлено, что у детей, страдающих сахарным диабетом I
типа, отмечается снижение готовности к апоптозу лимфоцитов периферической крови, повышение – нейтрофильных гранулоцитов, что сопровождается
изменением экспрессии CD95 и Bсl2 и зависит от стажа заболевания.
Впервые показано увеличение экспрессии CD95L на лимфоцитах и полиморфноядерных лейкоцитах при СДI у детей, что может способствовать
усилению процессов запрограммированной клеточной гибели в островковых
β-клетках поджелудочной железы, инфильтрированных иммунокомпетентными клетками.
Впервые изучено функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов у детей дошкольного и школьного возраста в зависимости от длительности сахарного диабета I типа. Установлено снижение бактерицидной активности нейтрофилов с дефицитом поглощения, секреции активных радикалов кислорода, функционального резерва. Выявлено, что степень функциональной недостаточности зависит от длительности заболевания и увеличивается у детей со стажем СДI более 3-х лет.
4
Впервые установлены признаки метаболической активации полиморфноядерных лейкоцитов при СДI в виде повышения уровней миелопероксидазы и лизосомальных катионных белков.
Практическая значимость. На основании полученных результатов
определена важная патогенетическая роль процессов апоптоза лимфоцитов и
нейтрофильных гранулоцитов периферической крови в развитии сахарного
диабета I типа у детей, изучено функциональное состояние нейтрофильных
гранулоцитов и их цитотоксический потенциал в зависимости от возраста и
стажа заболевания.
Полученные данные представляют основу возможных подходов к прогнозированию заболевания и могут применяться в качестве прогностических
критериев развития инфекционных и неинфекционных осложнений при СДI
у детей.
Личный вклад автора в исследование. Диссертантом определены основные положения и дизайн научного исследования, проведен анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации, анализ
первичной документации МБУЗ г. Ставрополя «ГДКБ им. Г.К. Филиппского», где проходили лечение и диспансерное наблюдение дети с сахарным
диабетом. Автор самостоятельно осуществлял клиническое наблюдение, обследование и лечение детей, госпитализированных в гастроэнтерологическое
отделение с эндокринологическим постом МБУЗ г. Ставрополя «ГДКБ им.
Г.К. Филиппского». Диссертантом осуществлен анализ и интерпретация клинических, эпидемиологических и иммунологических данных, их математическая обработка, сформулированы выводы и практические рекомендации.
Внедрение результатов работы. Результаты исследования внедрены в
учебный процесс и практическую работу кафедр поликлинической педиатрии
и эндокринологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, в лечебную практику гастроэнтерологического отделения с эндокринологическим постом МБУЗ г. Ставрополя «ГДКБ им. Г.К. Филиппского».
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1.Показатели распространенности сахарного диабета I типа среди детей
и подростков в Ставропольском крае с 2008 по 2012 гг. составляют 55,4564,70 на 100 тыс. детского населения и сопоставимы со средними показателями в Северо-Кавказском федеральном округе и России в целом.
2.Диабетические осложнения диагностируются у 35% дошкольников и
52% школьников, зависят от возраста и стажа СДI и развиваются в относительно короткие сроки от начала заболевания.
3.У детей, страдающих сахарным диабетом I типа, отмечается снижение готовности к апоптозу лимфоцитов периферической крови, повышение –
нейтрофильных гранулоцитов, что сопровождается изменением экспрессии
CD95 и Bсl2 и зависит от стажа заболевания.
5
4.Нейтрофильные гранулоциты при сахарном диабете у детей характеризуются низкой функциональной активностью с дефицитом фагоцитоза, активных радикалов кислорода, функционального резерва.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано
10 научных работ, из них 3 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XX итоговой научной конференции студентов и молодых ученых с международным
участием (Ставрополь, 2012), на краевой научно-практической конференции
педиатров и неонатологов «Актуальные вопросы педиатрии и неонатологии»
(Ставрополь, 2012), XI конгрессе детских инфекционистов «Педиатрия и инфекции» (Москва, 2012), XVII cъезде педиатров России с международным
участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2013).
Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедр
детские инфекционные болезни, пропедевтика детских болезней, поликлиническая педиатрия Ставропольского государственного медицинского университета.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, трех глав собственных исследований, обсуждения материалов, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 110 отечественных и 261 иностранных источников. Работа изложена на
142 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 32 таблицами, 15 рисунками.
Диссертационное исследование выполнено на кафедре детских инфекционных болезней Ставропольского государственного медицинского университета в соответствии с планом научных исследований в рамках федеральной
научной целевой программы. Номер государственной регистрации 01200954364.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. В работе проведен анализ распространенности СДI среди детей и подростков в Ставропольском крае с
2008 по 2012 гг. на основании данных государственного регистра, созданного
в рамках Сент-Винсентской декларации для организации лечебной и профилактической помощи детскому населению с целью создания системы рационального лекарственного обеспечения больных и снабжения их современными средствами самоконтроля, а также систематического учета пациентов.
На 01.01.2013 г. в СК зарегистрировано 329 детей и подростков с СДI,
что составило 64,7 на 100 тыс. детского населения. Данные показатели сопоставимы со средними показателями по Северо-Кавказскому федеральному
округу и России в целом (Ширяева Т.Ю. и др., 2010).
При сравнительном анализе в период с 2008 по 2012 гг. отмечен рост
распространенности СД1 в СК у детей в 1,2 раза.
В работу включены результаты клинико-иммунологического анализа
45 детей с сахарным диабетом I типа в возрасте от 3 до 15 лет, госпитализи6
рованных в гастроэнтерологическое отделение с эндокринологическим постом МБУЗ г. Ставрополя «ГДКБ им. Г.К. Филиппского» в 2012-2013 гг. Обследование детей проводилось по стандартному протоколу, разработанному
ЭНЦ РАМН.
Тяжесть заболевания определялась характером ключевых синдромов и
лабораторных изменений. В качестве критериев субкомпенсированной и
компенсированной форм использовали показатели гликемического профиля,
гликозилированного гемоглобина, наличие протеинурии, глюкозурии или кетонурии. При диагностике хронических осложнений использовались общепринятые критерии (Институт диабета ФГБУ ЭНЦ, «Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом», 2011 г.)
Биохимические методы исследования включали определение тощаковой и постпрандиальной гликемии, гликозилированного гемоглобина, общего
белка, холестерина, ХЛВП, ХЛНП, триглицеридов, билирубина, АСТ, АЛТ,
мочевины, креатинина, электролитов, общего анализа мочи и мочи по Зимницкому.
Из дополнительных методов исследования проводили контроль АД, Rграфию органов грудной полости ЭКГ, консультации окулиста, нефролога,
невропатолога. По показаниям выполнялись эхокардиография, УЗИ паренхиматозных органов, анализ кала на дисбактериоз, бактериологическое исследование носоглоточной слизи.
Оценку состояния здоровья детей проводили на основании клинического обследования в специализированном отделении, анализа амбулаторной
карты ребенка из детской поликлиники с учетом характера сопутствующей
патологии, принимая во внимание результаты диспансерного наблюдения у
педиатра, эндокринолога, кардиолога, дерматолога, ЛОР-врача, иммунолога.
Учитывался анализ акушерского и соматического анамнеза матерей.
Физическое развитие с определением гармоничности оценивали по общепринятой методике. Оценка основных физических параметров (рост, вес,
окружности головы и груди) проводилось с использованием непараметрического (центильного) способа.
В соответствии с возрастной периодизацией и длительностью заболевания были сформированы 3 группы: 3-6 лет – 20 детей, 7-15 лет со стажем
СД1 до 3-х лет – 12 детей, 7-15 лет со стажем СД1 более 3-х лет – 13 детей.
При лечении детей с сахарным диабетом I типа использовали стандартную «базис-болюсную» инсулинотерапию препаратами длительного
действия (гларгин, детемир) и ультракороткого действия (лизпро, аспарт).
Для оценки программируемой клеточной гибели выявляли количество
лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, экспрессирующих маркеры
апоптоза. Лимфоциты выделяли на градиенте плотности Ficoll-Paque,
нейтрофилы – на двойном градиенте плотности Ficoll-Paque и фиколлурографин (GE Healthcare, Швеция). Суспензию клеток трижды отмывали в
среде RPMI-1640 (Вектор-Бест, Россия). В культурах лимфоцитов и нейтрофилов оценивали количество клеток, экспрессирующих CD95, CD95L, Bсl2
7
методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител
(Invitrogen, США).
Фагоцитарный индекс определяли по способности нейтрофильных гранулоцитов поглощать частицы меламиноформальдегидных латексов размером 1,5-2 мкм производства ВНИИ биологического приборостроения (г.
Москва).
Цитоэнзимохимическое исследование полиморфноядерных лейкоцитов
осуществляли у детей всех групп по уровню миелопероксидазы, лизосомальных катионных белков, оксидазной активности.
Уровень кислородзависимой бактерицидности НГ оценивали в НСТтесте по числу фармазанположительных клеток. По результатам индуцированного НСТ-теста судили о функциональном резерве НГ (ИС НСТ =
НСТсп./НСТ индуц.). В качестве стимулятора использовали продигиазан в
концентрации 20 мг/мл.
Содержание лизосомальных катионных белков определяли методом
Шубича М.Г. по интенсивности окраски бромфеноловым синим. Уровень
миелопероксидазы оценивали методом Грэхема-Кнолля (Пигаревский В.Е.,
1989 г.). Для оценки результатов исследования рассчитывали средний цитохимический коэффициент по принципу Астальди.
Для определения показателей апоптоза и функциональной оценки системы полиморфноядерных лейкоцитов исследовали венозную кровь, забор
крови осуществлялся с 8 до 9 часов в первые 7 дней госпитализации ребенка
и был приурочен к проведению диагностических мероприятий.
Определение цитоэнзимохимического статуса нейтрофилов и параметров апоптоза лимфоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови осуществлялись в ФКУЗ «Ставропольский научно- исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора.
Группу сравнения (контрольная группа) составили 30 здоровых детей в
возрасте 3-6 (15) и 7-15 (15) лет, обследованных перед плановой вакцинацией
или при плановом посещении участкового педиатра в день «здорового ребенка».
Все дети контрольной группы родились от здоровых родителей с благоприятным течением беременности у матерей. Дети не имели хронических
соматических заболеваний, болели ОРВИ до 3-4 раз в год.
Для статистического анализа данных использовался пакет программ
«Attestat 10.5.1.», «Primer of Biostat 4,0», Microsoft Office Excel 2007. Для
оценки межгрупповых различий применялся дисперсионный анализ повторных измерений с вычислением критериев Ньюмена-Кейлса, Данна, Дункана.
Анализ качественных признаков выполнялся с использованием критерия χ2.
Количественные значения с нормальным распределением представлены, как
среднее±стандартная ошибка средней (X±sx), признаки, характеризующиеся
ненормальным распределением, – в виде медианы и интерквантильного (25 и
75 процентили) размаха (Me (Q1-Q)). Достоверными будут считаться различия при р<0,05.
8
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Установлено, что средний возраст ребенка в дебюте сахарного диабета
составил 7,0±0,55 лет. В группе дошкольников заболевание дебютировало в
4,1±0,56 лет, в группе школьников – в 8,5±0,66 лет. У 17,8% детей на момент
госпитализации сахарный диабет диагностирован впервые.
Средний стаж СДI на момент исследования составил 3,6±0,68 лет. Продолжительность заболевания в группе дошкольников достигала 1,9±0,61 лет,
в группе школьников – 4,6±0,93 лет.
В обеих возрастных группах отмечено преобладание девочек: 80% в
группе дошкольников и 68% в группе школьников, p<0,05.
В 31,1% случаев дети с СДI рождались от матерей с отягощенным акушерским анамнезом в виде профессиональных вредностей (11,1%), токсикоза
беременности (17,8%), сахарного диабета (8,9%), обострения хронических
заболеваний (8,9%). У 35,6% детей выявлялись пери- и постнатальные факторы риска, такие как недоношенность (11,1%), раннее искусственное
вскармливание (20%), тимомегалия (2,2%), частые респираторные инфекции
(11,1%).
Большая часть родителей пациентов с СДI были хорошо образованы и
имели высшее и среднее специальное образование. Однако 78% детей были
из неполных семей и/или семей, имеющих низкий уровень достатка. В 2,2%
случаев сахарный диабет регистрировался у других детей в семье.
Установлено, что факторами риска, способствующими развитию заболевания, были перенесенные ОРВИ (33,1%), ветряная оспа (4,4%), краснуха
(2,2%), проведенная накануне вакцинация (6,7%), психоэмоциональные
стрессы (31,1%).
Анализ сезонности показал, что у 68,9% детей сахарный диабет манифестировал в осенне-весенний период (р<0,05).
В группе дошкольников на момент госпитализации преобладали жалобы на полиурию (85%), вялость (65%), жажду (75%).
У школьников с длительностью заболевания менее 3-х лет характерными были снижение массы тела (50%), боли в нижних конечностях.
При стаже СДI более 3-х лет дети жаловались на жажду (61,5%) общую
слабость (61,5%), боли в нижних конечностях (61,5%), скованность движений (38,5%), полиурию (46,2%), снижение аппетита (46,2%), сухость кожных
покровов (46,2%).
На момент госпитализации 88,9% детей находилась в стадии субкомпенсации и декомпенсации СДI. Дети дошкольного возраста чаще госпитализировались в стадии субкомпенсации (55%), школьники – в стадии декомпенсации (56%) сахарного диабета.
Средний уровень гликозилированного гемоглобина у детей с СДI составил 10,1±0,44%, в группе дошкольников – 9,5±0,68%, школьников со стажем заболевания менее 3-х лет – 11,3±0,90%, более 3-х лет – 10,0±0,71 %.
В состоянии кетоацидоза госпитализировались 37,8% детей, 30% дошкольников, 41,7% школьников с длительностью заболевания до 3-х лет и
9
46,2% школьников со стажем СДI более 3-х лет. При сборе анамнеза установлено, что 77,8% детей с СДI госпитализируются ежегодно. При этом
33,3% дошкольников и 44,4% школьников не контролируют уровень гликемии ежедневно, более 30% детей нерегулярно консультируется специалистами согласно скринингу. Диабетические осложнения развивались через
2,0±0,27 лет после манифестации заболевания и регистрировались у 23 из 45
детей, что составило 51,1%.
У дошкольников диабетические осложнения диагностировались в 35%
случаев, у школьников со стажем заболевания менее 3-х лет – в 41,7%, более
3-х лет – в 61,5%. Наиболее распространенными в структуре осложнений
были диабетическая полинейропатия (26,7%), липодистрофия (22,2%), диабетическая ангиопатия нижних конечностей (22,2%).
У детей дошкольного возраста преобладали полинейропатия (20%) и
ангиопатия нижних конечностей (20%). У школьников со стажем заболевания менее 3 лет более распространенными были диабетическая полинейропатия (25%) и липодистрофия (25%). У школьников со стажем СДI более 3 лет
лидировали диабетическая полинейропатия (38,5%), липодистрофия (30,8%),
ангиопатия нижних конечностей (30,8%), ретинопатия (30,8%).
Средняя длительность сахарного диабета, предшествующая развитию
ретинопатии составила 1,9±0,91 лет, ангиопатии – 2,0±0,79 лет, полинейропатии – 1,8±0,95 лет, липодистрофии – 1,7±0,69 лет, хайропатии – 2,5±0,94
лет, кардиопатии – 3,0±0,98 лет.
Состояние здоровья детей оценивали по уровню физического развития
с учетом частоты и характера сопутствующих заболеваний.
Установлено, что у большей части детей с сахарным диабетом I типа
уровень физического развития был средним (71,1%). Случаи с низким физическим развитием зарегистрированы в 8,9% случаев, только у детей со стажем СД1 более 3 лет. Высокое физическое развитие имели 20% детей, преимущественно школьники со стажем заболевания менее 3 лет (33,3%).
У детей всех возрастных групп, страдающих СДI, отмечена повышенная чувствительность к инфекционным заболеваниям.
К группе часто и длительно болеющих относились 48,9% пациентов,
20% детей страдали рецидивирующим бронхитом.
Хроническая патология ЛОР – органов сформировалась в 33,3%
наблюдений. Хронический аденоидит чаще диагностировался в группе дошкольников, хронический гайморит – в группе школьников со стажем СДI
более 3-х лет.
Инфекции кожи регистрировались у 22,2% детей, слизистых оболочек
желудочно-кишечного тракта – у 33,3%. При сравнительном анализе кожнослизистый герпес и афтозный стоматит чаще отмечались в группе III.
Инфекции мочевыводящих путей выявлялись в 13,3% случаев и были
представлены хроническим пиелонефритом (4,4%), циститом (8,9%).
Эндемический зоб диагностировался только у дошкольников (4,4%).
10
Патология костно-мышечного аппарата чаще развивалась у школьников со стажем заболевания более 3-х лет.
В соответствие с задачами исследования в работе осуществлена оценка
апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов и определена его роль в развитии патогенеза СДI, проведено изучение бактерицидной активности нейтрофилов периферической крови у детей в зависимости от возраста и стажа заболевания.
При оценке апоптоза лимфоидных клеток нами установлено уменьшение количества лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор (CD95) и готовых к апоптозу у пациентов всех групп по сравнению со здоровыми детьми
(табл.1). Минимальные показатели отмечены у детей 7-15 лет со стажем заболевания более 3-х лет.
Таблица 1
Показатели апоптоза лимфоцитов у детей с СДI
т-15 лет
3-6
лет
Возраст
Клинические груп- CD95, %
пы
СДI (I) (n=20)
17,7(15,9-19,43)* **
CD95L, %
Bсl2, %
7,4(5,81- 8,94)* **
70,2(68,56-71,76) * **
контрольная группа
(n=15)
СДI, стаж заболевания менее 3-х лет
(II) (n=12)
СДI, стаж заболевания более 3-х лет
(III) (n=13)
контрольная группа
(n=15)
28,0(26,08-30,0)
9,2(8,04- 10,25)
65,9(62,82-69,05)
20,5(17,94-23,02) * **
11,6(10,12-13,14)* **
70,3(65,72-74,9) * **
13,9(10,04-17,73) * **
15,6(14,26-16,87)* **
79,5(75,47-83,59) * **
26,5 (24,20-28,84)
8,14 (6,49-9,78)
60,3(56,97-63,66)
*-p<0,05 – по сравнению с контрольной группой, **-p<0,05 – по сравнению с группой III
(критерий Ньюмена – Кейлса, критерий Данна)
Полученные нами данные могут быть косвенным признаком подавления программированной гибели аутореактивных клеток в ткани поджелудочной железы, способствующего пролонгации иммунного ответа.
Ранее было показано, что при сахарном диабете выявляется резистентность лимфоцитов к апоптозу, что, возможно объясняет характер и продолжительность аутоиммунного ответа (Balasingh S. et. al., 2012).
В работе выявлено увеличение уровня экспрессии антиапоптотических
маркеров (Bcl2) на лимфоцитах детей всех групп, более выраженное у
школьников с длительностью заболевания более 3-х лет, что также свидетельствует о нарушении Fas-зависимого апоптоза у детей с сахарным диабетом I типа, приводящим к замедлению процессов клеточной смерти аутореактивных форм лимфоцитов.
Нами установлено увеличение доли лимфоцитов, экспрессирующих
CD95L, у детей всех групп, страдающих сахарным диабетом по сравнению со
здоровыми детьми. Наиболее высокие показатели определялись у детей
школьного возраста со стажем заболевания более 3-х лет.
Известно, что при СДI островки поджелудочной железы инфильтрированы иммунными клетками, продуцирующими широкий спектр цитокинов,
11
что сопровождается аберрантной экспрессией мембранных рецепторов (Пекарева Е.В., 2010). Повышение экспрессии CD95L на лимфоидных клетках,
возможно обусловливает более выраженный апоптотический процесс в βклетках поджелудочной железы и их последующее удаление.
В последние годы показано, что нейтрофильные гранулоциты принимают активное участие в формировании аутоиммунного воспаления. Реакция
нейтрофила, направленная на локализацию и элиминацию аутоантигенов, во
многом зависит от силы и длительности антигенного воздействия, а также
исходного уровня функциональной активности клеток.
Нами установлено, что течение сахарного диабета у детей сопровождается увеличением процента нейтрофилов, экспрессирующих маркеры
апоптоза (CD95) и уменьшением доли клеток, имеющих на своей поверхности антиапоптотические белки – Bcl2 (табл.2).
Таблица 2
Показатели апоптоза нейтрофилов у детей с СДI
7-15 лет
3-6
лет
Возраст клинические группы
CD95, %
CD95L, %
Bсl2, %
СДI (I) (n=20)
75,1(71,49-78,72)* **
9,5 (8,63- 10,32)* **
3,68 (3,46-3,90* **
контрольная группа
(n=15)
СДI, стаж заболева-ния
менее 3-х лет (II) (n=12)
СДI, стаж заболевания
более 3-х лет (III) n=13)
контрольная группа
(n=15)
59,2 (56,31- 62,01)
7,35 (6,58- 8,12)
7,7 (6,68-8,77)
77,6(71,15-83,99) * **
9,5(8,14-10,92)* **
3,99(2,9- 5,08)* **
87,9(84,24-91,63)* **
58,43(54,95- 1,90)
12,1(10,22-13,96)* **
7,3 (6,46-8,09)
2,78(2,36-3,19) * **
5,38(4,21-6,55)
*-p<0,05 – по сравнению с контрольной группой, **-p<0,05 – по сравнению с группой III
(критерий Ньюмена – Кейлса, критерий Данна)
Наиболее выраженная активация апоптоза НГ отмечена в группе
школьников 7-15 лет со стажем заболевания более 3-х лет.
Полученные нами результаты позволяют считать, что у больных СДI
отмечается повышенная предрасположенность ПМЯЛ к апоптозу, что может
быть проявлением защитной реакции, направленной на устранение «излишка» активных нейтрофилов, формирование которого усиливает повреждение
тканей. Увеличение экспрессии CD95L на нейтрофильных гранулоцитах у
больных сахарным диабетом, вероятно, может способствовать элиминации
не только клеток поджелудочной железы, но и собственных лейкоцитарных
клеток. Известно, что структурно-метаболический статус ПМЯЛ неразрывно
связан с выполнением их профессиональных задач и складывается из активации, адгезии, хемотаксиса клеток, поглощения антигена, его киллинга и расщепления.
Нами установлено снижение количества фагоцитирующих клеток у детей 3-6 лет (79,8±1,74, p<0,05) и 7-15 лет со стажем заболевания более 3-х лет
(72,9±2,35, p<0,05) по сравнению со здоровыми детьми.
Известно, что нарушению фагоцитарной и хемотаксической функции
ПМЯЛ при сахарном диабете может способствовать гипергликемия и кето12
немия, под действием которых НГ приобретают сферическую форму и в значительной мере теряют способность образовывать псевдоподии. В результате
снижаются адгезивные и эмиграционные свойства гранулоцитов, затрудняется поглощение, кэпинг (Tong, P.C. et. al., 2004).
При этом нарушения фагоцитоза недостаточно корригируются при
компенсации гипергликемии, что может быть связано с изменением метаболизма липидов и арахидоновой кислоты в ПМЯЛ и дефицитом энергетического обеспечения (Ницца Н.А., 2009). Кроме того, нейтрофилы, образующиеся при инсулиновой недостаточности, имеют многочисленные дефекты
метаболизма. В связи с чувствительностью к инсулину зрелых НГ, восстановление фагоцитарных функций возможно в результате замены пула метаболически дефектных клеток. Поэтому нормализация фагоцитоза запаздывает по отношению к компенсации инсулиновой недостаточности.
Самые низкие показатели фагоцитоза установлены в группе школьников, страдающих сахарным диабетом более 3-х лет, что может быть связано с
длительным течением заболевания и функциональным истощением фагоцитирующих клеток (Kaczmarek M. et. al, 2012).
Показатели лизосомальных катионных белков возрастали у детей независимо от возраста и стажа заболевания (рис. 1).
3
*
* **
2,5
* **
2
1,5
*
*
*
II группа
III группа
МП
ЛКБ
1
0,5
0
СДI
контрольная
группа
дошкольники
контрольная
группа
школьники
* - р<0,05, по сравнению с контрольной группой, **- р<0,05 по сравнению с группой III
(критерий Ньюмена-Кейлса, критерий Данна)
Рис. 1. Показатели миелопероксидазы и катионных белков нейтрофилов у
детей с СДI
Показатели миелопероксидазы увеличивались у детей всех возрастных
групп. Наиболее высокие значения определялись у школьников с длительностью заболевания более 3-х лет, что позволяет сделать вывод о существенном
13
усилении внутриклеточного метаболизма нейтрофильных гранулоцитов с
увеличением длительности течения СДI.
Полученные нами данные о повышении МП и ЛКБ, вероятно, могут
свидетельствовать об увеличении биоагрессивного потенциала нейтрофилов
периферической крови у детей с сахарным диабетом I типа вследствие увеличения продукции HOCl и катионных белков.
Производство активных радикалов кислорода ПМЯЛ в группах дошкольников и школьников было ниже, чем у здоровых детей (рис. 2)
Данные ИС НСТ-теста оказались ниже контрольных значений у детей
дошкольного возраста и у школьников со стажем заболевания более 3-х лет,
что отражает снижение внутриклеточного резерва фагоцитирующих клеток у
детей, страдающих сахарным диабетом.
9
8
7
6
5
4
3
*
*
**
* **
2
НСТ,%
ИС НСТ, усл.ед.
*
*
1
0
СД1
контрольная
группа
дошкольники
II группа
III группа
контрольная
группа
школьники
- р<0,05, по сравнению с контрольной группой, **- р<0,05 по сравнению с группой
III (критерий Ньюмена-Кейлса, критерий Данна)
Рис. 2. Показатели оксидазной активности нейтрофилов у детей с СДI
Уменьшение показателей стимулированного НСТ- теста может быть
связано с нарушением процесса дегрануляции – слияния специфических и
азурофильных гранул ПМЯЛ с их фагосомами. При сахарном диабете в
ПМЯЛ значительно сокращаются запасы гликогена, тормозится его синтез,
снижается активность ключевых ферментов анаэробного окисления глюкозы
и пентозного цикла, что приводит к уменьшению внутриклеточных запасов
АТФ (Meigs, J.B. et. al., 2004, Walrand, S. et. al., 2004).
Самые низкие показатели функционального резерва определялись у
школьников со стажем заболевания более 3-х лет, что вероятно связано с
длительностью заболевания и функциональным истощением нейтрофильных
14
гранулоцитов периферической крови (Walrand, S. et. al., 2004, Kacz-marek, M.
et. al., 2012).
Таким образом, при сахарном диабете I типа у детей отмечается снижение программированной гибели аутореактивных лимфоцитов, что способствует пролонгации иммунного ответа.
Увеличение экспрессии CD95L на лимфоцитах и нейтрофильных гранулоцитах при СДI может приводить к усилению процессов запрограммированной клеточной гибели в островковых β-клетках поджелудочной железы,
инфильтрированных иммунокомпетентными клетками.
При исследовании функции НГ получены данные о дисбалансе функциональной и метаболической активности нейтрофилов при сахарном диабете I типа у детей.
Повышение цитоэнзимохимических показателей – миелопероксидазы и
лизосомальных катионных белков свидетельствует об увеличении цитотоксического потенциала НГ, является фактором аутоантигенного эксцесса и
иммунной активации у детей с сахарным диабетом.
Увеличение апоптотического потенциала нейтрофильных гранулоцитов на фоне функционально-метаболических изменений является отражением
активного вовлечения ПМЯЛ в иммунопатогенез заболевания.
Установлено, что гиперэкспрессия факторов биоцидности НГ в условиях антигенного воспаления сопровождается усилением их апоптоза, что, вероятно, является одним из компенсаторных механизмов, позволяющих
уменьшить повреждение ткани.
Вместе с тем показано снижение бактерицидной активности ПМЯЛ с
дефицитом поглощения, секреции активных радикалов кислорода, функционального резерва.
Известно, что нейтрофильные гранулоциты являются связующим звеном между врожденным и адаптивным иимунитетом и выполняют главенствующую роль в антибактериальной защите. Нарушение их функциональной компетенции становится основой низкой возрастной устойчивости ребенка сахарным диабетом, его подверженности инфекционным заболеваниям.
ВЫВОДЫ
1.Показатели распространенности сахарного диабета I типа среди детей
и подростков в Ставропольском крае с 2008 по 2012 гг. составляют 55,4564,70 на 100 тыс. детского населения и сопоставимы со средними показателями в Северо-Кавказском федеральном округе и России в целом.
2.Диабетические осложнения формируются в относительно короткие
сроки – через 2,0±0,27 лет после начала заболевания и диагностируются у
35% дошкольников, у 41,7% школьников с длительностью СД1 до 3-х лет и у
61,5% школьников со стажем СДI более 3-х лет. Наиболее распространенными в структуре осложнений являются диабетическая полинейропатия
(26,7%), липодистрофия (22,2%), диабетическая ангиопатия (22,2%).
15
3.Сопутствующие заболевания развиваются у 55% дошкольников и
72% школьников с СД1. С увеличением длительности сахарного диабета более распространенными становятся рецидивирующие инфекции слизистых
оболочек – бронхит, кожно-слизистый герпес, хронический пиелонефрит,
стоматит.
4.Признаки антигенной стимуляции полиморфноядерных лейкоцитов
при СДI выявляются в виде активации метаболической активности с повышением уровня миелопероксидазы и лизосомальных катионных белков.
5.У детей, страдающих сахарным диабетом I типа, отмечается снижение готовности к апоптозу лимфоцитов периферической крови, что сопровождается снижением экспрессии CD95, повышением Bсl2.
6. Нейтрофильные гранулоциты при СДI у детей характеризуются высокой готовностью к апоптозу, низкой бактерицидной активностью с дефицитом фагоцитоза, активных радикалов кислорода, функционального резерва.
7. Увеличение экспрессии CD95L на лимфоцитах и нейтрофильных
гранулоцитах при СДI может способствовать усилению процессов запрограммированной клеточной гибели в островковых β-клетках поджелудочной
железы, инфильтрированных иммунокомпетентными клетками.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1.Высокий процент декомпенсированных форм на момент госпитализации свидетельствует о необходимости проведения целенаправленной деятельности по улучшению диагностики и диспансерного наблюдения детей с
СДI, повышения компетентности семей в вопросах ухода за ними.
2.При диспансерном наблюдении детей с сахарным диабетом I типа
следует рекомендовать ежегодное обследование у невролога при длительности СДI более 1,5 лет, у офтальмолога и сосудистого хирурга – при длительности СДI более 2 лет с периодичностью 1 раз в год.
3.Распространеность сопутствующих заболеваний со стороны дыхательных путей обуславливает необходимость вакцинации детей с СДI современными гемофильными, пневмококковыми, противогриппозными вакцинами (АКТ-ХИБ, Хиберикс, Пневмо-23, Превенар, Инфлювак, Агриппал).
4.Высокий риск развития иммунных нарушений определяет целесообразность исследования функции нейтрофильных гранулоцитов и маркеров
апоптоза для оценки тяжести течения СДI, прогнозирования риска развития
бактериальных инфекций, проведения профилактических мероприятий.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ:
1.Барычева Л.Ю., Эрдни-Горяева Н.Э. Маркеры апоптоза иммунокомпетентных клеток при сахарном диабете I типа у детей // Современные проблемы науки и образования. 2013. № 4; URL: http://www.scienceeducation.ru/110-9953 (дата обращения: 26.08.2013).
16
2.Барычева Л.Ю., Эрдни-Горяева Н.Э., Голубева М.В. Экспрессия маркеров апоптоза при сахарном диабете I типа у детей // Медицинский вестник
Северного Кавказа. 2013. №3. С. 86-88.
3.Барычева Л.Ю. Эрдни-Горяева Н.Э. Функциональная активность
нейтрофилов при сахарном диабете I типа у детей // Фундаментальные исследования. 2013. №9 (ч.4). С.582-585.
4.Эрдни-Горяева Н.Э. Апоптоз нейтрофилов у детей с сахарным диабетом I типа // XX итоговая научная конференция студентов и молодых ученых
с международным участием (тезисы докладов). Ставрополь, 2012. C.32.
5.Эрдни-Горяева Н.Э. Особенности клинического течения сахарного
диабета I типа у детей Ставропольского края // XX итоговая научная конференция студентов и молодых ученых с международным участием (тезисы докладов) . Ставрополь, 2012. C.33.
6.Эрдни-Горяева Н.Э, Барычева. Л.Ю. Некоторые иммунопатогенетические особенности сахарного диабета I типа у детей // Материалы краевой
научно-практической конференции педиатров и неонатологов «Актуальные
вопросы педиатрии и неонатологии». СтГМА. Ставрополь, 2012. С. 125-129.
7.Барычева Л.Ю., Эрдни-Горяева Н.Э., Голубева М.В. Показатели
апоптотической активности нейтрофильных гранулоцитов у детей с сахарным диабетом I типа // Материалы ХI конгресса детских инфекционистов
России. Москва, 2012. C.8.
8.Эрдни-Горяева Н.Э., Александрович Г.А., Мосиянц В.Г. Клиническая
характеристика сахарного диабета I типа у детей Ставропольского края //
Материалы ХI конгресса детских инфекционистов России. Москва, 2012.
C.96.
9.Эрдни-Горяева Н.Э., Барычева Л.Ю., Мосиянц В.Г. Некоторые особенности сахарного диабета I типа у детей Ставропольского края // Сборник
материалов XVII Съезда педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии». Москва, 2013. C.771.
10.Барычева Л.Ю., Эрдни-Горяева Н.Э., Голубева М.В. Апоптоз
нейтрофилов периферической крови у детей с сахарным диабетом I типа //
Сборник материалов XVII Съезда педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» . Москва, 2013.C.39.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДР – диабетическая ретинопатия
ИС – индекс стимуляции
ЛКБ – лизосомальные катионные белки
МП – миелопероксидаза
НГ – нейтрофильные гранулоциты
НСТ – тест восстановления нитросинего тетразолия
ПМЯЛ – полиморфноядерные лейкоциты
СД1 – сахарный диабет 1 типа
СК – Ставропольский край
17
Bcl2 – противоапоптотический белковый фактор
CD95 (Fas/Apo-1) – рецептор, способный инициировать апоптоз
CD95L (FasL) – лиганд CD95
18