На правах рукописи ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОЛЛИНОЗА И ЛАТЕНТНОЙ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ
реклама
На правах рукописи ОРШАНКО АЛЛА МИХАЙЛОВНА ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОЛЛИНОЗА И ЛАТЕНТНОЙ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ 14.00.36 – АЛЛЕРГОЛОГИЯ И ИММУНОЛОГИЯ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2009 1 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Научный руководитель: доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН Порядин Геннадий Васильевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Балякин Юрий Викторович доктор биологических наук, профессор Бержец Валентина Михайловна Ведущая организация: НИЦ «Институт иммунологии» ФМБА России Защита состоится «21» декабря 2009 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1 Автореферат разослан «24» октября 2009 года Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова 2 Общая характеристика диссертации Актуальность проблемы Согласно результатам многочисленных популяционно-статистических исследований, распространенность аллергических заболеваний в течение последних 30 лет повсеместно удваивается каждые десять лет [Лусс Л.В., 2004; Дыбунова Е.Л., 2008]. Атопия является наиболее распространенной формой гиперчувствительности немедленного типа. Поллиноз, которым страдают 5 30% населения планеты, является типичным представителем группы атопических заболеваний [Zeller S., et al., 1993; Palma-Carlos A.G., 1995]. Такая патология имеет четко выраженную сезонность, связанную с наступлением периода цветения растений. Возникновение поллиноза обусловлено взаимодействием экзогенных и эндогенных провоцирующих факторов, особое место среди которых занимает наследственная предрасположенность, климато-географические особенности региона, степень аллергенности растений [Балаболкин И.И., 1996; Жерносек В.Ф., с соавт. 1999; Дыбунова Е.Л., 2008]. Необходимость изучения этого состояния обусловлена тем, что поллиноз, представляя из себя самостоятельное заболевание, одновременно является предболезнью для более тяжелой патологии, в частности для бронхиальной астмы [Адо А.Д., 1978; Лусс Л.В., 2004; Gonzleaz Diaz S.N., et al., 2002; Koh Y.Y., et. al., 2003]. Несмотря на многочисленные клинико – экспериментальные исследования, не все аспекты патогенеза поллиноза изучены. В настоящее время опубликовано большое число работ, посвященных изучению общего уровня Т-лимфоцитов (CD3) и хелперно-индукторных клеток (Th) в обострение и ремиссию, цитокиновому профилю, особенностям клеточного состава слизистой оболочки носа при поллинозе в различные стадии заболевания. Однако, развернутых исследований популяционно-субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови в обострение и ремиссию поллиноза до сих пор не проведено, не смотря на то, что данные о наличии отклонений в 3 иммунном статусе больных поллинозом в ремиссии появились достаточно давно [Majori M., at. all., 1997]. На сегодняшний день остается не изученным содержание в периферической крови при поллинозе цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8), нет данных о субпопуляционном составе естественных киллеров (NK-клеток). Практически отсутствуют сведения об относительном содержании в периферической крови В-лимфоцитов и степени их дифференцировки. Активационный процесс описывается в большом числе публикаций, уже многое известно об экспрессии основных активационных антигенов в обострение и ремиссию поллиноза. Сформирована концепция о нарушении индукции активационного апоптоза при атопических заболеваниях [Порядин Г.В., 2008]. Тем не менее, в доступной литературе нет сведений об уровне экспрессии лимфоцитами периферической крови рецептора для входа в активационный апоптоз (Fas-антигена) в различные стадии заболевания. Одним из наиболее эффективных методов оценки состояния иммунной системы является использование моноклональных антител для определения поверхностного фенотипа лимфоцитов. С помощью этого метода можно получить представление о количественном составе лимфоцитов и характере активационных процессов. Латентная сенсибилизация - это состояние, предшествующее клинически выраженной аллергии [Феденко Е.С., 2001]. В настоящее время проблема латентной сенсибилизации находится в стадии изучения. Получены эпидемиологические данные о проценте перехода состояния латентной сенсибилизации в клинически выраженную аллергию [Horak F., 1985; Bodtger U., 2004]. Есть сведения об особенности экспрессии хемокиновых рецепторов на лимфоцитах, о дегрануляционной способности тучных клеток и базофилов у лиц, с выявленной латентной сенсибилизацией [Assing K., et al., 2006; Jensen B.M., et al., 2006; Holse M., et al., 2006]. Однако, все еще отсутствуют надежные иммунологические критерии диагностики латентной сенсибилизации. 4 Исходя из описанного выше, сформированы следующие цели и задачи для исследования. Цель исследования Идентификация иммунологических критериев, коррелирующих с клинической картиной поллиноза, и являющихся перспективными для лабораторной диагностики латентной сенсибилизации. Задачи исследования 1. Изучить популяционный и субпопуляционный состав Т, Влимфоцитов и NK-клеток в стадиях обострения и ремиссии поллиноза. 2. Уточнить обострения и особенности ремиссии активационных поллиноза на процессов основе в анализа стадиях структуры фенотипического состава общей популяции лимфоцитов. 3. Идентифицировать маркеры лимфоцитов, достоверно отражающих клиническое течение (переход ремиссии в обострение) поллиноза. 4. Провести сравнительное исследование фенотипических особенностей иммунокомпетентных клеток здоровых субъектов и лиц с латентной сенсибилизацией. 5. Идентифицировать иммунологические критерии, перспективные для лабораторной диагностики латентной сенсибилизации. 6. Выработать алгоритм лабораторной диагностики для выявления латентной сенсибилизации у лиц, составляющих группу риска для атопических заболеваний. Научная новизна Впервые проведено сравнительное фенотипическое исследование лимфоцитов больных поллинозом в стадии обострения и ремиссии с использованием широкого спектра показателей Т-, В-клеточного иммунитета и NK-клеток. Впервые дана иммунологическая характеристика активационного 5 процесса лимфоцитов и выявлены особенности Fas-зависимого апоптоза в зависимости от стадии поллиноза. Впервые описан фенотипический состав лимфоцитов у пациентов с латентной сенсибилизацией. Предложены диагностические лабораторные критерии для выявления этого состояния в группах риска. Практическая значимость Полученные результаты работы существенно дополняют представление об иммунопатологических механизмах развития поллиноза и латентной сенсибилизации. Выявление основных иммунологических отклонений, характерных для латентной сенсибилизации, дало возможность сформировать критерии ее лабораторной диагностики. Предложенный алгоритм исследования позволил выделить в группе больных поллинозом лих, имеющих иммунологические признаки «неполноценной» ремиссии, указывающие на формирование латентной сенсибилизации к новым аллергенам. С целью предотвращения расширения спектра чувствительности таким больным рекомендовано проведение профилактических курсов иммунокоррегирующей терапии в зимнее время года. Реализация результатов исследования Результаты иммунопатологии исследования взрослых и внедрены интенсивной в работу терапии в отделения НИЦ «Института иммунологии» ФМБА России и в научно-педагогический процесс на кафедре патологической физиологии ГОУ ВПО РГМУ. Апробация диссертации Основные результаты работы доложены на Европейском конгрессе по астме (Москва, 2001); 5-ом конгрессе по Современным проблемам аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии, РААКИ (Москва, 2002). 6 Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 99 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 16 рисунками. Указатель литературы включает 154 (из них 73 отечественных, 81 зарубежных). Положения, выносимые на защиту 1. Состояние латентной сенсибилизации ассоциируется с увеличением процентного содержания в периферической крови лимфоцитов с CD54+- и CD95+-антигенами; определение уровня экспрессии этих маркеров на лимфоцитах является целесообразным для лабораторной диагностики данного состояния. 2. Поллиноз характеризуется выраженными изменениями популяционносубпопуляционного состава лимфоцитов и параметров активационного процесса как в стадию обострения, так и в ремиссию. Список работ, опубликованных по теме диссертации По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, 2 из которых - в рецензируемых научных изданиях ВАК. СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Материал и методы Объектом исследования в данной работе были лимфоциты периферической крови больных поллинозом и пациентов с латентной сенсибилизацией. Больные поллинозом в стадии ремиссии и пациенты с латентной сенсибилизацией отбирались специалистами отделения иммунопатологии взрослых ГНЦ «Института Иммунологии» ФМБА России (заведующий – 7 профессор, д.м.н. Латышева Т.В.); больные в обострение поллиноза сотрудниками кафедры патофизиологии РГМУ (заведующий кафедрой – профессор, д.м.н. Порядин Г.В). В настоящее исследование были включены 42 больных с поллинозом: 17 в обострении, 25 в ремиссии, в возрасте от 17 до 45 лет. 20 больных составляли женщины, 22 – мужчины. Продолжительность заболевания у разных лиц варьировала от 2 до 20 лет. Все пациенты имели диагноз «поллиноз», подтвержденный кожными тестами и/или наличием аллергенспецифических IgE в крови, а также прошли стандартный курс клинического, лабораторного и инструментального обследования (общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови, исследование на ВИЧ, НВS-Ag, HCV-Ab). В аллергологическом анамнезе в обследованной группе чаще всего встречалась сочетанная сенсибилизация к пыльце деревьев и смеси сорных трав - 16 человек (38,0%). Сенсибилизация к пыльце деревьев была у 14 больных (33,4%), повышение чувствительности одновременно к пыльце деревьев, злаков и смеси сорных трав отмечалось у 6 больных (14,3%), у такого же числа пациентов имелась сенсибилизация к сорным травам. С диагнозом «латентная сенсибилизация» было 15 пациентов в возрасте от 14 до 47 лет, из них 7 мужчин и 8 женщин. Все пациенты с латентной сенсибилизацией отобраны из числа больных, проходивших обследование и лечение по поводу различных аллергических и хронических инфекционноаллергических заболеваний. Заключение о наличии латентной сенсибилизации основывалось на положительных результатах кожных скарификационных проб. Их назначали для уточнения (самостоятельных причин или имевших место сопровождавших аллергических хронические реакций заболевания), послуживших мотивом для обращения за лечебной помощью. У всех 15 отобранных для исследований больных кожные тесты выявили наличие латентной сенсибилизации к пыльцевым аллергенам, тогда как ни один из этих 8 пациентов не отмечал наличия (ни в настоящем, ни в прошлом) каких-либо аллергических реакций (в виде конъюнктивита, ринита, крапивницы или бронхоспастических реакций) в ситуациях вероятного контакта с этими аллергенами. Группу контроля составили 26 практически здоровых добровольцев из числа студентов РГМУ в возрасте от 18 до 35 лет (16 женщин и 10 мужчин), которые по всем антропометрическим показателям соответствовали двум предыдущим группам больных. В момент сдачи крови на анализ все лица из группы контроля были здоровы и не имели аллергических реакций в анамнезе. При исследовании иммунного статуса применяли методы иммунофенотипирования мембранных антигенов лимфоцитов периферической крови с использованием моноклональных «МедБиоСпектр» (Россия). При антител производства НПЦ количественной оценке субпопуляций лимфоцитов использовали идентификационные маркеры Т-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8), NK-клеток (СD16, CD56), В-лимфоцитов (CD20, CD72, мембраносвязанные IgM, IgG). Активационные процессы в иммунной системе изучали путем количественной оценки лимфоцитов, несущих следующие антигены: CD25, CD71, HLA-DR, CD95, CD54, CD23. С помощью флюоресцентной микроскопии в выделенной из проб крови фракции лимфоцитов определяли абсолютное и относительное число клеток, позитивных в отношении указанных маркеров. Сравнивали перечисленные иммунологические показатели, рассчитанные у пациентов в стадии обострения поллиноза и ремиссии; в стадии ремиссии поллиноза и в группе здоровых лиц; среди пациентов с латентной сенсибилизацией и здоровыми лицами. При статистическом анализе полученных данных для оценки различий между средними значениями количественных показателей использовали параметрический критерий Стьюдента (t-тест). Различия расценивали как достоверные при критических 9 значениях t, соответствовавших 95% доверительному интервалу (р 0,05). Для облегчения компьютерных расчетов применяли программу «Биостат». Результаты исследования Особенности Т, В и NK-клеточного звеньев иммунной системы являются объектом изучения исследователей в связи с обязательным участием этих видов лимфоцитов в развитии аллергической реакции. Обострение аллергического воспаления, в свою очередь, изменяет показатели клеточного иммунитета. Состояние латентной сенсибилизации, судя по процентному содержанию субпопуляций лимфоцитов с изучавшимися идентификационными CD- антигенами, ассоциируется с тенденцией к понижению относительного числа Т-лимфоцитов и NK-клеток при отсутствии изменений доли В-лимфоцитов. Так, если в контроле (группа здоровых добровольцев) количество CD3+клеток составило в среднем 66,71,0% , то у лиц с латентной сенсибилизацией оно оказывалось заметно ниже - 49,93,4% (р<0,05). Причем, падение общей численности Т-лимфоцитов отмечалось у 60,7% обследованных. Содержание NK-клеток (CD16+) при латентной сенсибилизацией в среднем не превышало 7,01,5%, тогда как у здоровых лиц оно было выше 12,80,7% (р<0,05). Процент В-лимфоцитов (CD20+) составил 10,0+0,4 в группе контроля и 10,0+1,7% у лиц с латентной сенсибилизацией. 10 Обследуемые лица: Пациенты с рино-, бронхо-, пульмональными или проявлениями аллергических реакций в периоде ремиссии кожными Определение % лимфоцитов с CD54+ ≤ 9,3% Определение % лимфоцитов с CD95+ > 9,3% > 7,0% Подтверждение вероятности латентной сенсибилизации сен Латентная ≤ 7,0% Исключение вероятности латентной сенсибилизации сенсибилизация характеризуется увеличением Рисунок 1. Алгоритм исследования активационных маркеров лимфоцитов для процентного подтверждения/исключения латентной сенсибилизации содержания лимфоцитов с CD54+- и CD95+антигенами, 11 определение этих маркеров является Характер изменений субпопуляций иммунокомпетентных клеток с тестированными активационными CD-антигенами указывает на ускорение дифференцировки и функциональной активности В-лимфоцитов (возрастание процента клеток с CD54+, CD23+-антигенами) с одновременным ускорением элиминации активированных иммунокомпетентных клеток (увеличение частоты экспрессии CD95+). Процент CD54+-клеток составил 20,3+2,3 против 5,5+0,6% в контроле, р<0,05; CD23+-клеток 14,5+0,7 против 5,3+0,4% в контроле, р<0,05; процент CD95+ был 11,6+2,9 против 4,7+0,3% в контрольной группе, р<0,05. Можно предположить, что повышение апоптоза активированных лимфоцитов является одним из механизмов, предотвращающих появление клинических симптомов аллергии в условиях иммунологической перестройки, отражающей формирование сенсибилизации к аллергенам. Иммунологическими признаками латентной сенсибилизации является аномальное (больше максимального нормативного значения) возрастание иммунокомпетентных клеток с CD54+ и/или CD95+-антигенами. У всех (т.е. у 100%) лиц с латентной сенсибилизацией, подтвержденной по результатам кожных проб, обнаруживаются именно такие изменения распределения лимфоцитов с указанными маркерами. Из этого следует, что для надежного подтверждения/исключения вероятности латентной сенсибилизации у обследуемых пациентов следует определять процент содержание лимфоцитов именно с CD54+-антигеном, а при отсутствии изменений со стороны этой субпопуляции, целесообразно уточнить процент клеток с CD95 +-антигеном (рис. 1). Подтверждение иммунологических или признаков исключение наличия указанных латентной сенсибилизации выше позволяет охарактеризовать наблюдаемую клиническую ремиссию (диагностированного в прошлом того или иного аллергического заболевания) как, соответственно, «неполноценную» характеризующаяся или «полноценную». наличием «Неполноценная» иммунологических 12 признаков ремиссия, латентной сенсибилизации, требует уточнения (с помощью кожных проб с расширенным набором диагностических антигенов) конкретного аллергена, вызывающего описываемые иммунологические изменения. Кроме того, всех лиц с «неполноценной» (по выделенным нами иммунологическим критериям) ремиссией установленного в прошлом аллергического заболевания следует рассматривать как первоочередных кандидатов для проведения курсов профилактической терапии, направленной на укрепление Т-супрессорного звена иммунитета. Последнее заключение аргументируется тем, что латентная сенсибилизация к тем или иным аллергенам со временем переходит в клинически манифестную форму, т.е. сопровождается расширением спектра аллергенов, контакт с которыми сопровождается развитием клинических проявлений, типичных для атопических заболеваний, что означает явное усугубление аллергического статуса пациента [Horak F., 1985]. Изучение распределения субпопуляций иммунокомпетентных клеток с идентификационными CD-маркерами периферической крови больных поллинозом в обострении выявило тенденцию к увеличению относительной численности популяций Т- и В-лимфоцитов и отсутствие сезонных колебаний уровня NK-клеток по сравнению с аналогичными показателями в стадии ремиссии, которые в данном случае выступали в качестве контрольных параметров. Также выявлены изменения в субпопуляционном составе Тлимфоцитов в обострение: достоверно снижался уровень цитотоксических CD8+Т-лимфоцитов, тогда как численность CD4+Т-хелперных клеток не менялась (табл. 1). Так, доля CD3+Т-лимфоцитов в обострение составила 66,7+1,0%, в ремиссию - 46,9+1,9%, цитотоксических CD8+Т-лимфоцитов 19,3+1,5% в обострение, 26,5+2,2% в ремиссию (p<0,05). Интересная закономерность была выявлена при анализе относительного содержания цитотоксических Тлимфоцитов в зависимости от длительности обострения. Уровень CD8+-клеток в начале обострения составил 22,2+1,5%, в середине - 20,7+1,7% и 13 Таблица 1. Характеристика количественного состава основных субпопуляций лимфоцитов у больных поллинозом в стадию обострения Пациенты с поллинозом в Маркеры лимфоцитов (идентификационные антигены) стадии ремиссия Т CD4+ CD8+ CD16+ NK CD56+ CD20+ CD72+ B IGM IGG в стадии обострения (контроль) Доля лимфоцитов с Доля лимфоцитов с определявшимся определявшимся маркером маркером М+m,% (min – max, %) CD3+ Пациенты с поллинозом 46,9+1,9 (34,4 – 67,2) 30,3+2,2 (15,4 – 44,3) 26,5+2,2 (13,2 – 39,5) 10,7+1,3 (3,7 – 19,9) 8,4±1,5 (1,9 – 17,0) 13,11,5 (4,4 – 21,5) 7,71,2 (2,7 – 18,0) 7,51,2 (2,5+18,7) 8,00,9 (1,5 – 14,9) Примечание: *-p<0,05. 14 М+m,% 57,3+2,3 30,8±1,4 19,3+1,5* 10,3+2,3 6,8+1,0 16,21,1 12,00,6* 11,51,4 11,62,3 17,5+2,5% в конце, то есть увеличение срока обострения сопровождалось падением численности CD8+-лимфоцитов. Известно, что обострение поллиноза характеризуется преобладанием ответа Th2-клеток [Порядин Г.В., 2008; Pitsch T., et al., 2003]. Цитокины, синтезирующиеся хелперами второго порядка, по всей видимости, приводят к угнетению дифференцировки цитотоксических CD8+-лимфоцитов, и, следовательно, к снижению численности CD8+-клеток в периферической крови. Относительное содержание CD4+Т-хелперных клеток не менялось и равнялось 30,3+2,2 в ремиссии, 30,8±1,4% в обострении. Вероятно, отсутствие колебаний доли Т-хелперных клеток связано с усиленной миграцией Тхелперных лимфоцитов в слизистые оболочки конъюнктивы и верхних дыхательных путей. Это предположение подтверждается серией работ зарубежных авторов, выполненных на биоптатах слизистой оболочки носа больных поллинозом [Majori M., et al. 2001; Plevako H. et al., 2004; Brown J.L., et al., 2007]. В ходе этих исследований было обнаружено значительное накопление в слизистой носа активированных форм Т-лимфоцитов (CD3+4+). Численность различных субпопуляций NK-клеток у больных поллинозом неподвержена сезонным изменениям и их доля не менялась в зависимости от стадии заболевания (табл. 1). Общее процентное содержание CD20+В-лимфоцитов и В-лимфоцитов, находящихся на различных этапах дифференцировки (CD72+, IgM+, IgG+) при обострении поллиноза имело тенденцию к повышению (табл. 1). Рост процента премированных антигеном В-лимфоцитов (CD72+) носил достоверный характер - 7,71,2 в ремиссию против 12,00,6% в обострение (p<0,05). По литературным данным увеличение численности В-лимфоцитов напрямую коррелирует с увеличением концентрации общего и аллергенспецифических титров IgE и появлением клинической симптоматики поллиноза [Ohashi Y., et al., 1998]. Среднее значение функциональных активационных антигенов в период обострения поллиноза составило CD54 - 19,51,4%, CD23 - 13,13,3%, значение 15 аналогичных маркеров в контроле было 12,6+1,8 и 6,1±0,7%, соответственно, (p<0,05). Относительное содержание дифференцировочных активационных антигенов CD25, CD71 и HLA-DR в обострении было равно 10,51,3, 14,51,5, 16,41,1 против 5,4+0,4, 6,2+0,5, 11,7+1,0% в контроле (p<0,05). Рисунок 2. Характеристика динамики экспрессии активационных антигенов у больных поллинозом в стадию обострения. В ходе исследования было выявлено, что для периода обострения поллиноза характерны однонаправленные изменения экспрессии «ранних» CD25 и CD71 активационных антигенов. Так, в начале обострения их уровень резко повышался, а затем он постепенно снижался. Понижение экспрессии CD25 и CD71-антегенов сопровождалось возрастанием доли зрелых HLA-DR+клеток (рис. 2). Мы считаем, что эти изменения могут свидетельствовать об усилении темпов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов в период сезона пыления и накоплении зрелых иммунокомпетентных клеток по мере увеличения длительности обострения поллиноза. 16 Единственный активационный маркер, содержание которого не повышалось в период обострения поллиноза, был CD95. Напротив, была выявлена тенденция к снижению экспрессии данного антигена. Так, в ремиссию число клеток, несущих молекулу CD95, составило 9,0+0,9%, в обострение его содержание уменьшилось на треть, среднее значение равнялось 6,80,8%. Причем по мере увеличения длительности обострения происходило существенное падение процента CD95+-клеток - 8,6+0,9 в начале обострения и 3,1+0,5% в конце. Торможение экспрессии Fas-антигена на лимфоцитах, вероятно, связано с эффектами, вызываемыми IL-4. По данным Vella A., (1998) IL-4, секретируемый Th2-клетками, ингибирует мРНК Fas-антигена, индуцируя, таким образом, выживание активированных форм лимфоцитов [Vella A., et al., 1998]. Изучение доли активационных маркеров лимфоцитов в обострение поллиноза, выходившими за верхнюю или нижнюю границы нормативного интервала, рассчитанного в контрольной группе больных поллинозом в стадии ремиссии, выявило у всех обследованных больных аномально возросшее содержание CD71+-клеток. Полученные данные позволяют заключить, что CD-маркером обострения может считаться молекула CD71, экспрессия которой в исследуемой группе повышалась в 100% случаев. Соответственно, одним из ведущих механизмов перехода от состояния ремиссии к обострению, вероятно, является увеличение потребности пролиферирующих Т- и В-лимфоцитов в железе (Fe). Основываясь на результатах настоящего исследования можно констатировать, что поступление специфических аллергенов в организм больных поллинозом провоцировало усиленное образование иммунокомпетентных клеток на фоне снижения их элиминации. Активация клеточного иммунитета сопровождалась увеличением доли аллерген- специфичных клонов Т- и В-лимфоцитов, дисбалансом в субпопуляционном 17 составе Т-лимфоцитов, усилением активности Th2-клеток и снижением численности цитотоксических Т-лимфоцитов. Отсутствие клинических симптомов вне периода пыления создает картину полного благополучия у больных поллинозом. Однако, полученные в ходе исследования результаты, позволяют утверждать, что у пациентов в стадии ремиссии имеются существенные сдвиги иммунных показателей. Они выражаются снижением общей доли Т-лимфоцитов, увеличением уровня Влимфоцитов и относительного содержания отдельных субпопуляций NK-клеток по сравнению с группой контроля, которую составили здоровые лица. Так, общая доля Т-клеток, несущих CD3+-антиген резко снижена: 66,7+1,0% в контроле и 46,9+1,9% - больные в ремиссии поллиноза (р<0,05). Понижение содержания популяции Т-лимфоцитов наблюдалось у 61,9% больных. Также был выявлен существенный дисбаланс в субпопуляционном составе Т-лимфоцитов: падала численность CD4+Т-хелперных лимфоцитов (36,7+1,3% контроль, 30,3+2,2% поллиноз ремиссия, р<0,05) на фоне нормального содержания цитотоксических CD8+Т-лимфоцитов. Интересным, на наш взгляд, явился тот факт, что в самом начале ремиссии (продолжительностью от 1 до 3-х недель) все больные имели сниженное содержание (<min значения в контроле) цитотоксических Т-лимфоцитов (рис. 3). По всей видимости, это было следствием падения численности данной субпопуляции в обострение. Увеличение сроков ремиссии сопровождалось приростом CD8+-лимфоцитов, уровень которых аномально повышался в самом конце ремиссии перед началом сезона пыления. 18 Рисунок 3. Динамика изменения содержания CD8+-лимфоцитов у больных поллинозом. Таким образом, результаты настоящего исследования и имеющиеся литературные данные [Порядин Г.В., 2008; Pitsch T., et al., 2003] подтверждают концепцию о преобладанием существовании синтеза дисбаланса цитокинов Т-хелперных Th2-клетками, лимфоцитов особенно с ярко проявляющегося в период обострения поллиноза, в следствие чего происходит угнетение размножения цитотоксических клеток (CD8+). В свою очередь дефицит субпопуляции CD8+Т-лимфоцитов способствует снижению выработки INF-γ. По нашему мнению, это приводит к еще большему дисбалансу в структуре регуляторных клеток, провоцирует рост численности Т-хелперов второго порядка в период пыления. Известно, что продукция IgE находится под контролем супрессорных механизмов [Порядин Г.В., 2008]. Вероятно, нарушение баланса CD4+/CD8+ клеток с преобладанием субпопуляции Тхелперов и элиминацией цитотоксических Т-лимфоцитов (обладающих 19 супрессорной функцией) провоцирует растормаживание синтеза реагиновых антител. В ходе работы нами было выявлено значительное повышение численности CD56+-субпопуляции NK-клеток, составляющей 8,4±1,5% в период ремиссии поллиноза и 4,80,5% в контроле, р<0,05. Также увеличивался общий уровень CD20+В-лимфоцитов: 13,11,5% - поллиноз ремиссия, 10,0 + 0,4% контрольная группа, р<0,05. Причем аномально высокое содержание CD20+клетки было отмечено в 57,1% случаев. Доля премированных антигеном CD72+В-лимфоцитов, наоборот падала в ремиссию и составляла всего 7,71,2%, тогда как аналогичный показатель в контрольной группе равнялся 10,4 + 0,5%, р<0,05. Изучение активационных маркеров лимфоцитов у больных поллинозом в стадии ремиссии установило отсутствие иммунологического «покоя». Так, отмечалось резкое повышение содержание на иммунокомпетентных клетках молекулы межклеточной адгезии - CD54+ и рецептора для входа в активационный апоптоз - CD95+, содержание которых у больных составило 19,7+2,4, 9,0+0,8% против 5,50,6 и 4,70,3% в контроле, р<0,05. Остальные показатели оказались сопоставимы с контрольной группой. Изучение уровня экспрессии Fas-антигена на лимфоцитах в зависимости от длительности ремиссии обнаружило наличие существенных колебаний относительной численности CD95+-клеток. Так, уровень CD95+-лимфоцитов в начале клинически выраженной ремиссии (длительность до месяца) составлял 4,7+1,1% и не отличался от значения аналогичного показателя в контроле 4,7+0,3%. Резкий подъем доли CD95+-лимфоцитов приходился на осеннезимнее время года, среднее значение данного маркера равнялось 10,6+1,6%. В конце периода ремиссии (март - начало апреля) происходило незначительное снижение численности CD95+-клеток - 7,4+1,0%. Усиление экспрессии Fas-антигена на лимфоцитах совпадало со снижением доли Т-клеток (CD3+) в периферической крови. Так, уровень Т20 лимфоцитов в начале ремиссии был 55,6+4,5%, а в середине (осенне-зимнее время) составлял уже 46,9+2,3%. Таким образом, можно предположить, что усиление темпов активационного апоптоза в период ремиссии (на что указывает рост CD95+-клеток) способствует формированию глубокого Тклеточного иммунодефицита. Низкий уровень Т-лимфоцитов нивелируется в период обострения за счет активного размножения иммунокомпетентный клеток под действием специфических антигенов Изучение процента больных с отклонениями активационных антигенов больше max или меньше min нормативного значения, рассчитанного в группе здоровых лиц, выявило следующие отклонения: аномально повышалось Рисунок 4. Процент больных поллинозом в стадию ремиссии со значениями активационных маркеров зарегистрированного у здоровых лиц. 21 > max или < min уровня, содержание CD54+ и CD95+-антигенов, имевшее место в 50,0% и 47,8% случаев. Другие CD-маркеры составляли низкую степень корреляции с ремиссией поллиноза (r<0,3) (рис. 4). Выявление больных поллинозом в ремиссии, с повышенным содержанием (>max допустимого значения, имеющегося у здоровых доноров) CD54+ и CD95+-антигенов, является важным диагностическим этапом, так как указывает на наличие «неполноценной» ремиссии у данной категории больных. По нашим данным, каждый второй пациент с поллинозом вне периода обострения имеет иммунологические признаки латентной сенсибилизации (увеличение доли CD54+ и CD95+-клеток). По всей видимости, у таких лиц в отсутствие клинической симптоматики происходит постепенное расширение спектра чувствительности к аллергенам, что в конечном итоге может привести к утяжелению атопического статуса. Поэтому данная группа больных, по нашему мнению, должна находиться под особым наблюдением врачейаллергологов. Им необходимо проводить кожное тестирование с расширенным набором аллергенов для выявления сенсибилизации к новым антигенам и, в зависимости от полученных результатов, получать в зимнее время года профилактическое лечение иммуномодулирующими препаратами. ВЫВОДЫ 1. Фенотипический состав лимфоцитов при обострении поллиноза характеризуется выраженной активацией Т- и В-клеточного звена иммунитета и отсутствием изменений со стороны NK-клеток на фоне снижения темпов Fasзависимого апоптоза. Преобладание пролиферации иммунокомпетентных клеток над их элиминацией создает условия для формирования обострения поллиноза. 2. Понижение доли цитотоксических Т-лимфоцитов с увеличением длительности обострения и постепенное восстановление их численности в 22 ремиссию указывает на нарушение супрессии клеточного иммунного ответа, с одновременной активацией гуморального звена иммунитета. 3. Диагностическим CD-маркером обострения поллиноза является CD71+-антиген (рецептор для трансферрина), экспрессия которого возрастает у всех обследованных больных. 4. Иммунологическая проявляется: а) глубоким перестройка Т-клеточным в ремиссию поллиноза иммунодефицитом, вызванным элиминация Т-хелперных клеток (CD4+) вследствие активации Fas-зависимого апоптоза; б) увеличением общей доли В-лимфоцитов (CD20+), свидетельствующей о потенциальной готовности В-клеток к активации с последующей выработкой IgE; этот процесс сдерживается отсутствием поступления аллергенов в организм. 5. Фенотипический состав лимфоцитов при латентной сенсибилизации имеет особенности, отражающие напряженную конкуренцию процессов, направленных на: а) активацию В-системы иммунитета, о чем свидетельствует рост экспрессии CD23,CD54-молекул на лимфоцитах; б) ингибирование функций иммунокомпетентных клеток путем стимуляции их апоптоза, на что указывает увеличение доли CD95+-клеток. 6. Выявление иммунологических признаков латентной сенсибилизации указывает на расширение спектра чувствительности к аллергенам, способных в последующем провоцировать клинически манифестные реакции повышенной чувствительности. 7. Выявление повышенной экспрессией CD54+- и CD95+-антигенов в период ремиссии поллиноза отражает высокий риск расширения спектра чувствительности к аллергенам. 23 Практические рекомендации 1. Для надежного подтверждения/исключения вероятности латентной сенсибилизации у обследуемых пациентов с высоким риском аллергических реакций целесообразно определять процентное содержание лимфоцитов с CD54+- и CD95+-антигенами. 2. Обнаружение повышения экспрессии молекул CD95 и CD54 на лимфоцитах периферической крови у таких лиц является показанием для назначения иммунокоррегирующей терапии с целью снижения расширения спектра чувствительности к новым аллергенам. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Г.В. Порядин, А.М. Оршанко, А.Н. Казимирский, Ж.М. Салмаси. Т-, Вклеточная девиация у больных поллинозом и атопической бронхиальной астмой в стабильную стадию заболевания. // Тезисы докладов на Европейском конгрессе по астме. - 2001. - C.124. 2. Ж.М. Салмаси, Г.В. Порядин, А.М. Оршанко, А.Н. Казимирский. Экспрессия поверхностных антигенов лимфоцитами больных латентной сенсибилизацией. // Тезисы докладов на 5-ом конгрессе по «Современным проблемам аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», РААКИ. 2002. – С. - 116. 3. Г.В. Порядин, А.М. Оршанко, Ж.М. Салмаси, Т.В. Латышева, А.Н. Казимирский. Активационные процессы в лимфоцитах пациентов с латентной сенсибилизацией. // Патофизиология и экспериментальная терапия. – 2009. - №1. – С. 23-25. 4. Г.В. Порядин, Ю.В. Шарпань, А.М. Оршанко, Ж.М. Салмаси, А.Н. Казимирский, Т.В. Латышева. Особенности иммунного статуса у лиц с латентной сенсибилизацией. // Российский иммунологический журнал. – 2009. – Том 3. - № 12. – С. 177-183. 24
