МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ НЕЙТРОФИЛОВ

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ НЕЙТРОФИЛОВ ЖЕНЩИН ПОСЛЕ
ФЕМТОСЕКУНДНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ РАЗЛИЧНОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ
Абакумова Т.В., Светухин В.В., Генинг Т.П., Антонеева И.И., Арсланова Д.Р.,
Полуднякова Л.В., Генинг С.О., Долгов П.Г.
ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», г.Ульяновск, Россия
В настоящее время общепризнанным является положение, согласно которому,
основные направления, по которым возможно использование лазеров в онкологии – это
высокоэнергетическое излучение (разрушающий лазер, применяющийся для рассечения
тканей, гемостаза, испарения патологических образований), фотодинамическая терапия
опухолей
различных
локализаций.
Анализ
данных
литературы
[1,4,10]
позволяет
сформулировать такие положительные качества использование лазеров в хирургии таких,
как высокая точность манипуляции, позволяющая избежать повреждения соседних структур,
быстрое и бескровное проведение хирургических вмешательств, минимальная реакция
окружающих тканей на лазерное воздействие, отсутствие интенсивной воспалительной
реакции в краевой зоне операционной раны, что способствует процессам быстрой и
полноценной регенерации, предупреждению грубой рубцовой деформации. И, наконец,
абластичность лазерного излучения (ЛИ) предупреждает диссеменацию опухолевых клеток,
обладающих инвазивным ростом, что особенно важно при лечении рака начальных стадий.
Все это позволило этому методу успешно конкурировать с традиционными оперативными
вмешательствами, лучевой терапией у тяжелых соматических больных при минимальных
патологических изменениях. Рак шейки матки (РШМ) занимает в мире первое место среди
всех злокачественных новообразований женских половых органов [11]. Неуклонный рост
запущенности РШМ, а также отмеченный рост заболеваемости среди женщин молодого
возраста
диктуют
необходимость
разработки
новых
и
совершенствование
уже
существующих методов комбинированного и комплексного лечения. Используются три
основных метода лечения: хирургический, комбинированный и сочетанная лучевая терапия.
Стремление к улучшению отдаленных результатов радикальной гистерэктомии привело к
идее после- и предоперационного облучения, что предоставляет возможность использование
высокого лазерного излучения.
На сегодня установлено угнетение иммунной компетентности РШМ в зависимости от
стадии опухолевого процесса. В связи с этим представляет определенный интерес изучение
влияния высокоинтенсивного ЛИ на иммунологическую реактивность организма. Выбор
нейтрофилов
в
качестве
клеток
мишеней
лазерного
облучения
обусловлен
их
полифункциональной ролью в поддержании защитной реакции организма, а также
потенциальной возможностью их активации при действии экзогенных физико-химических
факторов [4,7].
В настоящее время фемтосекундная лазерная физика – одно из приоритетных
направлений науки, которая может найти применение и в биомедицинских исследованиях.
Основными преимуществами данного типа лазеров является малая длительность импульса,
высокая пиковая и малая средняя мощности, вследствие чего возможно отсутствие
выраженных термических эффектов. Фемтосекундные лазеры – идеальный инструмент для
управления процессами в физических , химических и биологических системах, так как с
помощью коротких (10-15) оптических импульсов можно контролируемо возбуждать
молекулы и атомы и наблюдать происходящие процессы.
Однако в доступной отечественной и зарубежной литературе нами не обнаружено
исследований по оценке влияния фемтосекундного лазерного излучения (ФСЛИ) на Нф
человека.
На
основании
вышеизложенного
целью
исследования
было
изучение
цитоархитектоники и фагоцитарной активности нейтрофилов больных РШМ при ФСЛИ in
vitro
Материал и методы.
В исследовании
использованы Нф доноров, выделенные из венозной крови на
двойном слое фиколла/урографина (1,117 и 1,077 г/см3). Нф облучали в пластиковых
кюветах высотой 1 см на расстоянии 3 и 5 см от световода фемтосекундного лазера.
Был использован фемтосекундный волоконный эрбиевый лазер, который является
совместной уникальной разработкой Научного центра волоконной оптики РАН и
Ульяновского государственного университета с характеристиками: длительность импульса
— 100·10-13; частота следования импульсов — 200-250·10-13; средняя мощность — 1,25 мВт;
пиковая мощность — 6кВт; длина волны — 1,55 мкм.
Расчеты по плотности облучения фемтосекундным лазерным излучением.
Для расстояния 3 см (при диаметре пучка = 0,6 см) и 5 см (при диаметре пучка = 1 см)
и исходных энергетических характеристиках лазера плотность энергии на биоткань (Э)
рассчитывали по формуле [1]:
Э=W/S, где W — выходная энергия излучения, Дж; S — площадь лазерного пятна на
биоткани, см2.
Выходную
соотношения:
энергию
для
импульсно-периодического
режима
определяли
из
W=P·(tu/tu+tn)·t, где Р – выходная мощность излучения, Вт; t — время воздействия, с;
tu — длительность импульса, с; tn — длительность паузы, с.
Из приведенных зависимостей следует, что плотность потока энергии на биоткани
можно менять как за счет изменения мощности излучения, так и за счет изменения размера
лазерного пятна (расфокусировки).
Для определения фагоцитарной активности применяли стандартную методику с
использованием дрожжей. Вычисляли следующие показатели фагоцитоза: фагоцитарное
число (ФЧ) по Райту – среднее число захваченных одним
фагоцитом частиц, и
фагоцитарный индекс (ФИ) по Гамбургеру – процент фагоцитов, принимающих участие в
фагоцитозе к общему числу фагоцитов [8].
Для оценки топологии и ригидности мембраны нейтрофилов использован метод
сканирующей
зондовой
микроскопии
(SolverPro
NT-MDT,
г.Зеленоград,
Россия).
Использовались фирменные кремниевые зонды с жесткостью 0,2 N/m, радиус закругления
кончика зонда составлял примерно 50 nm. Нейтрофилы, фиксированные глутаровым
альдегидом, сканировались в полуконтактном режиме. Ригидность мембран оценивалась по
модулю Юнга, который рассчитывали согласно теории Герца [6].
Для выявления различий между данными, полученными в эксперименте и
контрольной группе применялся непараметрический U-критерий Манна-Уитни (Stata 6.0).
Статистически достоверными считались данные при р 0,05.
В результате проведенных исследований было установлено, что фагоцитарная
активность Нф практически здоровых женщин и больных РШМ на Ia стадии после ФСЛИ
изменялась волнообразно, однако статистически не значимо за исключением средней
интенсивности излучения 23,7 мДж/см2, при которой имело место значимое возрастание
фагоцитарного числа как у Нф доноров, так и у Нф больных РШМ (рис.1,2)
Рис.1. Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови практически
здоровых женщин, облученных ФСЛИ
Рис.2. Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови на начальных
стадиях рака шейки матки, облученных ФСЛИ
При оценке влияния ФСЛИ на Нф больных РШМ было установлено изменение
топографии и ригидности в зависимости от интенсивности излучения.
В литературе описано изменение Нф при воздействии НИЛИ, которое, по мнению
ряда авторов [3] позволяет выявить потенциальные возможности клеток. В результате
влияния НИЛИ показаны изменения в плазматической мембране, характеризующиеся в
увеличении микровыростов; гетерохроматин при этом диспергируется, эухроматин занимает
всю центральную часть ядра, т.е. проявляются черты, характерные для активации клеток. Со
стороны ядерных структур особых изменений не наблюдается. В цитоплазме отчетливо
заметна частичная дегрануляция азурофильных и специфических гранул. Часть таких гранул
концентрируется около плазмолеммы или небольших вакуолей. Митохондрии увеличены в
размерах. Доза непрерывного облучения равная 24,0 Дж/см2 вызывает в Нф деструкцию
плазматических мембран и митохондрий. Считается, что при этом происходит изменение в
липидных и белковых молекулах мембраны (повышение уровня фосфолипидов, снижение
уровня холестерина), и, как следствие, дозозависимое снижение вязкости мембраны.
На рис.3 представлены результаты сканирование препаратов интактных Нф больных
РШМ стадии Ia, фиксированных глутаровым альдегидом.
а
б
Рис.3. Интактные нейтрофилы больных РШМ стадии Ia
в
На рис.3а видны границы клетки, полиморфное сегментированное ядро и гранулы
цитоплазмы, которые выявляются и по боковому сечению клетки. При этом Нф имеют
строго округлую форму и клетка распластана по поверхности подложки. На последующих
рисунках представлены Нф больных РШМ на стадии Ia после ФСЛИ различной
интенсивности.
На рис. 4 (а,б) представлены нейтрофилы после ФСЛИ средней интенсивности 8,5
мДж/см2 и пиковой 40,3 кДж/см2. По сравнению с интактными клетки потеряли округлую
форму, граница клетки нечеткие, зернистость слабо выражена. Клетка набухшая и
цитоплазма равномерно распределена по всей клетке.
а
б
в
Рис.4. Нейтрофилы больных РШМ стадии Ia после ФСЛИ средней интенсивности 8,5
мДж/см2 и пиковой 40,3 кДж/см2.
На рис.5. представлены Нф после ФСЛИ в дозе 25,4 мДж/см2 – средняя, 125 кДж/см2 –
пиковая. Границы клетки размыты, сама клетка не имеет овальной формы; четко видимые
псевдоподии. Гранулы цитоплазмы не определяются даже по боковому сечению, клетка
распластана на подложке.
а
б
в
Рис.5. Нейтрофилы больных РШМ стадии Ia после ФСЛИ средней интенсивности 25,4
мДж/см2 и 125 кДж/см2 – пиковой.
На рис.6 представлены Нф после ФСЛИ в средней дозе 71,7 мДж/см2 и пиковая 339,1
кДж/см2.
а
б
в
Рис.6. Нейтрофилы больных РШМ стадии Ia после ФСЛИ средней интенсивности 71,7
мДж/см2 и 339,1 кДж/см2 – пиковой.
Границы клетки размыты, вблизи клетки наблюдаются отдельные гранулы, возможно
отшнурованные от основной цитоплазмы. На боковом сечении отмечены по периферии
клетки гранулы цитоплазмы.
При облучении Нф больных РШМ Ia стадии и ФСЛИ максимальной дозы (средняя
237мДж/см2 и пиковая – 887,4 кДж/см2) клетки сохраняют свою целостность (рис.7).
Рис.7. Нейтрофилы больных РШМ стадии Ia после ФСЛИ средней интенсивности
237мДж/см2 и 887,4 кДж/см2кДж/см2 – пиковой.
Однако границы клетки размыты, выражено сегментированное ядро и гранулы
цитоплазмы по периферии. Таким образом, при изучении топологии Нф больных РШМ на
стадии Ia после высокоинтенсивного ФСЛИ установлено, что даже высокие дозы
импульсного фемтосекундного излучения не приводят к деструкции клеточной мембраны.
Однако при этом не наблюдается выраженных псевдоподий, за исключением режима 25,4
мДж/см2
на
рис.2;
а
клетки
характеризуются
набуханием
и
невозможность
дифференцировать границы цитоплазмы и гранулы цитоплазмы даже в боковом сечении
профиля клетки. При оценке ригидности в Нф после ФСЛИ показано, что она у больных
РШМ стадии Ia до облучения значимо не отличается от ригидности Нф доноров (рис.8).
Рис.8. Изменение ригидности мембраны нейтрофильных гранулоцитов практически
здоровых женщин (контроль) и при раке шейки матки на стадии Ia, облученных ФСЛИ
Таким
образом,
полученные
данные
позволяют
предполагать,
что
морфофункциональное состояние больных РШМ на Ia стадии при воздействии ФСЛИ
достоверно отличаются от такого для Нф доноров, что может послужить основанием при
разработке методических рекомендаций по использованию ФСЛИ в данной группе больных.
Работа поддержана грантом ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России на 2009-2013гг.»
Список литературы.
1.
Ежов В.В., Торчинов А.М., Гейниц А.В., Фириченко В.И. //Лазерная
медицина. - 2008. - Т.12, вып.3. - С.15-17.
2.
Кувшинов Ю.П. //Мед.консилиум. – 2000. – Т.2, №3. – С.56-61.
3.
Медведев А.Н., Чаленко В.В. //Лаб. дело. – 1991.-№2 –C.19-20.
4.
Москвин С.В. Возможные пути повышения эффективности лазерной
терапии с позиций современных представлений о физиологических механизмах
действия низкоинтенсивного лазерного излучения // Матер. IV межд. конгр.
«Доказательная медицина – основа современного здравоохранения». – Хабаровск:
Изд. центр ИПКСЗ, 2005. – С.181-182.
5.
Плескова С.Н., Звонкова М.Б., Гущина Ю.Ю. // Морфология. - 2005. -
Т.127, №1. - С.60-62.
6.
Поддубный Б.К. //Современная онкология. – 2005. - №3. – С.122-125.
7.
Чудновский В.М. Биологические модели и физические механизмы
лазерной терапии / В.М.Чудновский, Г.М.Леонова, С.А.Скопинов – Владивосток,
2002. - 115с.
8.
Шейко Е.А., Шихлярова А.И., Белан Е.С. Фотохромотерапия как
фактор, модулирующий функциональный потенциал нейтрофилов крови больных
раком легких. //www.oncology.ru/events/2007/11/20/handout/13.pdf
9.
Henderson R.M., Oberleithner H. // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. – 2000.-
Vol.278(5). – Р.689-701.
10.
Strong M.S. //Laryngoscope. – 1975. – Vol.85(8). – P.1286-9.
11.
Weiderpass E. Hormonal risk factors of cancer in human point of cancer
epidemiologist //International conference. Hormonal cancerogenesis. – SPb. – 2000. – P.2223.